CN107033017B - 一种快速制备高纯度羟基-γ-山椒素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速制备高纯度羟基‑γ‑山椒素的方法，采用恒温振荡提取、正己烷萃取以及紫外照射处理三个关键步骤，在操作过程中加入了铁粉作为催化剂，提高了产品的纯度。此外该制备方法不需要特殊的仪器设备，如制备型或半制备型高效液相色谱仪，使得制备方法相比于传统的柱层析法更加简单、耗时更短、成本低，因此可以为一般的实验室来制备高纯度的羟基‑γ‑山椒素以进行其所需实验，极大的提高了工作效率。由于本发明的操作经验性不强，所以一般操作水平的人员也能进行制备。

Description

一种快速制备高纯度羟基-γ-山椒素的方法

技术领域

本发明涉及天然产物分离纯化领域，具体涉及一种快速制备高纯度羟基-γ-山椒素的方法。

背景技术

花椒油是直接用食用油浸泡花椒或采用有机溶剂浸提、超临界CO₂萃取等方法制得的花椒油树脂与食用油适量混合所制成的具有麻香味的调味油。花椒油的加工大大减少了花椒在贮藏和销售等环节中造成有效成分的损失和微生物污染，解决了花椒粒和花椒粉剂给烹饪及食用带来的不便，因此越来越受消费者青睐。但目前花椒油市场并不规范，产品标签大多只标明原料，而作为花椒油重要指标的麻味物质含量并没有出现在标签上。如何分离出高纯度花椒麻味物质，以作为花椒及其产品麻味定量的标准品一直是国内研究的热点，也是各花椒生产企业关注的焦点。

在花椒的应用中，最重要的仍然是它的风味，由多不饱和酰胺引起的强烈的麻味是花椒能成为中国“八大味”之一的重要品质指标。花椒中的麻味是由酰胺类物质（麻味物质）引起的，研究表明这些物质包括γ-山椒素、羟基-γ-山椒素、β-山椒素、羟基-β-山椒素、γ-山椒素、羟基-γ-山椒素、羟基-ε-山椒素、羟基-γ-异山椒素、花椒素、异花椒素等。山椒素又可分为α-山椒素、β-山椒素、γ-山椒素、羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素、羟基-γ-山椒素、羟基-ε-山椒素等，且其中的羟基-α-山椒素和羟基-γ-山椒素的相对含量明显大于其他的山椒素。这些山椒素在200nm到300nm都有紫外吸收现象，并在270nm处出现了最大吸收峰。

从花椒中提取、分离、纯化得到高纯度的酰胺类物质是一种极其困难的方法。03132341.3公开了一种利用超临界流体技术分离花椒麻味成分的工艺，该工艺设备操作技术要求较高，且所制备的麻味成分为初步提取物，这类方法需要较强的操作经验，实验的重复性极差，结果不稳定，耗时长，且所制备的麻味成分为初步提取物，只能用于工业化生产中，作为食品和药品的原料，不适宜作为麻味定量的标准品。而201210175527.9使用薄层层析法从花椒油中提取高纯度羟基山椒素的方法，虽然填补了这方面的空白，但制备过程中仍然使用到液相色谱的色谱柱，制备成本增加。

针对上述问题，本发明采用恒温振荡提取、正己烷萃取以及紫外照射三步法对花椒油中的羟基-γ-山椒素进行提取，在操作过程中加入了铁粉作为催化剂，提高了产品的纯度。此外该制备方法不需要特殊的仪器设备，使得制备方法相比于传统的柱层析法更加简单、耗时更短、成本低，极大的提高了工作效率。

发明内容

为了克服现有技术的缺点，本发明的技术方案是提供了一种快速制备高纯度羟基-γ-山椒素的方法。该方法操作简单，不需要专业性太强的技术人员进行操作，同时耗费时间明显缩短，制作过程中无需使用制备型或半制备型高效液相色谱仪，降低了制备成本，且获得的羟基-γ-山椒素的纯度高。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种快速制备高纯度羟基-γ-山椒素的方法：

