CN107353296B - 一种从东革阿里中提取活性蛋白和宽缨酮的方法 - Google Patents
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Abstract
一种从东革阿里中提取活性蛋白和宽缨酮的方法，包括以下步骤：（1）原料破碎，连续逆流提取，冷却，过滤，得提取液；（2）离心，超滤，加水赶洗，得超滤液；（3）纳滤，浓缩，得浓缩液a；（4）将浓缩液a加入醇溶液中，静置醇沉，离心，过滤，滤渣干燥，得东革阿里活性蛋白；滤液用活性炭脱色，离心，浓缩，得浓缩液b；（5）将浓缩液b上氧化铝柱层析，先水洗，再用有机溶剂分级洗脱，浓缩，得萃取浸膏；（6）将萃取浸膏溶解，进样至制备液相色谱，洗脱，收集目标洗脱液，浓缩，干燥，得高纯度宽缨酮产品。本发明方法所得水溶性蛋白和宽缨酮产品纯度和收率高；操作工艺简单，成本低，可实现连续化大规模生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种提取活性蛋白和宽缨酮的方法，具体涉及一种从东革阿里中提取活性蛋白和宽缨酮的方法。
背景技术
东革阿里为苦木科东革阿里属植物，别名马来西亚人参、乡土人参及天然伟哥等。东革阿里是生长在靠近赤道的原始热带雨林中潮湿砂质土壤里的一种灌木，主要分布在马来西亚、印度尼西亚等东南亚地区，成熟期一般5年以上。常以根入药，与燕窝、锡器一起并称马来西亚三大国宝。传统上，在马来西亚东革阿里常作为催情药、滋补药、退热药及中毒或蛇毒解药，具有显著的功效。现代医学研究证明，东革阿里提取物活性成分具有显著的药理作用，主要有以下功能：改善性功能：能促进人体自身分泌睾丸酮，最高可提高睾丸酮440%，从而弥补了人体随着年龄增长睾丸酮水平下降的问题；抗癌活性：研究发现宽缨酮能通过抑制肺癌细胞抑制素蛋白、膜连蛋白和内质网蛋白28这3种蛋白的表达从而达到抗癌效果；抗疟疾、抗氧化及抗风湿；提高人体免于能力，抗疲劳、抗抑郁；降血糖、治疗痛风、治疗骨质疏松等。
东革阿里的化学活性成分主要有萜类、生物碱、挥发油及其它，其中主要的一种活性成分为宽缨酮，其分子式：C20H24O9，分子量408.4，密度：1.63g/cm3，沸点：669.5℃，闪电：239.9℃，折射率：1.684，属于甾酮，其结构式如下：
。
东革阿里中还含有丰富的水溶性蛋白，含量约0.03～0.10%，此类水溶性蛋白具有显著的功效，能增强人体机能，提高人体免疫力。而有关文献对宽缨酮的提取报道较多，对此类水溶性蛋白的提取报道较少，在生产宽缨酮过程中，都是将这些水溶性蛋白当作废料排掉，不仅污染环境，也浪费资源。
而东革阿里中宽缨酮的提取方式主要有溶剂浸提、连续逆流提取、超临界流体辅助提取、超声波辅助提取、微波辅助提取等。溶剂浸提法是最广泛使用的一种方法，操作简单，设备投入小，但缺点是东革阿里中宽缨酮的提取率较低，提取杂质较多，不利于连续化生产；连续逆流提取具有连续化生产，提取率高的优点，但缺点是大部分只适合水为溶剂提取，不适用有机溶剂提取，而且温度控制稳定性差；而超临界流体、超声波或微波辅助提取的优点均是提取成本较低，提取率较高，但都存在设备前期投入较大，设备操作复杂的缺点。
目前，宽缨酮的纯化方法主要有溶剂萃取结晶法、柱层析法、膜分离、半仿生法及高速逆流色谱（HSCCC）等。其中，运用最广泛的是柱层析法，使用最多的是大孔吸附树脂分离纯化，树脂型号如HPD-100、AB-8等，但大孔树脂分离纯化操作繁琐，宽缨酮收率较低，纯化的程度有限。溶剂萃取结晶法操作简便，但存在产品收率低，有机溶剂使用量大，污染环境等问题。膜分离虽然操作简单，周期短，分离效果显著，但膜分离纯化提升幅度有限。硅胶柱层析及HSCCC虽然能获得高含量的宽缨酮产品，但硅胶柱层析工艺复杂，溶剂损耗大，而HSCCC设备一次性投入较大，回本周期长。
CN106366092A公开了一种从东革阿里中分离高纯度宽缨酮的工业制备方法，是将东革阿里浸泡于水中，加纤维素酶酶解，再加热浸提，冷却，离心脱脂，脱脂液超滤、纳滤，树脂纯化、真空浓缩，结晶、洗涤、重结晶，干燥。该纯化工艺虽能获得宽缨酮含量≥98.8%的产品。但是发明人研究发现，使用纤维素酶浸泡酶解过程中，有少量的宽缨酮会溶于水中，而且纤维素酶对宽缨酮也有一定程度的损耗。而使用大孔树脂纯化，所得宽缨酮粗提物颜色较深，用结晶纯化虽能去除大部分色素杂质，但不彻底，而且结晶一般收率小于70%。
CN106474167A公开了一种东革阿里提取物、宽缨酮及其制备方法和应用，是将东革阿里原料经水或醇提取，大孔吸附树脂纯化，有机溶剂萃取，硅胶柱色谱分离，重结晶，从而获得宽缨酮含量≥98%的产品。但是，该方法使用了大量的有机溶剂，对生产条件要求较高，对环境破坏较大。
CN103408564A公开了一种东革阿里植物中宽缨酮提取纯化工艺，是将东革阿里用水、甲醇或乙醇在60～80℃提取，后用有机溶剂石油醚和乙酸乙酯萃取，硅胶柱色谱分离，活性炭脱色，浓缩、结晶，洗涤干燥。该纯化工艺虽能获得宽缨酮含量≥98.6%的产品，但是，存在有机溶剂使用量大，损耗量大，工艺过程复杂，生产周期长，效率低，产品回收率较低，质量可控性差等技术缺陷。
