CN105693675A - 一种从万寿菊中提取黄酮类化合物组分的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种从万寿菊中提取黄酮类化合物组分的方法，它包括以下步骤：将万寿菊干花干燥后磨成粉末，用乙醇浸泡或回流提取，过滤的滤液旋转蒸发至干后溶于甲醇-水混合溶剂中；进行一维液相色谱：以DAISO C18为色谱柱，A相水、B相甲醇为流动相，B相浓度50-55％等度洗脱20min，根据紫外吸收光谱收集11-14分钟洗脱液作为目的组分，旋转蒸发至干后再溶于甲醇-水混合溶剂；进行二维液相色谱：以AcchromX-Amide为色谱柱，A相水、B相乙腈为流动相，B相浓度92-98％等度洗脱40min，根据紫外吸收光谱收集12-17分钟洗脱液作为目的组分，旋转蒸发至干得到目的黄酮类化合物组分。
Description
技术领域
本发明涉及植物有效成分提取技术领域，具体涉及一种从万寿菊中提取黄酮类化合物组分的方法。
背景技术
黄酮类化合物广泛存在于自然界中，是一类重要的天然有机化合物。这类含有氧杂环的化合物多存在于高等植物及蕨类植物中，特别在在各类菊花中普遍存在。黄酮类化学结构复杂多样，生物活性多种多样，引起了国内外的广泛重视，研究进展很快，其母核结构如下：
万寿菊，又名金菊花，学名Tageteserecta，菊科万寿菊属，为一年生草本植物，除具有观赏价值外，还具有很好的药用价值。万寿菊花中所含的黄酮类化合物具有抗炎、抗过敏、降血压、抗心律失常、抗血小板凝集、抗氧化等作用，对万寿菊中黄酮类化合物的有效提取，将有利于万寿菊资源的综合利用。
到目前为止，在万寿菊中提取黄酮类化合物组分虽已有报道，但一般都是传统分离方法，且得到样品纯度较低，制备工艺效率相对不好。如公开号为CN102516335A的中国发明专利“一种从万寿菊残渣中提取黄酮类化合物的方法”，该方法采取传统有机溶剂萃取的方法，可重复性差，提取效率低。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对以上现有技术问题的不足，提供一种从万寿菊中提取黄酮类化合物组分的方法，该方法直接以万寿菊花为原料，采用二维高效液相色谱进行分离纯化，经过工艺摸索和参数优化，提取效率高，目的产物纯度高，可推广规模化生产。
本发明所采用的技术方案为：
一种从万寿菊中提取黄酮类化合物组分的方法，该方法包括以下步骤：
(1)以万寿菊干花为原料，干燥后磨成粉末状得到万寿菊粗粉，用乙醇浸泡或者回流提取，然后过滤，取滤液重复1-3次，最终所得滤液进行旋转蒸发至干得粗提物，粗提物再溶于甲醇-水二元混合溶剂中，进行减压抽滤，得到粗提物浓度为50-500mg/mL的提取液；
(2)对提取液进行一维液相色谱分离：采用的色谱柱为反相色谱柱DAISOC18，采用的流动相为A相水、B相甲醇的二元流动相，进样量为100-1000μL/针，连续进样，流动相流速为6-16mL/min，洗脱方式为B相浓度50-55％(即按体积百分比B相50-55％、A相45-50％配比而成的溶液，下同理)等度洗脱20min，检测器为紫外检测器、检测波长200-260nm，根据紫外吸收光谱收集11-14分钟洗脱液作为目的组分，旋转蒸发浓缩至干，得到一维液相组分；
(3)使用甲醇-水二元混合溶剂溶解一维液相组分，溶解至浓度为50-100mg/mL；
(4)进行二维液相色谱分离：采用的色谱柱为AcchromX-Amide色谱柱，采用的流动相为A相水、B相乙腈的二元流动相，进样量为10-500μL/针，连续进样，流动相流速为2-4mL/min，洗脱方式为B相浓度92-98％等度洗脱40min，检测器为紫外检测器、检测波长200-260nm，根据紫外吸收光谱收集12-17分钟洗脱液作为目的组分，旋转蒸发浓缩至干，得到目的产物黄酮类化合物组分。
