CN105646429B - 一种制备高纯度儿茶素没食子酸酯cg的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种制备高纯度儿茶素没食子酸酯CG的方法。本发明首先取绿茶茶多酚样品，加溶剂溶解；再取茶多酚溶解样品适量于密闭容器，高温转化；然后取转化液，采用快速制备液相色谱进行分离，收集儿茶素没食子酸酯CG馏分；馏分通过旋转蒸发浓缩制得儿茶素没食子酸酯CG单体化合物粗品；最后取粗品适量，加溶剂溶解；利用高压制备液相色谱分离纯化上述单体化合物粗品，收集儿茶素没食子酸酯CG馏分；馏分通过旋转蒸发浓缩、冷冻干燥和真空干燥后制得儿茶素没食子酸酯CG高纯单体化合物。本发明采用高温转化的方法，提高了绿茶茶多酚溶液中儿茶素没食子酸酯CG的含量。

Description

一种制备高纯度儿茶素没食子酸酯CG的方法

技术领域

本发明涉及一种制备高纯度儿茶素没食子酸酯CG的方法，尤其涉及表型儿茶素异构体化合物的高温转化及其单体化合物的制备、分离和纯化的方法。

背景技术

茶叶中的儿茶素主要为表型儿茶素，即表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG、表没食子儿茶素EGC、表儿茶素没食子酸酯ECG、表儿茶素EC，它们约占儿茶素总量的60~80%。其中EGCG是绿茶茶多酚中含量最高的物质，也是目前公认的茶叶中最主要的抗氧化成分。然而现有研究已经证实，表型儿茶素的异构体如儿茶素没食子酸酯CG等（其化学结构如附图1所示）在某些方面表现出较强的生理活性，如抗氧化和清除自由基活性等。

儿茶素单体化合物主要是从茶叶或茶叶提取物中进行提取，常用的分离纯化方法有液液萃取、柱层析、中低压柱色谱、高压制备液相色谱和高速逆流色谱分离等。儿茶素的分离纯化不乏其他方法，也常常采用两种或多种方法联合使用。文献及专利中常见表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG、表儿茶素没食子酸酯ECG等的分离纯化报道，但制备儿茶素没食子酸酯CG单体化合物的方法较少。公开专利CN 102120738 A《一种非表型儿茶素单体的制备方法》，以儿茶素单体化合物为原料，经高温加压热转化和凝胶介质分离等过程制备非表型儿茶素。如以表儿茶素没食子酸酯ECG为原料，制得了纯度98.6%的儿茶素没食子酸酯CG单体化合物，但该方法原料成本高；同时，在转化过程中加入钠盐或钾盐的碱金属，引入了无机盐等杂质，且采用凝胶分离纯化的方法，所制备的单体化合物纯度较低。

鉴于儿茶素没食子酸酯CG良好的营养保健和生理药理作用，在茶叶及茶叶相关制品的质量控制、生产工艺的优化及其基础功效学的研究过程中，需要高纯度的儿茶素没食子酸酯CG单体化合物。

发明内容

本发明的目的是制备儿茶素没食子酸酯CG纯度大于99%的高纯单体化合物。本发明研制的高纯度儿茶素没食子酸酯CG单体化合物，可用于茶叶及其制品中相关物质含量监测的质量控制，相关物质基础营养、保健、生理、药理学功效的研究，以及相关物质对照品和标准物质的研制等领域。

本发明是通过如下技术方案实现的，其制备流程如附图2所示。

步骤1.茶多酚溶液的配制

步骤1-1.茶多酚样品的筛查

绿茶茶多酚中儿茶素的含量较高，优选绿茶茶多酚。市售绿茶茶多酚中儿茶素（总量）的含量有20%、40%、60%、80%、90%、95%、98%等诸多品种，优选儿茶素（总量）含量较高的品种。市售绿茶茶多酚中咖啡因的含量为0%~50%不等，优选咖啡因含量较低的品种。

步骤1-2.料液的配制

称取步骤1-1优选的一定量的绿茶茶多酚样品，加适量溶剂，搅拌超声溶解，配制一定浓度的料液。溶剂可选择超纯水、甲醇、乙腈、乙醇等或其混合溶液，优选超纯水作为溶剂；料液浓度可以配制100~1000 mg/mL，优选300 mg/mL。