CN105362315A公开了一种东革阿里提取物及其制备方法，是将东革阿里用水提取，提取液过大孔吸附树脂，树脂型号优选AB-8和HPD-450，先用水清洗，再用20～50%乙醇洗脱，收集相应乙醇洗脱液，浓缩、干燥。虽然东革阿里用水提成本低，操作简便，大孔吸附树脂的分离纯化也能在一定程度上纯化宽缨酮，但是，存在提取率低，吸附选择专一性差等问题，纯度提高程度有限。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种活性蛋白和宽缨酮产品纯度和收率高，产品质量稳定，操作工艺简单，提取时间短，能耗低，成本低，可实现连续大规模生产的从东革阿里中提取活性蛋白和宽缨酮的方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：
一种从东革阿里中提取活性蛋白和宽缨酮的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）破碎、提取：将东革阿里原料破碎，加水进行连续逆流提取，冷却，过滤，得提取液；
（2）离心、超滤：将步骤（1）所得提取液离心，离心液超滤，加水赶洗超滤膜上的滤渣至超滤膜透过液无色透明且无苦味为止，得超滤液；
（3）纳滤、浓缩：将步骤（2）所得超滤液纳滤，截留液真空浓缩，得浓缩液a；
（4）醇沉、脱色：将步骤（3）所得浓缩液a加入醇溶液中，静置醇沉，离心，过滤，所得滤渣低温真空干燥，粉碎过筛，得东革阿里活性蛋白；所得滤液用活性炭脱色，离心，离心液真空浓缩，得浓缩液b；
（5）氧化铝柱层析：将步骤（4）所得浓缩液b上氧化铝柱层析，然后先用水洗至水洗脱液无色，再用有机溶剂分级洗脱，将收集的洗脱液真空浓缩，得萃取浸膏；
（6）制备液相色谱纯化：将步骤（5）所得萃取浸膏用有机溶剂溶解，进样至制备液相色谱，洗脱剂洗脱，收集目标洗脱液，真空浓缩，真空干燥，得高纯度宽缨酮产品。
优选地，步骤（1）中，所述东革阿里原料取自东革阿里树根，活性蛋白的质量含量为0.03～0.10%，宽缨酮的质量含量为0.05～0.10%。
优选地，步骤（1）中，破碎至过20～40目筛的原料占总质量的90～95%。
优选地，步骤（1）中，所述水的用量为原料质量的8～30倍（更优选10～20倍），提取的温度为80～100℃（更优选90～95℃），提取的时间为2～4h。由于东革阿里中的水溶性蛋白和宽缨酮都易溶于热水，所以使用水作为提取溶剂，既节约成本，又安全环保。
优选地，步骤（1）中，所述过滤的目数为200～400目。优选用滤布袋进行过滤。
优选地，步骤（1）中，所述冷却为板式冷却。
优选地，步骤（2）中，所述离心的转速为10000～30000r/min。优选用管式离心机、卧式离心机或蝶式离心机中的一种或几种进行离心，通过离心可去除一些固体的细小杂质。
优选地，步骤（2）中，所述超滤的温度为10～30℃，压力为1.0～2.0MPa。超滤的目的是去除大分子悬浊物，使料液澄清透亮。
优选地，步骤（2）中，用于超滤的超滤膜为陶瓷膜或高分子材料有机超滤膜，所述陶瓷膜的孔径为0.3～0.5μm，所述高分子材料有机超滤膜的截留分子量为5000～10万道尔顿。
优选地，步骤（2）中，用于赶洗的水的用量是膜体积的3～5倍。
优选地，步骤（3）中，所述纳滤的温度为10～30℃，压力为2.0～4.0MPa。
优选地，步骤（3）中，所述纳滤先用截留分子量为5万～10万道尔顿的纳滤膜分离，取透过液，再用截留分子量为100～400道尔顿（更优选200～300道尔顿）的纳滤膜纳滤至截留液的固含量为8～30%（更优选10～15%）。先用分子量大的纳滤膜可分离去除大分子杂质，再用小分子量的纳滤膜可分离纯化去除小分子杂质。
通过超滤与纳滤相结合的技术，能够将东革阿里水提取物中宽缨酮的质量浓度从1～2%提升至5%以上，同时又能保留大部分东革阿里水溶蛋白，起到了辅助分离纯化的作用。
优选地，步骤（3）中，所述真空浓缩的温度为60～80℃，压力为-0.10～-0.06MPa，真空浓缩至固含量为65～75%。
优选地，步骤（4）中，所述浓缩液加入醇溶液中的速度为10～30kg/min。加入过程中进行搅拌。
优选地，步骤（4）中，所述静置醇沉的时间为2～4h。
优选地，步骤（4）中，所述醇溶液的用量为浓缩液质量的2～20倍（更优选10～15倍）。
优选地，步骤（4）中，所述醇溶液的体积浓度为80～95%，醇为甲醇和/或乙醇，更优选乙醇。
由于宽缨酮易溶于醇中，而水溶性蛋白不溶于醇，所以可以使用醇沉的方式分离提纯宽缨酮和水溶性蛋白，宽缨酮主要在上清液中，而醇沉渣主要为水溶性蛋白，相比用有机溶剂萃取纯化方式更加环保安全，效果显著，也更利于工业化。
优选地，步骤（4）中，醇沉后，用三足离心机进行离心；活性炭脱色后，先卧螺离心，再蝶式离心。
优选地，步骤（4）中，所述低温真空干燥的温度为30～60℃，压力为-0.10～-0.07MPa，干燥至含水率≤3%。
优选地，步骤（4）中，所述活性炭与滤液的质量比为1:5～12。本发明人研究发现，在氧化铝柱层析和制备液相色谱纯化前，将醇沉上清液在醇相中采用活性炭脱色，活性炭对色素的脱除效果良好，而且相较水相中对宽缨酮的损耗较少，如果在氧化铝柱层析和制备液相色谱纯化前不脱色处理，会导致所得产品的颜色较深，而且对制备色谱填料的污染较严重。
优选地，步骤（4）中，所述脱色的温度为40～80℃，时间为2～4h。