作为优选，所述步骤(1)、(3)中甲醇-水二元混合溶剂中甲醇体积分数为90-99％。
作为优选，所述步骤(2)中色谱柱的尺寸为直径20mm、长度250mm，其中填料粒径为8μm，使用时柱温为室温或25-40℃。
作为优选，所述步骤(2)中等度洗脱方式为B相浓度53％等度洗脱20min。
作为优选，所述步骤(4)中色谱柱的尺寸为直径10mm、长度250mm，其中填料粒径为8μm，使用时柱温为室温或25-40℃。
作为优选，所述步骤(4)中洗脱方式为B相浓度95％等度洗脱40min。
由于本发明原料万寿菊中的物质极性比较集中，所以本发明选用二维高效液相色谱进行有效组分的提取。
在一维分离的条件选择上：首先，所分的样品量较大，所以挑选甲醇-水作为流动相进行分离，既成本较低，又毒性较小，适合大规模生产所用；其次，在该样品中所含的组分多，C18柱可以对其进行分离，并结合甲醇-水流动相，可以在等度的条件下就完成样品的一维分离，并得到较高的纯度，且柱残留较少；最后，通过对样品进行梯度洗脱试验，我们发现样品中所含的物质极性较为相近，出峰时间集中，而采用本发明等度洗脱的方式可以很好地完成初步分离，经过条件摸索发现53％甲醇-47％水是最佳的洗脱条件，可以一维分离收集到最高纯度的黄酮类化合物组分，并且等度洗脱的方式利于开展连续多次上样，既减少了色谱柱出峰的死时间，又节约了冲柱及平衡时间，可以在更短的时间内完成黄酮类化合物组分的粗分离，适合于扩大到工业生产。
在二维分离的条件选择上：首先，一维分离所得到的粗组分中所含的杂质已相对较小，但是这些杂质的极性与性质和黄酮类化合物组分接近，而X-Amide柱具备将这些组分进行分离的能力，分离度好，选择性高，柱效高；其次，一维分离所得样品量已经变少，使用乙腈-水来进行分离，可以使X-Amide柱更好地发挥作用；最后，经过梯度洗脱试验，发现较好的洗脱条件为95％乙腈-5％水等度洗脱，得到的黄酮类化合物组分纯度相对较高。
与现有技术中相比，本发明具有以下优点和显著效果：
(1)直接以万寿菊干花为原料，药材来源广；
(2)方法简单易行，可操作性强，仪器自动化程度高，常温常压下就可进行，重复性好，得到的物质组分批次之间一致性高，经工艺放大后可以运用于工业生产；
(3)通过各工艺条件的良好协同作用和工艺参数的优化，可以分离得到纯度较高的黄酮类化合物组分；
(4)重复性好，批次间一致性程度高，加上本发明万寿菊样品中物质极性比较集中，适合采用连续进样的方式，不仅有效减少了柱洗脱时间，可以在更短的时间内完成万寿菊中黄酮类化合物组分的制备，分离周期短，分离效率高，是一种缩短样品制备时间的的理想方法。
附图说明
图1所示的是本发明实施例1从万寿菊中提取黄酮类化合物组分的一维高效液相色谱图；
图2所示的是本发明实施例1从万寿菊中提取黄酮类化合物组分的二维高效液相色谱图；
图3所示的是本发明实施例2从万寿菊中提取黄酮类化合物组分的一维高效液相色谱图；
图4所示的是本发明实施例2从万寿菊中提取黄酮类化合物组分的二维高效液相色谱图；
图5所示的是本发明实施例3从万寿菊中提取黄酮类化合物组分的一维高效液相色谱图；
图6所示的是本发明实施例3从万寿菊中提取黄酮类化合物组分的二维高效液相色谱图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步具体描述。应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本发明使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。
1、原料、材料：
原料万寿菊采摘自辽宁法库县并经过鉴定。
2、试剂：
分析纯水由密立博纯水仪生产；无水乙醇够自天津市康科德科技有限公司；色谱级甲醇、乙腈购自Honeywell公司。
3、仪器设备：