步骤2.料液的高温转化

取适量配制的料液，于适当温度转化一定时间。转化温度可选100~150 ̊C，优选130̊C。转化时间可选10~300 min，优选120 min。

步骤3.转化液的快速制备液相色谱分离

步骤3-1.快速制备液相色谱分离

快速制备液相色谱可以选择多种类型的色谱填料，如C18、C8、C4等，优选C18填料。填料粒径可以选择5~100 μm，优选20~40 μm的填料。快速色谱柱的尺寸规格以及填料装填质量可以选择多种，本发明使用装填质量为120 g的填料。

快速制备液相色谱分离中，可以选择多种流动相体系，如水、甲醇、乙腈、乙醇等，或其适当比例的混合液，本发明中采用甲醇-水体系。流动相中可以添加不同种类及不同含量的调节剂，如甲酸、乙酸、磷酸等，或其相应的缓冲盐体系，本发明采用水相中添加0.1%（体积比）的乙酸。

快速制备液相色谱分离中，可以优化多种分离条件，如上样量、流速、等度或梯度洗脱方式等。本发明采用粒径为20~40 μm，填料质量120 g的快速制备液相色谱柱，优化的快速制备液相色谱分离条件如下：流动相A：甲醇，流动相B：含0.1%（体积比）乙酸的水溶液；流速：50 mL/min；梯度洗脱：15%A (0 min) – 20%A (5 min) – 25%A (10 min) – 30%A(25 min) – 35%A (30 min) – 50%A (40 min)；上样量：3 mL；检测波长：278 nm。

取适量步骤2制备的转化液，用0.22 μm微孔滤膜过滤，在步骤3-1优选的快速制备液相色谱分离条件下，收集33.2~34.7 min的儿茶素没食子酸酯CG馏分。多次进样，收集合并儿茶素没食子酸酯CG馏分。

步骤3-2.快速制备液相色谱收集儿茶素没食子酸酯CG馏分纯度的检测

采用高效液相色谱法检测快速制备液相色谱收集儿茶素没食子酸酯CG馏分的纯度，结果显示纯度大于95%。

所使用的高效液相色谱分析方法如下：色谱柱：C18，5 μm, 4.6*250mm；色谱柱温度：35 ̊C；流动相A：甲醇；流动相B：含0.1%（体积比）乙酸的水溶液；等度洗脱：30%A；流速：1mL/min；检测波长：278 nm；进样量：10 μL。

步骤3-3.对步骤3-1快速制备液相色谱收集的儿茶素没食子酸酯CG馏分，采用旋转蒸发的方法去除甲醇，浓缩液再经过冷冻干燥，制得儿茶素没食子酸酯CG单体化合物粗品。

步骤4.儿茶素没食子酸酯CG单体化合物粗品的高压制备液相色谱分离

步骤4-1.高压制备液相色谱上样液的配制

称取一定量步骤3-3制备的儿茶素没食子酸酯CG单体化合物粗品，加适量溶剂溶解，配制一定浓度的溶液。本发明中，浓度为40 mg/mL，溶剂为30%（体积比）甲醇水溶液。

步骤4-2.高压制备液相色谱分离

高压制备液相色谱分离中，可选择不同种类和不同粒径的色谱填料，以及不同尺寸规格和填料质量的色谱柱。本发明中，在优选条件下，采用C18填料，填料粒径为10 μm，色谱柱尺寸为21.5*250 mm。

对优选的高压制备液相色谱柱，可以优化多种分离条件，如上样量、流速、等度或梯度洗脱方式等。本发明中优化的高压制备液相色谱分离条件如下：流动相A：甲醇；流动相B：含0.1%（体积比）乙酸的水溶液；等度洗脱：30%A；流速：25 mL/min；上样量：2 mL；检测波长：278 nm。

在优化的高压制备液相色谱分离条件下，收集儿茶素没食子酸酯CG馏分。多次进样，收集并合并儿茶素没食子酸酯CG馏分。

步骤4-3.高压制备液相色谱收集儿茶素没食子酸酯CG馏分纯度的检测

对高压制备液相色谱收集的儿茶素没食子酸酯CG馏分，进行高效液相色谱分析，分析方法如步骤3-2，结果显示儿茶素没食子酸酯CG的含量大于99%。

步骤4-4.高压制备液相色谱收集儿茶素没食子酸酯CG馏分的浓缩干燥

对步骤4-2高压制备液相色谱收集的儿茶素没食子酸酯CG馏分，通过旋转蒸发、冷冻干燥和真空干燥，制得儿茶素没食子酸酯CG高纯单体化合物。

步骤4-5.儿茶素没食子酸酯CG高纯单体化合物纯度的检验

分别称取一定量步骤4-4制备的儿茶素没食子酸酯CG高纯单体化合物，加适量50%（体积比）甲醇溶液溶解，配制浓度为0.5 mg/mL的溶液，进行高效液相色谱分析检测，分析方法如步骤3-2所示。采用面积归一化法计算相应主成分的含量，结果显示儿茶素没食子酸酯CG的HPLC纯度大于99%。