优选地，步骤（4）中，所述活性炭的目数为80～300目（更优选100～200目）。
优选地，步骤（4）中，所述真空浓缩的温度为50～70℃，压力为-0.10～-0.07MPa，浓缩至固含量为10～30%（更优选20～28%）。
优选地，步骤（5）中，所述分级洗脱是指：先用2.5～3.5BV体积分数15～25%的乙醇水溶液，以0.4～0.8BV/h的流速洗脱，弃掉洗脱液，再用1.5～2.5BV体积分数65～75%的乙醇水溶液，以0.8～1.2BV/h的流速洗脱，收集洗脱液。本发明人研究发现，使用氧化铝柱层析纯化相较大孔吸附树脂纯化，对宽缨酮的纯化效果更明显，主要由于氧化铝对甾酮类物质选择性更专一，而大孔吸附树脂的选择性更差，尤其会吸附大量色素，导致通过大孔吸附树脂纯化所得产品颜色通常很深，即使可以后续通过结晶及重结晶进一步纯化，但产品收率低，而且色泽不稳定，而使用氧化铝柱层析，则可以先通过低度乙醇洗脱极性较大的杂质，比如黄酮类色素，再通过高度醇洗脱宽缨酮，以避免上述问题。
优选地，步骤（5）中，所述氧化铝柱的装柱径高比为1:3～8。
优选地，步骤（5）中，所述氧化铝为酸性氧化铝或中性氧化铝，目数为80～300目。
优选地，步骤（5）中，使用前，先将氧化铝在110～600℃（更优选400～580℃）下，活化12～30h（更优选20～28h）后，再用体积分数85～99%的乙醇清洗至流出液无色透明，且除乙醇味外无其它气味为止，最后用水洗至无乙醇味。
优选地，步骤（5）中，所述真空浓缩的温度为50～80℃，压力为-0.10～-0.07MPa，浓缩至固含量为70～80%。真空浓缩的过程中可回收洗脱液中的有机溶剂。
优选地，步骤（6）中，所述制备液相色谱中色谱柱的填料为C-18键合硅胶，装柱径高比为1:3～8。所述制备液相色谱优选中低压色谱柱的制备液相色谱，使用制备液相色谱可进一步对宽缨酮进行分离纯化，较传统硅胶色谱纯化、结晶及重结晶纯化，制备液相色谱纯化的效果更好，操作简单，自动化程度更高，溶剂用量及损耗更小，更环保安全，产品回收率较高，更有利于高纯度产品工业化生产。
优选地，步骤（6）中，所述洗脱剂为乙腈-水，体积比为20～40:80～60。本发明人研究发现，以洗脱效果及洗脱收率为参考指标，使用乙腈-水为洗脱剂的效果最好，尤其体积比为20～40:80～60范围内洗脱收率最高。
优选地，步骤（6）中，所述洗脱的流速为0.10～1.00BV/h（更优选0.2～0.5BV/h），洗脱的次数≥1次。
优选地，步骤（6）中，萃取浸膏用有机溶剂溶解至质量浓度为38～80%（更优选40～55%）。
优选地，步骤（6）中，所述有机溶剂为甲醇和/或乙醇。
优选地，步骤（6）中，所述真空浓缩的温度为40～80℃，压力为-0.10～-0.07MPa，浓缩至固含量为40～60%。
优选地，步骤（6）中，所述真空干燥的温度为60～80℃，压力为-0.10～-0.07MPa，干燥至含水率≤3%。
本发明方法中优选用单效、双效或三效浓缩器进行真空浓缩。
本发明方法的有益效果如下：
（1）按照本发明方法所得水溶性蛋白产品为淡黄色粉末，经紫外检测，所得产品中蛋白质量含量≥53%，收率≥90%；所得宽缨酮产品为纯白色粉末，经高效液相色谱外标法检测，所得产品中宽缨酮的纯度≥98%，收率≥93%；
（2）本发明方法提取的溶剂为水，采用连续逆流的提取方法，相比提取罐提取的方式，不仅用水量小，提取时间缩短，而且能耗低，成本低，可实现连续大规模生产；
（3）本发明方法采用了超滤与纳滤相结合的技术，相比其它纯化方式，如大孔树脂吸附纯化，不仅分离纯化效果明显，产品质量稳定，而且操作工艺简单，生产成本低廉，能够实现连续化大规模工业生产；
（4）本发明方法采用醇沉、活性炭脱色、氧化铝柱层析及制备液相色谱分离纯化相结合的技术，实现了同时获得高纯度、高收率的水溶性蛋白和宽缨酮产品。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
本发明实施例所使用的东革阿里树根购于马来西亚，经紫外检测，活性蛋白的质量含量为0.05%，经高效液相色谱外标法检测，宽缨酮的质量含量为0.08%；本发明实施例所使用的0.3μm、0.5μm孔径的陶瓷膜，截留分子量为5万道尔顿的高分子材料有机超滤膜均购于江苏久安源环保科技有限公司；本发明实施例所使用的NF8040-300D、NF8040-5WD、NF8040-8WD、NF8040-10WD型号的高分子材有机纳滤膜，均购于江苏久吾高科技股份有限公司；本发明实施例所使用的中性氧化铝目数为200目，购于淄博硕创氧化铝有限公司；本发明实施例所使用的甲醇的密度为0.7918g/mL；本发明实施例所使用的C-18反向键合硅胶，购于赛默飞世尔科技公司；本发明实施例所使用的原料和化学试剂，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。
参考例1
使用前，先将中性氧化铝在550℃下，活化24h后，再用体积分数95%的乙醇清洗至流出液无色透明，且除乙醇味外无其它气味为止，最后用水洗至无乙醇味。
实施例1
（1）破碎、提取：将2t东革阿里树根破碎至过20目筛的原料占总质量的95%，加20t水，在90℃下，连续逆流提取2h，板式冷却，用200目滤布袋过滤，得提取液20t；
