CN105237430B - 一种从藤椒中提取麻味物质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从藤椒中提取麻味物质的方法。所述方法为：将藤椒处理后得到藤椒粉，经95%乙醇回流萃取后得到萃取液，首先进行硅胶柱层析，然后进行ODS柱层析，最后用交联葡聚糖LH‑20纯化；将经过制备型HPLC分离得到的麻味物质单体悬浮于水中1‑2小时，经高真空移除挥发物，冷冻干燥2次后得到粉末状麻味物质单体。真空包装后避光保存。本方法采用先进的分离纯化技术得到了种类多、纯度高的麻味物质单体，能够满足多种需求。

Description

一种从藤椒中提取麻味物质的方法

技术领域

本发明涉及一种从藤椒中提取麻味物质的方法。

背景技术

藤椒，学名为竹叶花椒，系芸香科花椒属植物。花椒主要分布在亚洲、非洲、美洲及大洋洲的热带和亚热带地区。我国是花椒种植大国，全国花椒种植面积约21万公顷，四川、贵州、云南、宁夏、陕西、甘肃、河南、河北、山东、辽宁等省都有出产。四川汉源、金阳、茂汶，重庆江津，山东泰安、莱芜，陕西韩城等都是全国著名的花椒种植基地。藤椒中含有多种活性成分，如多不饱和酰胺、精油、生物碱、木质素、多糖等，赋予藤椒抗氧化、抗癌、抑菌、抗衰老、止痒等特征活性。在藤椒的应用中，最重要的仍然是它的风味，由多不饱和酰胺引起的强烈的麻味是藤椒能成为中国“八大味”之一的重要品质指标。

藤椒中的麻味是由酰胺类物质（麻味物质）引起的，研究表明这些物质包括α-山椒素、羟基-α-山椒素、β-山椒素、羟基-β-山椒素、γ-山椒素、羟基-γ-山椒素、羟基-ε-山椒素、羟基-γ-异山椒素、花椒素、异花椒素等，这些物质是不溶于水而溶于有机溶剂的。寻找一种最佳的麻味物质提取方法具有重大的科学意义和工程应用价值：

首先，藤椒中的麻味物质具有热不稳定性、对紫外线敏感以及贮藏过程中容易发生降解等性质。因此，藤椒的麻味在贮藏和开发产品的过程中极易被破坏，从而失去其特殊的香麻风味。如果能有效的提取藤椒中的麻味物质，它将作为一种天然麻味提取物应用到食品工业的各个领域；其次，在科学研究中，麻味物质及其单体是重要的标准物质，用来定量藤椒的麻味大小，评价藤椒的品质。再次，由于藤椒作为一种天然产物，其具有的麻味引起的神经电位反应是国内外众多科学家研究的重点，纯度较高的麻味物质是进行细胞和分子实验的重要材料；最后，由于藤椒中的麻味物质具有多种生物活性，包括抗氧化、抗癌、降血糖、抗炎等，因此，将其分离出来可作为天然功能性物质应用到食品和化妆品领域。综上所述，研究出一种有效提取藤椒中麻味物质的方法将是食品科学与工程及化妆品行业未来发展的趋势。 为此，一些科技工作者也做过尝试，现已公开的报道有：

CN102771747B公开了一种提取花椒油麻味物质的方法，本发明涉及一种提取花椒油麻味物质的方法，该方法包括如下步骤：准确称取0.1g花椒油于10mL容量瓶中，用无水甲醇定容至刻度，摇匀，30℃下浸提4h，冷却后，转入10mL刻度离心试管中，离心，取上清液0.1mL于10mL容量瓶中，用无水甲醇定容至刻度，摇匀，经0.2μm滤膜过滤后即为待测液，将待测液进行半制备型高效液相色谱法分离，进行馏分收集，馏分收集器收集开始时间为9.0min，结束时间为11.6min，收集馏分收集器的流出液，多次进样后，合并流出液，浓缩去除溶剂，得到花椒油麻味物质。本发明提供了一种制备花椒油麻味物质的方法，操作步骤简单，且设备要求不高。

CN102690208B公开了一种从花椒油中提取羟基山椒素的方法，本发明公开的一种从花椒油中提取羟基山椒素的方法，其工艺步骤是：1）将花椒油用甲醇依次进行室温浸提、离心分离、层析除多酚、冷冻、旋转蒸发得浓缩物；2）先将浓缩物用甲醇溶解后，用硅胶柱进行梯度洗脱并等份收集洗脱液，再将薄层层析法初步确定的目标物所在的洗脱液进行浓缩干燥；3）将所得浓缩物用制备型液相色谱进行细分纯化，并分别收集两个最大吸收峰的洗脱液进行旋转蒸发即得羟基山椒素Ⅰ和Ⅱ。本发明提供的方法不仅填补了现有技术的空白，为该领域提供了一种可作为花椒麻味定量的标准品，且前处理简单、操作方便，分离提纯的分离物纯度高。