本发明以绿茶茶多酚为原料，经过高温转化、快速制备液相色谱和高压制备液相色谱分离纯化，制备了高纯度儿茶素没食子酸酯CG单体化合物，本发明具有如下有益效果：

本发明所用原料市场供应充足，绿茶茶多酚中儿茶素含量较高，适于作为原料制备本发明所述的儿茶素没食子酸酯CG高纯单体化合物。

本发明采用高温转化的方法，提高了绿茶茶多酚溶液中儿茶素没食子酸酯CG的含量。

本发明采用快速制备液相色谱的方法进行料液的初步分离，茶多酚转化液中组成成分复杂，含有大量的表型儿茶素及其他化合物，快速制备液相色谱采用C18填料，分离效率较高，采用粒径20~40 μm的填料，上样量大，制备效率高。

本发明采用高压制备液相色谱的方法，产物的杂质含量少，HPLC纯度高。

本发明制备的产物含量高，HPLC纯度大于99%，无机金属、水分及挥发性等杂质含量低。

本发明可同时制备儿茶素C、表儿茶素EC、表没食子儿茶素EGC、表儿茶素没食子酸酯ECG、表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG、没食子儿茶素没食子酸酯GCG和没食子儿茶素GC等高纯单体化合物。

本发明技术路线简单，采用快速制备液相色谱结合高压制备液相色谱分离纯化，单次分离时间短，方法优化过程便捷。

本发明易于放大，高温转化、快速制备液相色谱及高压制备液相色谱分离等过程单元均可进行克级至公斤级的制备。

本发明绿色环保，避免了传统提取、萃取分离中使用乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷等有机溶剂；本发明制备分离中使用的甲醇在旋转蒸发过程中可以回收；本发明未引入无机盐、重金属等杂质。

附图说明

图1为儿茶素没食子酸酯CG的化学结构。

图2为儿茶素没食子酸酯CG高纯单体化合物的制备技术流程。

图3为快速制备液相色谱分离绿茶茶多酚高温转化液的色谱图。

图4为高压制备液相色谱分离儿茶素没食子酸酯CG单体化合物粗品的色谱图。

图5为儿茶素没食子酸酯CG高纯单体化合物高效液相色谱法纯度检测的色谱图，HPLC纯度为99.80%。

具体实施方式

以下结合附图对本发明作进一步说明。

如图2所示，茶叶及其制品中儿茶素没食子酸酯CG的含量较低，本发明中采用绿茶茶多酚为原料，料液经高温转化，茶多酚中表儿茶素没食子酸酯ECG部分地转化为相应的异构体儿茶素没食子酸酯CG，提高了料液中儿茶素没食子酸酯CG的含量。在儿茶素单体化合物的制备分离中，需要考虑分离纯化效率、成本以及是否环境友好等。传统的方法如液液萃取技术虽然操作简单，但提纯效率差，有时还需要使用有毒溶剂等；硅胶柱层析等方法，虽然上样量较大，但也存在分离提纯效率低，制备的单体化合物纯度较低；高速逆流色谱可以得到较高纯度的化合物，但制备量低。而柱色谱分离的方法选择空间较大，根据不同的分离纯化目的，可以选择不同类型及规格的填料，如硅胶以及键合不同的官能团等，不同粒径如1.7~100 µm等，不同柱尺寸规格如2.1~50 mm甚至更大的内径，色谱柱长度也可根据需要进行调整，如30~1000 mm甚至更长。因此，使用一定的填料及色谱柱规格，即可进行低压、中压和高压制备液相色谱分离。中低压柱色谱如快速制备液相色谱分离效率稍差，但其上样量大，高压制备液相色谱分离效率高，但上样量稍低；结合中低压快速制备液相色谱及高压制备液相色谱即可实现大量粗品化合物的分离及高纯单体化合物的精制等。