（2）离心、超滤：将步骤（1）所得20t提取液，在转速为15000r/min下，用管式离心机离心，得离心液19t，再用750L孔径0.3μm的陶瓷膜，在20℃，1.5MPa下，进行超滤，然后加3000L水赶洗超滤膜上的滤渣至超滤膜透过液无色透明且无苦味为止，得超滤液22t；
（3）纳滤、浓缩：将步骤（2）所得22t超滤液，在20℃，3MPa下，先用分子量为10万道尔顿的纳滤膜（膜型号NF8040-10WD）分离，取透过液，再用分子量为300道尔顿的纳滤膜（膜型号NF8040-300D），纳滤至截留液的固含量为10%，得纳滤液1.2t，最后用单效浓缩器，将纳滤液在60℃，-0.06MPa下，真空浓缩至固含量为68.2%，得浓缩液a 175.9kg；
（4）醇沉、脱色：将步骤（3）所得 175.9kg浓缩液a以20kg/min的速度加入盛有2t体积浓度为90%乙醇的醇沉罐中，加入过程中进行搅拌，静置醇沉4h，用三足离心机离心，过滤，滤渣在40℃，-0.07MPa下，低温真空干燥至水分≤2%，粉碎过筛，得东革阿里活性蛋白产品1.688kg；所得2036kg滤液中加入200kg的150目活性炭，在50℃下，脱色3h，然后先卧螺离心，再蝶式离心，离心液再用单效浓缩器，在60℃，-0.07MPa下，真空浓缩至固含量为25.3%，得浓缩液b 189.7kg；
（5）氧化铝柱层析：将步骤（4）所得189.7kg浓缩液b上氧化铝柱层析（使用参考例1活化后的中性氧化铝为填料，装柱径高比为1:3），先用纯水洗至水洗脱液无色，然后先用2.5BV体积分数25%的乙醇水溶液，以0.4BV/h的流速洗脱，弃掉洗脱液，再用2.5BV体积分数65%的乙醇水溶液，以1.2BV/h的流速洗脱，收集洗脱液，最后在50℃，-0.07MPa下，真空浓缩回收洗脱液中的乙醇至固含量为80%，得萃取浸膏25.5kg；
（6）制备液相色谱纯化：将步骤（5）所得25.5kg萃取浸膏用46.7L甲醇溶解（萃取浸膏的质量浓度为40.8%），进样至中低压色谱柱的制备液相色谱（色谱柱填料为C-18键合硅胶，装柱径高比为1:3）中，再用体积比40:60的乙腈-水，以流速0.2BV/h洗脱2次，并收集目标洗脱液，然后在50℃，-0.07MPa下，真空浓缩至固含量为50%，最后在60℃，-0.07MPa下，真空干燥至含水率≤2%，得1.54kg纯度宽缨酮产品。
本实施例所得水溶性蛋白产品为淡黄色粉末，经紫外检测，所得产品中活性蛋白的质量含量为53.6%，收率为90.5%；所得宽缨酮产品为纯白色，经高效液相色谱外标法检测，所得产品中宽缨酮的纯度为98.7%，收率为95.3%。
实施例2
（1）破碎、提取：将2t东革阿里树根破碎至过30目筛的原料占总质量的95%，加30t水，在95℃下，连续逆流提取3h，板式冷却，用300目滤布袋过滤，得提取液30t；
（2）离心、超滤：将步骤（1）所得30t提取液，在转速为20000r/min下，用管式离心机离心，得离心液28t，再用937.5L孔径0.5μm的陶瓷膜，在30℃，2.0MPa下，进行超滤，然后加3000L水赶洗超滤膜上的滤渣至超滤膜透过液无色透明且无苦味为止，得超滤液31t；
（3）纳滤、浓缩：将步骤（2）所得31t超滤液，在10℃，4MPa下，先用分子量为8万道尔顿的纳滤膜（膜型号NF8040-8WD）分离，取透过液，再用分子量为300道尔顿的纳滤膜（型号NF8040-300D），纳滤至截留液的固含量为12%，得纳滤液1.0t，最后用单效浓缩器，将纳滤液在70℃，-0.095MPa下，真空浓缩至固含量为71.5%，得浓缩液a 167.8kg；
（4）醇沉、脱色：将步骤（3）所得167.8kg浓缩液a以30kg/min的速度加入盛有2t体积浓度为95%乙醇的醇沉罐中，加入过程中进行搅拌，静置醇沉3h，用三足离心机离心，过滤，滤渣在60℃，-0.095MPa下，低温真空干燥至水分≤3%，粉碎过筛，得东革阿里活性蛋白产品1.642kg；所得2160.2kg滤液中加入400kg的200目活性炭，在60℃下，脱色2h，然后先卧螺离心，再蝶式离心，离心液再用三效浓缩器，在70℃，-0.095MPa下，真空浓缩至固含量为24.3%，得浓缩液b 197.5kg；
（5）氧化铝柱层析：将步骤（4）所得197.5kg浓缩液b上氧化铝柱层析（使用参考例1活化后的中性氧化铝为填料，装柱径高比为1:4），先用纯水洗至水洗脱液无色，然后先用3BV体积分数20%的乙醇水溶液，以0.5BV/h的流速洗脱，弃掉洗脱液，再用2BV体积分数70%的乙醇水溶液，以1.0BV/h的流速洗脱，收集洗脱液，最后在60℃，-0.09MPa下，真空浓缩回收洗脱液中的乙醇至固含量为75%，得萃取浸膏26.7kg；
（6）制备液相色谱纯化：将步骤（5）所得26.7kg萃取浸膏用50.5L甲醇溶解（萃取浸膏的质量浓度为40.0%），进样至中低压色谱柱的制备液相色谱（色谱柱填料为C-18键合硅胶，装柱径高比为1:4）中，再用体积比25:75的乙腈-水，以流速0.25BV/h洗脱2次，并收集目标洗脱液，然后在70℃，-0.09MPa下，真空浓缩至固含量为40%，最后在80℃，-0.095MPa下，真空干燥至含水率≤3%，得1.57kg高纯度宽缨酮产品。