上述公开的发明虽然对提取麻味物质进行了一定程度的探索，但是其存在的技术缺陷较为明显。首先是这些方法的提取对象是花椒油，而不是干花椒或者鲜花椒。花椒油作为一种花椒深加工产品目前已经常见于市场，从花椒油中提取麻味物质是一种间接方法，其逃避了该领域的难点，没有从根本上解决问题；其次，这些方法提取出的麻味物质纯度较低，不能作为神经科学以及风味化学研究的材料，无法满足科学工作者的需要，也无法发挥其较好的生物活性，将其应用到食品和化妆品工业中；最后，这些方法没有分离出麻味物质单体，都是包含了多种分子的混合物，因此也就不能评价花椒风味的浓郁程度，即“麻”的程度，也不能作为标准物为其他酰胺类物质定量。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的上述缺陷，所要解决的技术问题是提供一种从藤椒中提取麻味物质的方法。该方法以干藤椒或鲜藤椒为原料，采用先进的分离纯化技术得到了纯度高的麻味物质单体，能够满足多种需求。

本发明的技术方案如下：

一种从藤椒中提取麻味物质的方法包括以下步骤：

（1）对藤椒进行乙醇回流萃取或进行CO₂超临界萃取，得萃取液；

（2）对萃取液进行柱层析，然后进行洗脱，得洗脱物；

（3）对洗脱物用旋转蒸发仪减压蒸发，得到粗提物；

（4）对粗提物以甲醇为洗脱剂，经制备型HPLC分离，分别得到11种麻味物质单体提取物；

（5）另取步骤（1）中所得乙醇回流萃取液离心分离得上清液，然后经交联葡聚糖LH-20柱用甲醇纯化后得到第12种麻味物质单体提取物；

（6）将上述12种麻味物质单体提取物分别经过旋转蒸发仪减压蒸发，移除溶剂及其他杂质，分别得到12种麻味物质单体；然后将这12种麻味物质单体悬浮于水中，经真空移除挥发物，冷冻干燥后分别得到12种粉末状麻味物质单体，真空分别包装后避光保存。

所述步骤（1）中乙醇回流萃取方法可以为:

（1）将干燥后的藤椒叶去掉叶柄，果实去籽，采用小型电动粉碎机粉碎，过40目筛网，得干藤椒粉密封避光冷藏备用；

（2）取干藤椒粉用体积浓度95%的乙醇按料液比1:5-10回流萃取1~3个小时，得到萃取液。

所述步骤（1）中CO₂超临界萃取方法可以为:

（1）将干藤椒或鲜藤椒进行CO₂超临界萃取，得到初级萃取液；

（2）将初级萃取液在2500rpm条件下离心5min得到上清液即为萃取液。

所述步骤（2）的柱层析方法可以为：

取萃取液进行硅胶柱层析，用6个梯度的氯仿-甲醇混合液进行洗脱，依次得到6个洗脱物，命名为fr.1，fr.2，fr.3，fr.4，fr.5，fr.6；

将洗脱物fr.2再次进行硅胶柱层析，用苯-正己烷-丙酮为洗脱剂洗脱，得到洗脱物fr.2.1；

将洗脱物fr.2.1过ODS柱并用甲醇洗脱，得到洗脱物fr.2.1.1。

所述6个梯度的氯仿-甲醇混合液中的氯仿、甲醇体积比分别为： 10:1；5:1；10:3；5:2；2:1；5:3。

所苯-正己烷-丙酮为洗脱剂中苯、正己烷、丙酮的体积比为5:2:1或5:3:2或6：3:1。

所述步骤（3）为50°C条件下减压蒸发2~3小时

所述制备型HPLC分离条件为：

色谱柱：ODS-4251K（ø 10×250 mm, 5 µm），流速为1.5 mL/min；柱温25℃；紫外检测波长270 nm；进样量：200 µL；甲醇-水溶液梯度洗脱，30 min；手动收集最大吸收峰的洗脱液。

所述步骤（4）中 11种麻味物质单体为：羟基-α-山椒素、

羟基-β-山椒素、羟基-γ-山椒素、羟基-γ-异山椒素、花椒素、异花椒素、α-山椒素、β-山椒素、γ-山椒素、羟基-ε-山椒素、脱氢-γ-山椒素；步骤（5）中第12种麻味物质单体为：多氢花椒素。

本发明提供的一种从藤椒中提取麻味物质的方法采用了合适的有机溶剂与合理的纯化手段，不仅得率高，而且分离出了12种麻味物质单体，单体纯度高达98%以上，可作为神经科学实验的材料以及化妆品行业的功能性添加物。本发明与现有技术相比，具有如下优势：