实施例1

称取30 g绿茶茶多酚（总儿茶素含量>98%，咖啡因含量<0.05%）样品，加1000 mL超纯水搅拌超声溶解，置于密闭容器于130 ̊C烘箱高温转化120 min。取适量高温转化液，用0.22 μm微孔滤膜过滤，进行快速制备液相色谱分离。快速制备液相色谱柱为C18型填料，填料质量为120 g，粒径为20~40 μm。分离条件为：流动相A：甲醇，流动相B：含0.1%（体积比）乙酸的水溶液；流速：50 mL/min；梯度洗脱：15%A (0 min) – 20%A (5 min) – 25%A (10min) – 30%A (25 min) – 35%A (30 min) – 50%A (40 min)；上样量：3 mL；检测波长：278nm。分离谱图如附图3所示，收集33.2~34.7 min的儿茶素没食子酸酯CG馏分，采用高效液相色谱法检测馏分纯度，为95.72%。多次进样，收集合并儿茶素没食子酸酯CG馏分，于60 ̊C旋转蒸发除去甲醇并回收，浓缩液再经过冷冻干燥，制得儿茶素没食子酸酯CG单体化合物粗品。称取适量儿茶素没食子酸酯CG单体化合物粗品，用30%（体积比）甲醇水溶液稀释，配制浓度为40 mg/mL的溶液，进行高压制备液相色谱分离。高压制备液相色谱分离条件为：色谱柱：C18，10 μm，21.5*250 mm；流动相A：甲醇；流动相B：含0.1%（体积比）乙酸的水溶液；等度洗脱：30%A；流速：25 mL/min；上样量：2 mL；检测波长：278 nm。儿茶素没食子酸酯CG的高压制备液相色谱分离谱图如附图4所示，收集并合并儿茶素没食子酸酯CG馏分，采用高效液相色谱法检测馏分纯度，为99.81%。儿茶素没食子酸酯CG馏分于60 ̊C旋转蒸发除去甲醇并回收，浓缩液再经过冷冻干燥和真空干燥，制得儿茶素没食子酸酯CG高纯单体化合物。对上述制备的儿茶素没食子酸酯CG高纯单体化合物，再次进行高效液相色谱纯度检测，为99.80%，如附图5所示。

实施例2

称取30 g绿茶茶多酚（总儿茶素含量>98%，咖啡因含量<0.05%）样品，加1000 mL超纯水搅拌超声溶解，置于密闭容器于100 ̊C烘箱高温转化300 min。取适量高温转化液，用0.22 μm微孔滤膜过滤，进行快速制备液相色谱分离。快速制备液相色谱柱为C18型填料，填料质量为120 g，粒径为20~40 μm。分离条件为：流动相A：甲醇，流动相B：含0.1%（体积比）乙酸的水溶液；流速：50 mL/min；梯度洗脱：15%A (0 min) – 20%A (5 min) – 25%A (10min) – 30%A (25 min) – 35%A (30 min) – 50%A (40 min)；上样量：3 mL；检测波长：278nm。收集33.2~34.7 min的儿茶素没食子酸酯CG馏分，采用高效液相色谱法检测馏分纯度，为95.13%。多次进样，收集合并儿茶素没食子酸酯CG馏分，于60 ̊C旋转蒸发除去甲醇并回收，浓缩液再经过冷冻干燥，制得儿茶素没食子酸酯CG单体化合物粗品。称取适量儿茶素没食子酸酯CG单体化合物粗品，用30%（体积比）甲醇水溶液稀释，配制浓度为40 mg/mL的溶液，进行高压制备液相色谱分离。高压制备液相色谱分离条件为：色谱柱：C18，10 μm，21.5*250 mm；流动相A：甲醇；流动相B：含0.1%（体积比）乙酸的水溶液；等度洗脱：30%A；流速：25mL/min；上样量：2 mL；检测波长：278 nm。多次进样，收集并合并儿茶素没食子酸酯CG馏分，采用高效液相色谱法检测馏分纯度，为99.84%。儿茶素没食子酸酯CG馏分于60 ̊C旋转蒸发除去甲醇并回收，浓缩液再经过冷冻干燥和真空干燥，制得儿茶素没食子酸酯CG高纯单体化合物。对上述制备的儿茶素没食子酸酯CG高纯单体化合物，再次进行高效液相色谱纯度检测，为99.84%。