本实施例所得水溶性蛋白产品为淡黄色粉末，经紫外检测，所得产品中活性蛋白的质量含量为56.1%，收率为92.1%；所得宽缨酮产品为纯白色，经高效液相色谱外标法检测，所得产品中宽缨酮的纯度为99.3%，收率为97.4%。
实施例3
（1）破碎、提取：将2t东革阿里树根破碎至过40目筛的原料占总质量的90%，加40t水，在95℃下，连续逆流提取2h，板式冷却，用400目滤布袋过滤，得提取液40t；
（2）离心、超滤：将步骤（1）所得40t提取液，在转速为30000r/min下，用管式离心机离心，得离心液38t，再用625L截留分子量为5万道尔顿的高分子材料有机超滤膜，在30℃，1.5MPa下，进行超滤，然后加3000L水赶洗超滤膜上的滤渣至超滤膜透过液无色透明且无苦味为止，得超滤液41t；
（3）纳滤、浓缩：将步骤（2）所得41t超滤液，在30℃，2MPa下，先用分子量为5万道尔顿的纳滤膜（型号NF8040-5WD）分离，取透过液，再用分子量为300道尔顿的纳滤膜（型号NF8040-300D），纳滤至截留液的固含量为11.4%，得纳滤液1.053t，最后用单效浓缩器，将纳滤液在80℃，-0.08MPa下，真空浓缩至固含量为73.6%，得浓缩液a 163.1kg；
（4）醇沉、脱色：将步骤（3）所得163.1kg浓缩液a以10kg/min的速度加入盛有2t体积浓度为85%乙醇的醇沉罐中，加入过程中进行搅拌，静置醇沉2h，用三足离心机离心，过滤，滤渣在50℃，-0.08MPa下，低温真空干燥至水分≤3%，粉碎过筛，得东革阿里活性蛋白产品1.658kg；所得1968.5kg滤液中加入200kg的100目活性炭，在70℃下，脱色4h，然后先卧螺离心，再蝶式离心，离心液再用单效浓缩器，在50℃，-0.08MPa下，真空浓缩至固含量为23.9%，得浓缩液b 200.8kg；
（5）氧化铝柱层析：将步骤（4）所得200.8kg浓缩液b上氧化铝柱层析（使用参考例1活化后的中性氧化铝为填料，装柱径高比为1:6），先用纯水洗至水洗脱液无色，然后先用3.5BV体积分数15%的乙醇水溶液，以0.6BV/h的流速洗脱，弃掉洗脱液，再用1.5BV体积分数75%的乙醇水溶液，以0.8BV/h的流速洗脱，收集洗脱液，最后在70℃，-0.08MPa下，真空浓缩回收洗脱液中的乙醇至固含量为80%，得萃取浸膏23.6kg；
（6）制备液相色谱纯化：将步骤（5）所得23.6kg萃取浸膏用33.3L甲醇溶解（萃取浸膏的质量浓度为47.2%），进样至中低压色谱柱的制备液相色谱（色谱柱填料为C-18键合硅胶，装柱径高比为1:6）中，再用体积比35:65的乙腈-水，以流速0.3BV/h洗脱2次，并收集目标洗脱液，然后在80℃，-0.08MPa下，真空浓缩至固含量为60%，最后在70℃，-0.08MPa下，真空干燥至含水率≤3%，得1.52kg高纯度宽缨酮产品。
本实施例所得水溶性蛋白产品为淡黄色粉末，经紫外检测，所得产品中活性蛋白的质量含量为55.2%，收率为91.5%；所得宽缨酮产品为纯白色，经高效液相色谱外标法检测，所得产品中宽缨酮的纯度为98.5%，收率为93.6%。
Claims (38)
1.一种从东革阿里中提取活性蛋白和宽缨酮的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）破碎、提取：将东革阿里原料破碎，加水进行连续逆流提取，冷却，过滤，得提取液；
（2）离心、超滤：将步骤（1）所得提取液离心，离心液超滤，加水赶洗超滤膜上的滤渣至超滤膜透过液无色透明且无苦味为止，得超滤液；
（3）纳滤、浓缩：将步骤（2）所得超滤液纳滤，截留液真空浓缩，得浓缩液a；
（4）醇沉、脱色：将步骤（3）所得浓缩液a加入醇溶液中，静置醇沉，离心，过滤，所得滤渣低温真空干燥，粉碎过筛，得东革阿里活性蛋白；所得滤液用活性炭脱色，离心，离心液真空浓缩，得浓缩液b；
（5）氧化铝柱层析：将步骤（4）所得浓缩液b上氧化铝柱层析，然后先用水洗至水洗脱液无色，再用有机溶剂分级洗脱，将收集的洗脱液真空浓缩，得萃取浸膏；
（6）制备液相色谱纯化：将步骤（5）所得萃取浸膏用有机溶剂溶解，进样至制备液相色谱，洗脱剂洗脱，收集目标洗脱液，真空浓缩，真空干燥，得高纯度宽缨酮产品。
2.根据权利要求1所述从东革阿里中提取活性蛋白和宽缨酮的方法，其特征在于：步骤（1）中，破碎至过20～40目筛的原料占总质量的90～95%；所述水的用量为原料质量的8～30倍，提取的温度为80～100℃，提取的时间为2～4h；所述过滤的目数为200～400目。
3.根据权利要求1或2所述从东革阿里中提取活性蛋白和宽缨酮的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述离心的转速为10000～30000r/min；所述超滤的温度为10～30℃，压力为1.0～2.0MPa；用于超滤的超滤膜为陶瓷膜或高分子材料有机超滤膜，所述陶瓷膜的孔径为0.3～0.5μm，所述高分子材料有机超滤膜的截留分子量为5000～10万道尔顿；用于赶洗的水的用量是膜体积的3～5倍。