1、由于本发明提供的一种从藤椒中提取麻味物质的方法选用了氯仿-甲醇这一有机溶剂组合按照不同比例进行梯度洗脱，结合硅胶柱层析分离得到了6个组分，极大的降低了筛选麻味物质的时间，提高了分离效率的同时也为后续纯化步骤奠定了基础。

2、由于本发明提供的一种从藤椒中提取麻味物质的方法对不同组分的物质采用了不同的纯化方法，分别使用了不同质量的硅胶柱层析、ODS柱层析以及交联葡聚糖LH-20柱层析，使得极性不同的目标物质（麻味物质）高效分离，最终成功获得12种麻味物质单体。解决了长期以来分离单体困难、所得单体种类少的技术难题。

3、由于本发明提供的一种从藤椒中提取麻味物质的方法在对不同组分使用不同柱层析的基础上又增加了移除溶剂及其他杂质、单体悬浮于水、高真空移除挥发物等技术纯化所得麻味物质单体，去除了与麻味物质结合紧密的香味成分，进一步提高了麻味物质的纯度。

4、由于本发明提供的一种从藤椒中提取麻味物质的方法对纯化后的麻味物质单体采用了冷冻干燥两次的操作，得到了粉末状的麻味物质，这一状态不仅方便运输与再利用，而且能够最好的保持麻味物质的稳定性，解决了麻味物质贮藏过程中极易降解这一难题。

5、由于本发明提供的一种从藤椒中提取麻味物质的方法采用不同质量浓度的甲醇在制备型HPLC中作为流动相，成功得到了11种麻味物质单体，并且每种单体的得率较高，解决了使用制备型HPLC时经常由于流动相选择不当导致的目标物质得率低的难题。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制。该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容，对本发明做出一些非本质的改进和调整。

实施例

从藤椒中提取麻味物质的方法：

（1）原料预处理：

将干燥后的藤椒叶去掉叶柄，果实去籽，采用小型电动粉碎机粉碎，过40目筛网，得干藤椒粉密封避光冷藏备用；取干藤椒粉用体积浓度95%的乙醇按料液质量比1:5-10回流萃取1~3个小时，得到萃取液；

或

a将干藤椒或鲜藤椒进行CO₂超临界萃取，得到初级萃取液；

b将初级萃取液在2500rpm条件下离心5min得到上清液即为萃取液；

（2）取上述萃取液50 g进行硅胶柱层析，硅胶用量1000g，分别用6个梯度的氯仿-甲醇混合液进行洗脱，依次得到6个洗脱物，命名为fr.1，fr.2，fr.3，fr.4，fr.5，fr.6；6个梯度的氯仿-甲醇混合液中的氯仿、甲醇体积比分别为：10:1；5:1；10:3；5:2；2:1；5:3；

（3）将洗脱物fr.2再次进行硅胶柱层析，硅胶用量250g，用体积比为5:2:1的苯-正己烷-丙酮为洗脱剂，得到洗脱物fr.2.1；

（4）将洗脱物fr.2.1过ODS柱，ODS颗粒55g，并用体积浓度为80%甲醇洗脱，得到洗脱物fr.2.1.1；

（5）将上述洗脱物fr.1，fr.3，fr.4，fr.5，fr.6，fr.2.1.1，用旋转蒸发仪50°C减压蒸干2~3小时，得到粗提物；

（7）将粗提物以体积浓度为60~85%的色谱级甲醇为洗脱剂，经制备型HPLC分离，分别得到11种麻味物质单体提取物；制备型HPLC分离条件：

色谱柱：ODS-4251K（ø 10×250 mm, 5 µm），流速为1.5 mL/min；柱温25℃；紫外检测波长270 nm；进样量：200 µL，甲醇-水溶液梯度洗脱，30 min；手动收集最大吸收峰的洗脱液；

（8）另外再单独取步骤（1）中所得乙醇回流萃取液50g离心，3000rpm，5min，得到上清液，经交联葡聚糖LH-20柱用甲醇纯化后得到第12种麻味物质单体提取物；

（9）将上述12种麻味物质单体提取物分别经过旋转蒸发仪55°C减压蒸发1~2小时，移除溶剂及其他杂质，分别得到12种麻味物质单体；

（10）将步骤（9）得到的12种麻味物质的单体悬浮于水中1~2小时，经高真空-0.1MPa移除挥发物，冷冻干燥2次后分别得到12种粉末状麻味物质单体，真空分别包装后避光保存；冷冻干燥参数：预冷温度-46℃，时间5小时；冻干温度-40℃，5小时；-20℃，1小时，0℃，1小时；25℃，1小时。