（1）以花椒油作为原料，向花椒油中加入甲醇，然后依次进行震荡、超声、离心，获取上清液；

（2）向上清液中加入正己烷进行萃取，得到下层清液；

（3）对下层清液进行层析、过滤，最终将滤液进行减压蒸干，获得粗提取物；

（4）粗提取物溶于甲醇后加入铁粉再转移至血清瓶内，进行紫外灯照射，照射结束后行减压蒸干即可获得羟基-γ-山椒素。

进一步的，本发明中花椒油与甲醇的体积比为1:20，所述花椒油为红花椒油。

进一步的，步骤（1）中采用恒温震荡器震荡，温度为40℃，震荡时间为1h，转速为160rpm。

进一步的，步骤（1）中超声时间为5min。

进一步的，步骤（1）中离心速度为4000r/min，离心时间为15min。

进一步的，所述上步骤（2）中上清液和正己烷的料液比1：2，萃取次数3次；所述步骤（2）过滤为0.22μm有机系滤膜过滤。

进一步的，所述步骤（3）减压蒸干采用旋转蒸发仪减压蒸干，干燥条件为真空度0.09Mpa，温度为45℃，干燥时间2h。

进一步的，所述步骤（4）中甲醇为色谱级甲醇，用量20ml，所述铁粉为10~20mg。

进一步的，所述紫外灯功率为20w，波长为254nm，照射的距离为20cm，照射的时间为4~6h。

进一步的，所述步骤（4）减压蒸干采用旋转蒸发仪减压蒸干，干燥条件为真空度0.09Mpa，温度为45℃，干燥时间1h。

本发明构思为：本发明首先采用甲醇将花椒油中的山椒素提取出来，提取后进行震荡、超声、离心，将油脂及油溶性物质除去。采用正己烷重复萃取3次，将花椒中的香味物质全部除去，以便获得高纯度的麻味物质（山椒素），随后进行层析、过滤、蒸干得到粗提取物。最终采用甲醇将山椒素溶解，为山椒素提供极性环境，加入铁粉作为催化剂并经紫外光照射后获得纯度大于98%的羟基-γ-山椒素，杂质与其他同分异构体及其他酰胺类物质的含量不足2%。这样纯度的羟基-γ-山椒素可用于所有的生理生化实验以及麻味评价实验，整个制备方法用时为9~11个小时。

本发明与现有技术相比，具有如下优点：

1、由于本发明提供的一种快速制备高纯度羟基-γ-山椒素的方法采用了恒温振荡提取、正己烷萃取以及紫外照射处理三个关键步骤，使得制备方法相比于传统的柱层析法更加简单、耗时更短，传统的提取分离纯化方法一般耗时24~48小时，且操作复杂，经验性较强，重复性较差，本发明提供的方法全过程只需要9~11个小时，且操作简单，一般的技术人员均可熟练掌握。相比专利CN201210175527.9步骤（1）中提及的层析柱除去多酚，需要在-20℃以下避光冷冻12～18小时，操作时间明显长于本发明全程时间7~9h。另外步骤（2）中提及的薄层层析法是用体积比1:9的甲醇和氯仿混合液作为展开剂，将上述洗脱液在薄层板上进行点样，展开，并置于254nm的紫外灯下，将出现明显紫色斑点的第二组分确定为目标物所在组分，其中明显紫色斑点仅为定性而非定量，完全依靠操作人员的经验进行判定，所以对技术的掌握要求跟高，而本发明中并不要求操作性和丰富的经验。

2、由于本发明提供的一种快速制备高纯度羟基-γ-山椒素的方法采用了合适的紫外照射处理，并添加铁粉作为催化剂，利用了光反应和化学反应使得羟基-γ-山椒素的同分异构体羟基-γ-异山椒素向其发生转化，进而提高了羟基-γ-山椒素的纯度，使得目标物质的纯度达到98%以上。而专利CN201210175527.9中并未添加任何催化剂，最终制得的羟基-γ-山椒素相对含量仅为81.55%，羟基-γ-异山椒素相对含量为3.43%，且后者无法发生转化，浓度得不到提高。而本发明中最终制得的羟基-γ-山椒素相对含量最低为98.91%，最高为99.18%。

3、由于本发明提供的一种快速制备高纯度羟基-γ-山椒素的方法不需要特殊的仪器设备，如制备型或半制备型高效液相色谱仪，且操作简单，耗时短，成本低，因此可以为一般的实验室和一般操作水平的人员用来制备高纯度的羟基-γ-山椒素以进行其所需实验，极大的提高了工作效率。

附图说明

图1实施例1制备的物质HPLC图谱；

图2实施例2制备的物质HPLC图谱；

图3实施例3制备的物质HPLC图谱。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制。该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容，对本发明做出一些非本质的改进和调整。

实施例1

（1）取30mL红花椒油，按体积比1:20加入甲醇，使用恒温振荡器40℃振荡1h，转速160rpm，再超声5min，将浸提液移入离心管中4000r/min离心15 min后取上清液；

（2）将上清液用正己烷进行萃取，料液比1：2，萃取3次，将萃取的下层清液过碱性三氧化二铝柱，所得层析液过0.22μm有机系滤膜，最后将滤液用旋转蒸发仪45℃（真空度0.09Mpa）减压蒸干2h，得粗提物；

（3）取10mg粗提物溶于20mL色谱级甲醇中，加入10mg的铁粉，放入血清瓶中，将其进行紫外照射处理，紫外照射条件为紫外灯功率20w，紫外线波长为254nm，物品距离紫外灯20cm，照射时间为4小时，用旋转蒸发仪45℃（真空度0.09Mpa）减压蒸干，蒸干时间1h即可获得羟基-γ-山椒素。

实施例2

（1）取30mL红花椒油，按体积比1:20加入甲醇，使用恒温振荡器40℃振荡1h，转速160rpm，再超声5min，将浸提液移入离心管中4000r/min离心15min后取上清液；

（2）将上清液用正己烷进行萃取，料液比1：2，萃取3次，将萃取的下层清液过碱性三氧化二铝柱，所得层析液过0.22 μm有机系滤膜，最后将滤液用旋转蒸发仪45℃（真空度0.09Mpa）减压蒸干2h，得粗提物；

（3）取10mg粗提物溶于20mL色谱级甲醇中，加入20mg的铁粉，放入血清瓶中，将其进行紫外照射处理，紫外照射条件为紫外灯功率20w，紫外线波长为254nm，物品距离紫外灯20cm，照射时间为6小时，用旋转蒸发仪45℃（真空度0.09Mpa）减压蒸干，蒸干时间1h即可获得羟基-γ-山椒素。

实施例3

（1）取30mL红花椒油，按体积比1:20加入甲醇，使用恒温振荡器40℃振荡1h，转速160rpm，再超声5 min，将浸提液移入离心管中4000r/min离心15min后取上清液；

（2）将上清液用正己烷进行萃取，料液比1：2，萃取3次，将萃取的下层清液过碱性三氧化二铝柱，所得层析液过0.22μm有机系滤膜，最后将滤液用旋转蒸发仪45℃（真空度0.09Mpa）减压蒸干2h，得粗提物；

（3）取10mg粗提物溶于20mL色谱级甲醇中，加入15mg的铁粉，放入血清瓶中，将其进行紫外照射处理，紫外照射条件为紫外灯功率20w，紫外线波长为254nm，物品距离紫外灯20cm，照射时间为5小时，用旋转蒸发仪45℃（真空度0.09Mpa）减压蒸干，蒸干时间1h即可获得羟基-γ-山椒素。

测试例1

（1）取30mL红花椒油，按体积比1:20加入甲醇，使用恒温振荡器40℃振荡1h，转速160rpm，再超声5 min，将浸提液移入离心管中4000r/min离心15min后取上清液；

（2）将上清液用正己烷进行萃取，料液比1：2，萃取3次，将萃取的下层清液过碱性三氧化二铝柱，所得层析液过0.22μm有机系滤膜，最后将滤液用旋转蒸发仪45℃（真空度0.09Mpa）减压蒸干2h，得粗提物；

（3）取10mg粗提物溶于20mL色谱级甲醇中，加入20mg的铁粉，放入血清瓶中，待反应结束后，用旋转蒸发仪45℃（真空度0.09Mpa）减压蒸干，蒸干时间1h即可获得羟基-γ-山椒素。

测试例2

将上述制备得到的物质进行光谱检测，采用高效液相色谱法（HPLC）进行检测，检测条件为色谱柱：MN Nucleodur 1100 - 5 C18 柱(ø 4×125 mm, 5 μm)；流动相：A 水；B乙腈；流速：0.5 mL/min；柱温：25℃；紫外检测波长：270 nm；进样量：20 µL。洗脱程序如表1所示。

表1 HPLC洗脱程序

根据HPLC分析结果，如图1所示，实施例1制备得到的物质中羟基-γ-山椒素的纯度为99.18%。如图2所示，实施例2制备得到的物质中羟基-γ-山椒素的纯度为98.96%。如图3所示，实施例3制备得到的物质中羟基-γ-山椒素的纯度为98.91%。测试例1制备得到的物质中羟基-γ-山椒素为79%，羟基-γ-异山椒素为12%。

Claims (10)

1.一种制备羟基-γ-山椒素的方法，其特征在于：该制备方法如下：

（1）以花椒油作为原料，向花椒油中加入甲醇，然后依次进行震荡、超声、离心，获取上清液；

（2）向上清液中加入正己烷进行萃取，得到下层清液；

（3）对下层清液进行层析、过滤，最终将滤液进行减压蒸干，获得粗提取物；

（4）粗提取物溶于甲醇后加入铁粉转移至血清瓶内，进行紫外灯照射，照射结束后进行减压蒸干即可获得羟基-γ-山椒素。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：花椒油与甲醇的体积比为1:20，所述花椒油为红花椒油。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中采用恒温震荡器震荡，温度为40℃，震荡时间为1h，转速为160rpm。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中超声时间为5min。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中离心速度为4000r/min，离心时间为15min。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述上步骤（2）中上清液和正己烷的料液比1：2，萃取次数3次；所述步骤（2）过滤为0.22μm有机系滤膜过滤。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（3）减压蒸干采用旋转蒸发仪减压蒸干，干燥条件为真空度0.09Mpa，温度为45℃，干燥时间2h。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（4）中甲醇为色谱级甲醇，用量20ml，所述铁粉为10~20mg。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述紫外灯功率为20w，波长为254nm，照射的距离为20cm，照射的时间为4~6h。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（4）减压蒸干采用旋转蒸发仪减压蒸干，干燥条件为真空度0.09Mpa，温度为45℃，干燥时间1h。