4.根据权利要求1或2所述从东革阿里中提取活性蛋白和宽缨酮的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述纳滤的温度为10～30℃，压力为2.0～4.0MPa；所述纳滤先用截留分子量为5万～10万道尔顿的纳滤膜分离，取透过液，再用截留分子量为100～400道尔顿的纳滤膜纳滤至截留液的固含量为8～30%；所述真空浓缩的温度为60～80℃，压力为-0.10～-0.06MPa，真空浓缩至固含量为65～75%。
5.根据权利要求3所述从东革阿里中提取活性蛋白和宽缨酮的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述纳滤的温度为10～30℃，压力为2.0～4.0MPa；所述纳滤先用截留分子量为5万～10万道尔顿的纳滤膜分离，取透过液，再用截留分子量为100～400道尔顿的纳滤膜纳滤至截留液的固含量为8～30%；所述真空浓缩的温度为60～80℃，压力为-0.10～-0.06MPa，真空浓缩至固含量为65～75%。
6.根据权利要求1或2所述从东革阿里中提取活性蛋白和宽缨酮的方法，其特征在于：步骤（4）中，所述浓缩液加入醇溶液中的速度为10～30kg/min；所述静置醇沉的时间为2～4h；所述醇溶液的用量为浓缩液质量的2～20倍；所述醇溶液的体积浓度为80～95%，醇为甲醇和/或乙醇；所述低温真空干燥的温度为30～60℃，压力为-0.10～-0.07MPa，干燥至含水率≤3%。
7.根据权利要求3所述从东革阿里中提取活性蛋白和宽缨酮的方法，其特征在于：步骤（4）中，所述浓缩液加入醇溶液中的速度为10～30kg/min；所述静置醇沉的时间为2～4h；所述醇溶液的用量为浓缩液质量的2～20倍；所述醇溶液的体积浓度为80～95%，醇为甲醇和/或乙醇；所述低温真空干燥的温度为30～60℃，压力为-0.10～-0.07MPa，干燥至含水率≤3%。
8.根据权利要求4所述从东革阿里中提取活性蛋白和宽缨酮的方法，其特征在于：步骤（4）中，所述浓缩液加入醇溶液中的速度为10～30kg/min；所述静置醇沉的时间为2～4h；所述醇溶液的用量为浓缩液质量的2～20倍；所述醇溶液的体积浓度为80～95%，醇为甲醇和/或乙醇；所述低温真空干燥的温度为30～60℃，压力为-0.10～-0.07MPa，干燥至含水率≤3%。
9.根据权利要求1或2所述从东革阿里中提取活性蛋白和宽缨酮的方法，其特征在于：步骤（4）中，所述活性炭与滤液的质量比为1:5～12；所述脱色的温度为40～80℃，时间为2～4h；所述活性炭的目数为80～300目；所述真空浓缩的温度为50～70℃，压力为-0.10～-0.07MPa，浓缩至固含量为10～30%。
10.根据权利要求3所述从东革阿里中提取活性蛋白和宽缨酮的方法，其特征在于：步骤（4）中，所述活性炭与滤液的质量比为1:5～12；所述脱色的温度为40～80℃，时间为2～4h；所述活性炭的目数为80～300目；所述真空浓缩的温度为50～70℃，压力为-0.10～-0.07MPa，浓缩至固含量为10～30%。
11.根据权利要求4所述从东革阿里中提取活性蛋白和宽缨酮的方法，其特征在于：步骤（4）中，所述活性炭与滤液的质量比为1:5～12；所述脱色的温度为40～80℃，时间为2～4h；所述活性炭的目数为80～300目；所述真空浓缩的温度为50～70℃，压力为-0.10～-0.07MPa，浓缩至固含量为10～30%。
12.根据权利要求6所述从东革阿里中提取活性蛋白和宽缨酮的方法，其特征在于：步骤（4）中，所述活性炭与滤液的质量比为1:5～12；所述脱色的温度为40～80℃，时间为2～4h；所述活性炭的目数为80～300目；所述真空浓缩的温度为50～70℃，压力为-0.10～-0.07MPa，浓缩至固含量为10～30%。
13.根据权利要求1或2所述从东革阿里中提取活性蛋白和宽缨酮的方法，其特征在于：步骤（5）中，所述分级洗脱是指：先用2.5～3.5BV体积分数15～25%的乙醇水溶液，以0.4～0.8BV/h的流速洗脱，弃掉洗脱液，再用1.5～2.5BV体积分数65～75%的乙醇水溶液，以0.8～1.2BV/h的流速洗脱，收集洗脱液。
14.根据权利要求3所述从东革阿里中提取活性蛋白和宽缨酮的方法，其特征在于：步骤（5）中，所述分级洗脱是指：先用2.5～3.5BV体积分数15～25%的乙醇水溶液，以0.4～0.8BV/h的流速洗脱，弃掉洗脱液，再用1.5～2.5BV体积分数65～75%的乙醇水溶液，以0.8～1.2BV/h的流速洗脱，收集洗脱液。
15.根据权利要求4所述从东革阿里中提取活性蛋白和宽缨酮的方法，其特征在于：步骤（5）中，所述分级洗脱是指：先用2.5～3.5BV体积分数15～25%的乙醇水溶液，以0.4～0.8BV/h的流速洗脱，弃掉洗脱液，再用1.5～2.5BV体积分数65～75%的乙醇水溶液，以0.8～1.2BV/h的流速洗脱，收集洗脱液。
16.根据权利要求6所述从东革阿里中提取活性蛋白和宽缨酮的方法，其特征在于：步骤（5）中，所述分级洗脱是指：先用2.5～3.5BV体积分数15～25%的乙醇水溶液，以0.4～0.8BV/h的流速洗脱，弃掉洗脱液，再用1.5～2.5BV体积分数65～75%的乙醇水溶液，以0.8～1.2BV/h的流速洗脱，收集洗脱液。