本实施例中所用的旋转蒸发仪为上海亚荣生化仪器厂的型号RE52-99的旋转蒸发仪。

制备型HPLC分离条件：

色谱柱：ODS-4251K（ø 10×250 mm, 5 µm），流速为1.5 mL/min；柱温25℃；紫外检测波长270 nm；进样量：200 µL。甲醇-水溶液梯度洗脱，30 min；手动收集最大吸收峰的洗脱液即麻味物质单体提取物。

对本实施例所得麻味物质作了如下测试方法：

1、麻味物质分析鉴定方法

1.1 HPLC法

样品处理：用色谱级甲醇溶解实施例所得麻味物质，并稀释至1 mg/mL，用0.45 mm有机相滤膜过滤，即可上样。

色谱条件

色谱柱：MN Nucleodur 1100 - 5 C18 柱(ø 4×125 mm, 5 μm)；流动相：A 水；B乙腈；流速：0.5 mL/min；柱温：25℃；紫外检测波长：270 nm；进样量：20 µL。

洗脱程序如表1所示。

表1 HPLC洗脱程序

1.2 LC-MS检测

液相色谱条件：

色谱柱：MN Nucleodur 1100 - 5 C18 柱(ø 4×125 mm, 5 μm)；流动相：A 水；B乙腈；流速：0.5 mL/min；柱温：25℃；进样量：20 µL。

质谱条件：

电喷雾离子源( ESI)：正离子电离；喷雾电压：4500 V；干燥气流速：10 L/min；干燥温度：350℃；雾化气压力：2. 07×10² kPa；毛细管出口电压：112.8 V；刮削器电压40 V；扫描范围：m/z 150～400。

2、麻味物质定量检测方法

将实施例制备得到的麻味物质样品配制成不同浓度的溶液，以各浓度样液在270nm下吸收峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

测试结果见表1：

表1 测试结果表

从表1可见，与已经发表的论文和已经公开的专利相比，本发明提供的从藤椒中提取麻味物质的方法能够分离出麻味单体，并且单体的种类多，含量高，纯度高，单体纯度达98%以上。

Claims (1)

1.一种从藤椒中提取麻味物质的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）原料预处理：

将干燥后的藤椒叶去掉叶柄，果实去籽，采用小型电动粉碎机粉碎，过40目筛网，得干藤椒粉密封避光冷藏备用；取干藤椒粉用体积浓度95%的乙醇按料液质量比1:5-10回流萃取1~3个小时，得到萃取液；

（2）取上述萃取液50 g进行硅胶柱层析，硅胶用量1000g，分别用6个梯度的氯仿-甲醇混合液进行洗脱，依次得到6个洗脱物，命名为fr.1，fr.2，fr.3，fr.4，fr.5，fr.6；6个梯度的氯仿-甲醇混合液中的氯仿、甲醇体积比分别为：10:1；5:1；10:3；5:2；2:1；5:3；

（3）将洗脱物fr.2再次进行硅胶柱层析，硅胶用量250g，用体积比为5:2:1的苯-正己烷-丙酮为洗脱剂，得到洗脱物fr.2.1；

（4）将洗脱物fr.2.1过ODS柱，ODS颗粒55g，并用体积浓度为80%甲醇洗脱，得到洗脱物fr.2.1.1；

（5）将上述洗脱物fr.1，fr.3，fr.4，fr.5，fr.6，fr.2.1.1，用旋转蒸发仪50°C减压蒸干2~3小时，得到粗提物；

（7）将粗提物以体积浓度为60~85%的色谱级甲醇为洗脱剂，经制备型HPLC分离，分别得到11种麻味物质单体提取物：羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素、羟基-γ-山椒素、羟基-γ-异山椒素、花椒素、异花椒素、α-山椒素、β-山椒素、γ-山椒素、羟基-ε-山椒素、脱氢-γ-山椒素；制备型HPLC分离条件：

色谱柱：ODS-4251Kø 10×250 mm, 5 µm，流速为1.5 mL/min；柱温25℃；紫外检测波长270 nm；进样量：200 µL，甲醇-水溶液梯度洗脱，30 min；手动收集最大吸收峰的洗脱液；

（8）另外再单独取步骤（1）中所得乙醇回流萃取液50g离心，3000rpm，5min，得到上清液，经交联葡聚糖LH-20柱用甲醇纯化后得到第12种麻味物质单体提取物：多氢花椒素；

（9）将上述12种麻味物质单体提取物分别经过旋转蒸发仪55°C减压蒸发1~2小时，移除溶剂及其他杂质，分别得到12种麻味物质单体；

（10）将步骤（9）得到的12种麻味物质的单体悬浮于水中1~2小时，经高真空-0.1MPa移除挥发物，冷冻干燥2次后分别得到12种粉末状麻味物质单体，真空分别包装后避光保存；冷冻干燥参数：预冷温度-46℃，时间5小时；冻干温度-40℃，5小时；-20℃，1小时，0℃，1小时；25℃，1小时。