实施例3

称取30 g绿茶茶多酚（总儿茶素含量>98%，咖啡因含量<0.05%）样品，加1000 mL超纯水搅拌超声溶解，置于密闭容器于150 ̊C烘箱高温转化10 min。取适量高温转化液，用0.22 μm微孔滤膜过滤，进行快速制备液相色谱分离。快速制备液相色谱柱为C18型填料，填料质量为120 g，粒径为20~40 μm。分离条件为：流动相A：甲醇，流动相B：含0.1%（体积比）乙酸的水溶液；流速：50 mL/min；梯度洗脱：15%A (0 min) – 20%A (5 min) – 25%A (10min) – 30%A (25 min) – 35%A (30 min) – 50%A (40 min)；上样量：3 mL；检测波长：278nm。收集33.2~34.7 min的儿茶素没食子酸酯CG馏分，采用高效液相色谱法检测馏分纯度，为96.27%。多次进样，收集合并儿茶素没食子酸酯CG馏分，于60 ̊C旋转蒸发除去甲醇并回收，浓缩液再经过冷冻干燥，制得儿茶素没食子酸酯CG单体化合物粗品。称取适量儿茶素没食子酸酯CG单体化合物粗品，用30%（体积比）甲醇水溶液稀释，配制浓度为40 mg/mL的溶液，进行高压制备液相色谱分离。高压制备液相色谱分离条件为：色谱柱：C18，10 μm，21.5*250 mm；流动相A：甲醇；流动相B：含0.1%（体积比）乙酸的水溶液；等度洗脱：30%A；流速：25mL/min；上样量：2 mL；检测波长：278 nm。多次进样，收集并合并儿茶素没食子酸酯CG馏分，采用高效液相色谱法检测馏分纯度，为99.93%。儿茶素没食子酸酯CG馏分于60 ̊C旋转蒸发除去甲醇并回收，浓缩液再经过冷冻干燥和真空干燥，制得儿茶素没食子酸酯CG高纯单体化合物。对上述制备的儿茶素没食子酸酯CG高纯单体化合物，再次进行高效液相色谱纯度检测，为99.93%。

Claims (4)

1.一种制备儿茶素没食子酸酯CG的方法，其特征在于包括如下步骤：

步骤（1）：取一定量的绿茶茶多酚样品，加适量溶剂溶解；

步骤（2）：取步骤（1）制备的茶多酚溶解样品适量于密闭容器，高温转化一定时间；

步骤（3）：取步骤（2）制备的转化液，采用快速制备液相色谱进行分离，收集儿茶素没食子酸酯CG馏分；多次进样，收集且合并相同组分的馏分；馏分通过旋转蒸发浓缩并除去甲醇，浓缩液再经冷冻干燥，制得儿茶素没食子酸酯CG单体化合物粗品；

步骤（4）：取步骤（3）制得的儿茶素没食子酸酯CG单体化合物粗品适量，加一定溶剂溶解；利用高压制备液相色谱分离纯化上述单体化合物粗品，收集儿茶素没食子酸酯CG馏分；多次进样，收集且合并相同组分的馏分；馏分通过旋转蒸发浓缩并除去甲醇，浓缩液再进行冷冻干燥和真空干燥，制得儿茶素没食子酸酯CG单体化合物；

步骤（3）中，快速制备液相色谱的色谱填料选用硅胶键合C18、C8、C4；填料粒径选择5~100 μm；

快速制备液相色谱收集儿茶素没食子酸酯CG馏分旋转蒸发浓缩的温度选择40~80 ̊C；

快速制备液相色谱分离中，采用如下分离条件：流动相A：甲醇，流动相B：体积比为0.1%的乙酸水溶液；流速：50 mL/min，梯度洗脱：15%A 对应于0 min – 20%A对应于5 min – 25%A对应于10 min– 30%A对应于25 min – 35%A对应于30 min – 50%A对应于40 min；上样量：3 mL；检测波长：278 nm；

步骤（4）中，溶剂采用超纯水、甲醇、乙腈、乙醇或其混合溶液进行溶解，对儿茶素没食子酸酯CG单体化合物粗品，配制1~1000 mg/mL的浓度；

高压制备液相色谱柱的色谱填料，采用硅胶键合C18填料，填料粒径为10 μm，色谱柱尺寸为21.5*250 mm；

高压制备液相色收集儿茶素没食子酸酯CG馏分旋转蒸发浓缩的温度可选择40~80 ̊C；

高压制备液相色谱分离中，采用如下分离条件：流动相A：甲醇；流动相B：体积比为0.1%的乙酸水溶液；等度洗脱：30%A；流速：25 mL/min；上样量：2 mL；检测波长：278 nm。

2.根据权利要求1所述的一种制备儿茶素没食子酸酯CG的方法，其特征在于：步骤（1）中，绿茶茶多酚样品选择总儿茶素含量大于98%及咖啡因含量小于0.1%的产品。

3.根据权利要求1所述的一种制备儿茶素没食子酸酯CG的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述溶剂为超纯水、甲醇、乙腈、乙醇及其混合溶液，茶多酚样品的浓度为100~1000 mg/mL。

4.根据权利要求1所述的一种制备儿茶素没食子酸酯CG的方法，其特征在于：步骤（2）中，高温转化温度可选100~150 ̊C，高温转化时间可选10~300 min。