17.根据权利要求9所述从东革阿里中提取活性蛋白和宽缨酮的方法，其特征在于：步骤（5）中，所述分级洗脱是指：先用2.5～3.5BV体积分数15～25%的乙醇水溶液，以0.4～0.8BV/h的流速洗脱，弃掉洗脱液，再用1.5～2.5BV体积分数65～75%的乙醇水溶液，以0.8～1.2BV/h的流速洗脱，收集洗脱液。
18.根据权利要求1或2所述从东革阿里中提取活性蛋白和宽缨酮的方法，其特征在于：步骤（5）中，所述氧化铝柱的装柱径高比为1:3～8；所述氧化铝为酸性氧化铝或中性氧化铝，目数为80～300目；使用前，先将氧化铝在110～600℃下，活化12～30h后，再用体积分数85～99%的乙醇清洗至流出液无色透明，且除乙醇味外无其它气味为止，最后用水洗至无乙醇味；所述真空浓缩的温度为50～80℃，压力为-0.10～-0.07MPa，浓缩至固含量为70～80%。
19.根据权利要求3所述从东革阿里中提取活性蛋白和宽缨酮的方法，其特征在于：步骤（5）中，所述氧化铝柱的装柱径高比为1:3～8；所述氧化铝为酸性氧化铝或中性氧化铝，目数为80～300目；使用前，先将氧化铝在110～600℃下，活化12～30h后，再用体积分数85～99%的乙醇清洗至流出液无色透明，且除乙醇味外无其它气味为止，最后用水洗至无乙醇味；所述真空浓缩的温度为50～80℃，压力为-0.10～-0.07MPa，浓缩至固含量为70～80%。
20.根据权利要求4所述从东革阿里中提取活性蛋白和宽缨酮的方法，其特征在于：步骤（5）中，所述氧化铝柱的装柱径高比为1:3～8；所述氧化铝为酸性氧化铝或中性氧化铝，目数为80～300目；使用前，先将氧化铝在110～600℃下，活化12～30h后，再用体积分数85～99%的乙醇清洗至流出液无色透明，且除乙醇味外无其它气味为止，最后用水洗至无乙醇味；所述真空浓缩的温度为50～80℃，压力为-0.10～-0.07MPa，浓缩至固含量为70～80%。
21.根据权利要求6所述从东革阿里中提取活性蛋白和宽缨酮的方法，其特征在于：步骤（5）中，所述氧化铝柱的装柱径高比为1:3～8；所述氧化铝为酸性氧化铝或中性氧化铝，目数为80～300目；使用前，先将氧化铝在110～600℃下，活化12～30h后，再用体积分数85～99%的乙醇清洗至流出液无色透明，且除乙醇味外无其它气味为止，最后用水洗至无乙醇味；所述真空浓缩的温度为50～80℃，压力为-0.10～-0.07MPa，浓缩至固含量为70～80%。
22.根据权利要求9所述从东革阿里中提取活性蛋白和宽缨酮的方法，其特征在于：步骤（5）中，所述氧化铝柱的装柱径高比为1:3～8；所述氧化铝为酸性氧化铝或中性氧化铝，目数为80～300目；使用前，先将氧化铝在110～600℃下，活化12～30h后，再用体积分数85～99%的乙醇清洗至流出液无色透明，且除乙醇味外无其它气味为止，最后用水洗至无乙醇味；所述真空浓缩的温度为50～80℃，压力为-0.10～-0.07MPa，浓缩至固含量为70～80%。
23.根据权利要求13所述从东革阿里中提取活性蛋白和宽缨酮的方法，其特征在于：步骤（5）中，所述氧化铝柱的装柱径高比为1:3～8；所述氧化铝为酸性氧化铝或中性氧化铝，目数为80～300目；使用前，先将氧化铝在110～600℃下，活化12～30h后，再用体积分数85～99%的乙醇清洗至流出液无色透明，且除乙醇味外无其它气味为止，最后用水洗至无乙醇味；所述真空浓缩的温度为50～80℃，压力为-0.10～-0.07MPa，浓缩至固含量为70～80%。
24.根据权利要求1或2所述从东革阿里中提取活性蛋白和宽缨酮的方法，其特征在于：步骤（6）中，所述制备液相色谱中色谱柱的填料为C-18键合硅胶，装柱径高比为1:3～8；所述洗脱剂为乙腈-水，体积比为20～40:80～60；所述洗脱的流速为0.10～1.00BV/h，洗脱的次数≥1次。
25.根据权利要求3所述从东革阿里中提取活性蛋白和宽缨酮的方法，其特征在于：步骤（6）中，所述制备液相色谱中色谱柱的填料为C-18键合硅胶，装柱径高比为1:3～8；所述洗脱剂为乙腈-水，体积比为20～40:80～60；所述洗脱的流速为0.10～1.00BV/h，洗脱的次数≥1次。
26.根据权利要求4所述从东革阿里中提取活性蛋白和宽缨酮的方法，其特征在于：步骤（6）中，所述制备液相色谱中色谱柱的填料为C-18键合硅胶，装柱径高比为1:3～8；所述洗脱剂为乙腈-水，体积比为20～40:80～60；所述洗脱的流速为0.10～1.00BV/h，洗脱的次数≥1次。
27.根据权利要求6所述从东革阿里中提取活性蛋白和宽缨酮的方法，其特征在于：步骤（6）中，所述制备液相色谱中色谱柱的填料为C-18键合硅胶，装柱径高比为1:3～8；所述洗脱剂为乙腈-水，体积比为20～40:80～60；所述洗脱的流速为0.10～1.00BV/h，洗脱的次数≥1次。
28.根据权利要求9所述从东革阿里中提取活性蛋白和宽缨酮的方法，其特征在于：步骤（6）中，所述制备液相色谱中色谱柱的填料为C-18键合硅胶，装柱径高比为1:3～8；所述洗脱剂为乙腈-水，体积比为20～40:80～60；所述洗脱的流速为0.10～1.00BV/h，洗脱的次数≥1次。
29.根据权利要求13所述从东革阿里中提取活性蛋白和宽缨酮的方法，其特征在于：步骤（6）中，所述制备液相色谱中色谱柱的填料为C-18键合硅胶，装柱径高比为1:3～8；所述洗脱剂为乙腈-水，体积比为20～40:80～60；所述洗脱的流速为0.10～1.00BV/h，洗脱的次数≥1次。