超微粉碎机购自山东三清不锈钢设备有限公司；恒温鼓风干燥箱购自上海一恒科学仪器有限公司；旋转蒸发仪上海亚容生化仪器厂；DAISOC18反相色谱柱购自DAISO公司、AcchromX-Amide色谱柱购自浙江华谱新创科技有限公司；制备型高效液相色谱仪购自博纳艾吉尔公司。
实施例1：
本实施例从万寿菊中提取黄酮类化合物组分的方法，包括以下步骤：
以万寿菊干花为原料，磨成粉末状后用乙醇提取旋蒸得到干燥的万寿菊粗粉后称取5g，溶于50mL95％的甲醇-水溶液，制得万寿菊提取物溶液，浓度为100mg/mL，过0.45μm微孔滤膜，进行一维液相色谱制备。一维液相色谱采用反相色谱柱DAISOC18(250mm×20mmi.d.，8μm)，流动相采用的为有机相与水相混合，其中A相是水，B相是甲醇，等度洗脱方式：B相浓度53％等度洗脱20min。采用紫外检测器210nm和260nm为双选择吸收波长，制备温度为室温，进样量为500μL/针，流动相流速为12mL/min，根据紫外吸收光谱收集图1中4号峰(11-12分钟洗脱液)作为目的馏分，进行旋转蒸发浓缩至干，为一维制备黄酮类化合物组分组分。用95％的甲醇-水溶液溶解黄酮类化合物组分组分的粗品，浓度为80mg/mL，经微孔滤膜过滤，进行二维液相色谱制备，色谱柱为AcchromX-Amide色谱柱(250mm×10mmi.d.；8μm)，流动相采用的为有机相与水相混合，其中A相是水，B相是乙腈，采用B相浓度96％等度洗脱40分钟。采用紫外检测器210nm选择吸收波长，制备温度为室温，进样量为50μL/针，流动相流速为3mL/min，根据紫外吸收光谱收集图2中4-1号峰(15-17分钟洗脱液)作为目的馏分，旋转蒸发至干，得到黄酮类化合物组分。
实施例2：
本实施例从万寿菊中提取黄酮类化合物组分的方法，包括以下步骤：
以万寿菊干花为原料，磨成粉末状后用乙醇提取旋蒸得到干燥的万寿菊粗粉后称取5g，溶于50mL95％的甲醇-水溶液，制得万寿菊提取物溶液，浓度为100mg/mL，过0.45μm微孔滤膜，进行一维液相色谱制备。一维液相色谱采用反相色谱柱DAISOC18(250mm×20mmi.d.，8μm)，流动相采用的为有机相与水相混合，其中A相是水，B相是甲醇，等度洗脱方式：B相浓度50％等度20min。采用紫外检测器210nm和260nm为双选择吸收波长，制备温度为室温，进样量为500μL/针，流动相流速为12mL/min，根据紫外吸收光谱收集图3中4号峰(10-11分钟洗脱液)作为目的馏分，进行旋转蒸发浓缩至干，为一维制备黄酮类化合物组分组分。用95％的甲醇-水溶液溶解黄酮类化合物组分组分的粗品，浓度为80mg/mL，经微孔滤膜过滤，进行二维液相色谱制备，色谱柱为AcchromX-Amide色谱柱(250mm×10mmi.d.；8μm)，流动相采用的为有机相与水相混合，其中A相是水，B相是乙腈，采用96％B相等度40分钟洗脱。采用紫外检测器210nm选择吸收波长，制备温度为室温，进样量为50μL/针，流动相流速为3mL/min，根据紫外吸收光谱收集图4中4-1号峰(16-17分钟洗脱液)作为目的馏分，旋转蒸发至干，得到黄酮类化合物组分。
实施例3：
本实施例从万寿菊中提取黄酮类化合物组分的方法，包括以下步骤：
以万寿菊干花为原料，磨成粉末状后用乙醇提取旋蒸得到干燥的万寿菊粗粉后称取5g，溶于50mL95％的甲醇-水溶液，制得万寿菊提取物溶液，浓度为100mg/mL，过0.45μm微孔滤膜，进行一维液相色谱制备。一维液相色谱采用反相色谱柱DAISOC18(250mm×20mmi.d.；8μm)，流动相采用的为有机相与水相混合，其中A相是水，B相是甲醇，等度洗脱方式：B相浓度54％等度洗脱20min。采用紫外检测器210nm和260nm为双选择吸收波长，制备温度为室温，进样量为500μL/针，流动相流速为12mL/min，收集11.5-12.5分钟的馏分，进行旋转蒸发浓缩至干，为一维制备黄酮类化合物组分。用95％的甲醇-水溶液溶解黄酮类化合物组分的粗品，浓度为80mg/mL，经微孔滤膜过滤，进行二维液相色谱制备，色谱柱为AcchromX-Amide色谱柱(250mm×10mmi.d.；8μm)，流动相采用的为有机相与水相混合，其中A相是水，B相是乙腈，采用B相浓度96％等度40分钟洗脱。采用紫外检测器210nm选择吸收波长，制备温度为室温，进样量为50μL/针，流动相流速为3mL/min，收集12-13分钟的馏分，旋转蒸发至干，得到黄酮类化合物组分。
对比图1、图3、图5及图2、图4、图6，可以得出，本发明从万寿菊中提取黄酮类化合物组分的方法重复性好，批次间一致性高，可操作程度强，适合工业化推广生产。
本发明实施例涉及到的材料、试剂和实验设备，如无特别说明，均为符合有效成分提取的市售产品。
以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术的前提下，还可以做出改进和润饰，这些改进和润饰也应属于本发明的专利保护范围。与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。
Claims (6)
1.一种从万寿菊中提取黄酮类化合物组分的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)以万寿菊干花为原料，干燥后磨成粉末状得到万寿菊粗粉，用乙醇浸泡或者回流提取，然后过滤，取滤液重复1-3次，最终所得滤液进行旋转蒸发至干得粗提物，粗提物再溶于甲醇-水二元混合溶剂中，进行减压抽滤，得到粗提物浓度为50-500mg/mL的提取液；
(2)对提取液进行一维液相色谱分离：采用的色谱柱为反相色谱柱DAISOC18，采用的流动相为A相水、B相甲醇的二元流动相，进样量为100-1000μL/针，连续进样，流动相流速为6-16mL/min，洗脱方式为B相浓度50-55％等度洗脱20min，检测器为紫外检测器、检测波长200-260nm，根据紫外吸收光谱收集11-14分钟洗脱液作为目的组分，旋转蒸发浓缩至干，得到一维液相组分；
(3)使用甲醇-水二元混合溶剂溶解一维液相组分，溶解至浓度为50-100mg/mL；
(4)进行二维液相色谱分离：采用的色谱柱为AcchromX-Amide色谱柱，采用的流动相为A相水、B相乙腈的二元流动相，进样量为10-500μL/针，连续进样，流动相流速为2-4mL/min，洗脱方式为B相浓度92-98％等度洗脱40min，检测器为紫外检测器、检测波长200-260nm，根据紫外吸收光谱收集12-17分钟洗脱液作为目的组分，旋转蒸发浓缩至干，得到目的产物黄酮类化合物组分。
2.根据权利要求1所述的一种从万寿菊中提取黄酮类化合物组分的方法，其特征在于：所述步骤(1)、(3)中甲醇-水二元混合溶剂中甲醇体积分数为90-99％。
3.根据权利要求1所述的一种从万寿菊中提取黄酮类化合物组分的方法，其特征在于：所述步骤(2)中色谱柱的尺寸为直径20mm、长度250mm，其中填料粒径为8μm，使用时柱温为室温或25-40℃。
4.根据权利要求1所述的一种从万寿菊中提取黄酮类化合物组分的方法，其特征在于：所述步骤(2)中等度洗脱方式为B相浓度53％等度洗脱20min。
5.根据权利要求1所述的一种从万寿菊中提取黄酮类化合物组分的方法，其特征在于：所述步骤(4)中色谱柱的尺寸为直径10mm、长度250mm，其中填料粒径为8μm，使用时柱温为室温或25-40℃。
6.根据权利要求1所述的一种从万寿菊中提取黄酮类化合物组分的方法，其特征在于：所述步骤(4)中洗脱方式为B相浓度95％等度洗脱40min。
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