30.根据权利要求18所述从东革阿里中提取活性蛋白和宽缨酮的方法，其特征在于：步骤（6）中，所述制备液相色谱中色谱柱的填料为C-18键合硅胶，装柱径高比为1:3～8；所述洗脱剂为乙腈-水，体积比为20～40:80～60；所述洗脱的流速为0.10～1.00BV/h，洗脱的次数≥1次。
31.根据权利要求1或2所述从东革阿里中提取活性蛋白和宽缨酮的方法，其特征在于：步骤（6）中，萃取浸膏用有机溶剂溶解至质量浓度为38～80%；所述有机溶剂为甲醇和/或乙醇；所述真空浓缩的温度为40～80℃，压力为-0.10～-0.07MPa，浓缩至固含量为40～60%；所述真空干燥的温度为60～80℃，压力为-0.10～-0.07MPa，干燥至含水率≤3%。
32.根据权利要求3所述从东革阿里中提取活性蛋白和宽缨酮的方法，其特征在于：步骤（6）中，萃取浸膏用有机溶剂溶解至质量浓度为38～80%；所述有机溶剂为甲醇和/或乙醇；所述真空浓缩的温度为40～80℃，压力为-0.10～-0.07MPa，浓缩至固含量为40～60%；所述真空干燥的温度为60～80℃，压力为-0.10～-0.07MPa，干燥至含水率≤3%。
33.根据权利要求4所述从东革阿里中提取活性蛋白和宽缨酮的方法，其特征在于：步骤（6）中，萃取浸膏用有机溶剂溶解至质量浓度为38～80%；所述有机溶剂为甲醇和/或乙醇；所述真空浓缩的温度为40～80℃，压力为-0.10～-0.07MPa，浓缩至固含量为40～60%；所述真空干燥的温度为60～80℃，压力为-0.10～-0.07MPa，干燥至含水率≤3%。
34.根据权利要求6所述从东革阿里中提取活性蛋白和宽缨酮的方法，其特征在于：步骤（6）中，萃取浸膏用有机溶剂溶解至质量浓度为38～80%；所述有机溶剂为甲醇和/或乙醇；所述真空浓缩的温度为40～80℃，压力为-0.10～-0.07MPa，浓缩至固含量为40～60%；所述真空干燥的温度为60～80℃，压力为-0.10～-0.07MPa，干燥至含水率≤3%。
35.根据权利要求9所述从东革阿里中提取活性蛋白和宽缨酮的方法，其特征在于：步骤（6）中，萃取浸膏用有机溶剂溶解至质量浓度为38～80%；所述有机溶剂为甲醇和/或乙醇；所述真空浓缩的温度为40～80℃，压力为-0.10～-0.07MPa，浓缩至固含量为40～60%；所述真空干燥的温度为60～80℃，压力为-0.10～-0.07MPa，干燥至含水率≤3%。
36.根据权利要求13所述从东革阿里中提取活性蛋白和宽缨酮的方法，其特征在于：步骤（6）中，萃取浸膏用有机溶剂溶解至质量浓度为38～80%；所述有机溶剂为甲醇和/或乙醇；所述真空浓缩的温度为40～80℃，压力为-0.10～-0.07MPa，浓缩至固含量为40～60%；所述真空干燥的温度为60～80℃，压力为-0.10～-0.07MPa，干燥至含水率≤3%。
37.根据权利要求18所述从东革阿里中提取活性蛋白和宽缨酮的方法，其特征在于：步骤（6）中，萃取浸膏用有机溶剂溶解至质量浓度为38～80%；所述有机溶剂为甲醇和/或乙醇；所述真空浓缩的温度为40～80℃，压力为-0.10～-0.07MPa，浓缩至固含量为40～60%；所述真空干燥的温度为60～80℃，压力为-0.10～-0.07MPa，干燥至含水率≤3%。
38.根据权利要求24所述从东革阿里中提取活性蛋白和宽缨酮的方法，其特征在于：步骤（6）中，萃取浸膏用有机溶剂溶解至质量浓度为38～80%；所述有机溶剂为甲醇和/或乙醇；所述真空浓缩的温度为40～80℃，压力为-0.10～-0.07MPa，浓缩至固含量为40～60%；所述真空干燥的温度为60～80℃，压力为-0.10～-0.07MPa，干燥至含水率≤3%。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A method of extracting active protein and tanshinone from Dongge Ali Effective date of registration: 20210422 Granted publication date: 20190329 Pledgee: CITIC Bank Changsha branch Pledgor: HUNAN HUACHENG BIOTECH, Inc. Registration number: Y2021980002898 |
|
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20231127 Granted publication date: 20190329 Pledgee: CITIC Bank Changsha branch Pledgor: HUNAN HUACHENG BIOTECH, Inc. Registration number: Y2021980002898 |
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| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |