CN110563584A - 提取纯化胎菊中绿原酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提取纯化胎菊中绿原酸的方法。以粉碎过筛后的胎菊为原料，用乙醇水溶液为溶剂进行超声提取，利用大孔树脂初步分离以及利用乙酸乙酯/石油醚反相分离，再利用聚酰胺树脂柱纯化分离，经过重结晶得到绿原酸。本发明的方法重现性好，适合工业化生产。

Description

提取纯化胎菊中绿原酸的方法

技术领域

本发明涉及一种提取纯化胎菊中绿原酸的方法。

背景技术

胎菊(Fetal chrysanthemum)是杭白菊中最优的一种。采摘花朵没有完全开放的杭白菊，就可以得到胎菊。胎菊能散风清热、平肝明目、清热解毒。胎菊中含有多种有效成分，如挥发油、黄酮类物质、绿原酸、多糖类、3,5-O-双咖啡酰基奎宁酸等。绿原酸是胎菊中一种重要成分，具有抗病毒、抗氧化、抗衰老、免疫调节、降糖、增加白细胞数量等多种生理作用。

近几年，绿原酸在人们的生活中被广泛使用，我们平时用的绿原酸主要有两个来源：(1)人工合成，这种方法目前还不太成熟，应用较少；(2)从中草药中提取。目前，关于绿原酸的提取研究主要集中在金银花、杜仲等天然产物上，然而市场上绿原酸的供应量不足，导致绿原酸的价格昂贵。因此，亟需扩大绿原酸的提取来源并研究其提纯工艺。

胎菊中绿原酸的含量较高，可以作为提取绿原酸的原料，而从胎菊中提取绿原酸的研究不多。例如，“胎菊中绿原酸提取工艺研究”(赵昕梅等，《食品保健与工艺技术》，第63-64页，2014年12月)考察了提取溶剂，样品粒度，超声波处理时间和提取次数对提取胎菊中绿原酸含量的影响，但是，该文中并未提供绿原酸的纯化方法。因此，仍然需要开发一种重现性好且适合工业化生产的绿原酸提取纯化方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提取纯化胎菊中绿原酸的方法，该方法重现性好，适合工业化生产。进一步地，本发明的方法成本较低。本申请通过如下技术方案达到上述目的。

本发明提供一种提取纯化胎菊中绿原酸的方法，其包括如下步骤：

(1)将粉碎后的胎菊置于乙醇水溶液中，并超声30～70min，然后过滤、浓缩和离心，得到胎菊粗提液；

(2)将胎菊粗提液置于大孔树脂柱中，用25～35vol％的乙醇水溶液解吸，收集解吸液，并浓缩，得到初步分离的浓缩液；

(3)将初步分离的浓缩液用乙酸乙酯和石油醚反相分离，得到反相分离液，并浓缩，得到反相分离浓缩液；

(4)将反相分离浓缩液置于预处理的聚酰胺树脂柱中，先用pH值为3～4的稀盐酸冲洗，然后用不同浓度的乙醇水溶液梯度洗脱，收集部分洗脱液，并浓缩、过滤和重结晶，得到绿原酸。

根据本发明的方法，优选地，步骤(1)中，所述乙醇水溶液的乙醇浓度为40～80vol％；所述乙醇水溶液与胎菊的质量比为10～18:1；且所述乙醇水溶液用稀酸调节pH值至1.5～3；步骤(1)中，超声之前，还包括将粉碎的胎菊过15～35目筛。

根据本发明的方法，优选地，步骤(1)中，所述超声的功率为60～100W，超声的温度为45～55℃，超声的时间为40～60min。

根据本发明的方法，优选地，步骤(2)中，所述大孔树脂为天津市光复精细化工研究所的NKA-9大孔树脂；乙醇水溶液的流速为2.5～3BV/h；其中，所述的BV表示柱体积单位。

根据本发明的方法，优选地，步骤(3)中，所述反相分离包括：先将初步分离的浓缩液调节pH值为1.5～2.5，然后用4～6倍体积的乙酸乙酯分两次萃取，合并乙酸乙酯萃取液，并向乙酸乙酯萃取液中加入0.2～0.5倍体积的石油醚，搅拌5～10min，静置分层，取下层溶液，即得反相分离液。

根据本发明的方法，优选地，步骤(4)中，所述预处理包括将聚酰胺树脂用90～98vol％乙醇水溶液浸泡12～36h，然后用水洗涤至中性，再用3～8wt％醋酸水溶液浸泡6～15h，然后用水洗至中性，再用3～8wt％氢氧化钠水溶液浸泡6～15h，最后用去离子水洗至中性。

根据本发明的方法，优选地，步骤(4)中，所述稀盐酸的用量为1.5～2.5BV。

根据本发明的方法，优选地，步骤(4)中，所述不同浓度的乙醇水溶液包括10vol％乙醇水溶液、20vol％乙醇水溶液、30vol％乙醇水溶液、40vol％乙醇水溶液。

根据本发明的方法，优选地，步骤(4)中，所述梯度洗脱为按照乙醇浓度由小到大依次洗脱，各浓度的乙醇水溶液用量均为1.5～3BV，各浓度的乙醇水溶液的流速均为1.5～2.5BV/h；

所述收集部分洗脱液包括收集20vol％乙醇水溶液和30vol％乙醇水溶液的洗脱液。

根据本发明的方法，优选地，步骤(4)中，所述重结晶用溶剂为乙酸乙酯。

本发明以粉碎过筛后的胎菊经过超声提取、大孔树脂初步分离以及利用乙酸乙酯/石油醚反相分离、之后再利用聚酰胺树脂柱纯化分离，最后重结晶，得到定量纯度较高的胎菊中绿原酸。本发明的方法工艺稳定、重现性好，适合工业化生产。根据本发明优选的技术方案，超声时采用乙醇水溶液，且利用乙酸乙酯/石油醚反相分离以及聚酰胺树脂柱上样后先用稀盐酸冲洗，然后再用不同浓度的乙醇水溶液梯度洗脱，不仅可以使得绿原酸的纯度较高，而且重现性更好。

附图说明

图1为实施例1的产品的核磁共振氢谱图。

图2为标准品的核磁共振氢谱图。

图3A为绿原酸标准品的高效液相分析谱图。

图3B为胎菊粗提液的高效液相分析谱图。

图3C为NKA-9大孔树脂初步分离样品的高效液相分析谱图。

图3D为反相分离后的样品高效液相分析谱图。

图3E为聚酰胺树脂柱分离后样品高效液相分析谱图。

图3F为乙酸乙酯重结晶后绿原酸的高效液相分析谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。

在本发明中，“vol％”表示体积百分含量，“wt％”表示重量百分含量。

在本发明中，如无特别说明，所述“过滤”为减压过滤。

在本发明中，如无特别说明，所述“定量分析”为外标曲线法定量分析。

在本发明中，绿原酸的结构式详见下式：

本发明的提取纯化胎菊中绿原酸的方法包括如下步骤：(1)胎菊粗提液形成步骤，(2)初步分离步骤，(3)反相分离步骤，(4)聚酰胺树脂柱纯化步骤。下面进行详细描述。

<胎菊粗提液形成步骤>

将粉碎后的胎菊置于乙醇水溶液中，并超声30～70min，然后过滤、浓缩和离心，得到胎菊粗提液。本发明的胎菊购于云南楷林中药饮片有限责任公司，但本发明的胎菊并不限于此。采用常规方法将胎菊粉碎。超声之前，还可以包括将粉碎的胎菊过15～35目筛的步骤。优选地，将粉碎的胎菊过20～30目筛。

用于分散粉碎后的胎菊的乙醇水溶液中，乙醇含量为40～80vol％，优选为50～70vol％，更优选为55～65vol％。乙醇水溶液与胎菊的质量比为10～18:1，优选为12～16:1，更优选为13～15:1。在使用之前，将乙醇水溶液用稀酸调节pH值至1.5～3，优选为2～3。稀酸的实例包括但不限于10～20wt％盐酸，优选为15～20wt％盐酸。

超声的功率为60～100W，优选为70～80W。超声的温度为45～55℃，优选为50～55℃。超声的时间为40～60min，优选为45～55min，更优选为50～55min。可以采用40～80vol％乙醇水溶液对粉碎后的胎菊进行两次超声提取。两次所用乙醇水溶液的体积相同。

将超声提取的滤液合并，然后进行浓缩。可以采用减压浓缩。浓缩后，在0～10℃下，优选为0～5℃，更优选为1～4℃下静置。然后进行离心分离。离心分离的转速2000～6000r/min，优选为2500～5000r/min，更优选为3000～3500r/min。离心时间为5～30min，优选为10～20min，更优选为10～15min。离心后，合并上清液即为胎菊粗提液。这样既可以提取更多的胎菊中绿原酸，又可以提高提取液(或粗提液)中绿原酸的纯度。

根据本发明的一个实施方式，所述乙醇水溶液的乙醇浓度为40～80vol％；所述乙醇水溶液与胎菊的质量比为10～18:1；且所述乙醇水溶液用10～20wt％盐酸调节pH值至1.5～3；超声之前，还包括将粉碎的胎菊过15～35目筛。

根据本发明的一个具体实施方式，所述超声的功率为60～100W，超声的温度为45～55℃，超声的时间为40～60min。

<初步分离步骤>

在初步分离步骤中，将胎菊粗提液置于大孔树脂柱中，用25～35vol％的乙醇水溶液解吸，收集解吸液，并浓缩，得到初步分离的浓缩液。所述浓缩可为减压浓缩。大孔树脂可以为NKA-9大孔树脂；例如，天津市光复精细化工研究所的NKA-9大孔树脂。优选地，在将胎菊粗提液置于NKA-9大孔树脂柱之前，先用去离子水稀释至0.01～0.04mg/mL(外标法定量的浓度)，更优选为0.015～0.035mg/mL。

乙醇水溶液的流速可以为2.5～3BV/h，优选为2.7～3BV/h。BV表示柱体积单位。大孔树脂装柱前可以进行预处理，预处理的步骤详见后文所述。

<反相分离步骤>

在反相分离步骤中，将初步分离的浓缩液用乙酸乙酯和石油醚反相分离，得到反相分离液，并浓缩，得到反相分离浓缩液。所述浓缩可为减压浓缩。根据本发明的一个实施方式，先将初步分离的浓缩液调节pH值至1.5～2.5，然后用4～6倍体积乙酸乙酯分两次萃取(即单次所用乙酸乙酯的体积为初步分离的浓缩液体积的2～3倍)，合并乙酸乙酯萃取液，并向乙酸乙酯萃取液中加入0.2～0.5倍体积石油醚(即所加入的石油醚的体积为乙酸乙酯萃取液体积的0.2～0.5倍)，搅拌5～10min，静置分层，取下层溶液，即得反相分离液。这样可以进一步提高胎菊中绿原酸的纯度。

在本发明中，将初步分离的浓缩液调节pH值至1.5～2.5，优选为2～2.5。乙酸乙酯的用量为浓缩液的4～6倍体积，优选为5～6倍。石油醚用量为乙酸乙酯萃取液的0.2～0.5倍体积，优选为0.25～0.5倍。搅拌时间可以为5～10min，优选为5～8min。本发明中，所用石油醚为60-90°沸程的。

<聚酰胺树脂柱纯化步骤>

将反相分离浓缩液置于预处理的聚酰胺树脂柱中，先用pH值为3～4的稀盐酸冲洗，然后用不同浓度的乙醇水溶液梯度洗脱，收集部分洗脱液，并浓缩、过滤和重结晶，得到绿原酸。所述预处理包括：将聚酰胺树脂用90～98vol％乙醇水溶液浸泡12～36h，然后用水洗涤至中性，再用3～8wt％醋酸水溶液浸泡6～15h，然后用水洗至中性，再用3～8wt％氢氧化钠水溶液浸泡6～15h。

在本发明中，乙醇水溶液的乙醇浓度为90～98vol％，优选为91～96vol％，更优选为93～95vol％。乙醇水溶液浸泡时间为12～36h，优选为15～30h，更优选为24～28h。乙醇水溶液浸泡后，洗涤可以采用去离子水或蒸馏水等。醋酸水溶液的浓度为3～8wt％，优选为3～6wt％，更优选为5～6wt％。醋酸水溶液浸泡时间为6～15h，优选为8～13h，更优选为9～12h。醋酸水溶液浸泡后，洗涤可以采用去离子水或蒸馏水等。氢氧化钠水溶液浓度为3～8wt％，优选为3～6wt％，更优选为5～6wt％。氢氧化钠水溶液浸泡时间为6～15h，优选为8～13h，更优选为9～12h。氢氧化钠水溶液浸泡后，洗涤可以采用去离子水或蒸馏水等。

根据本发明的一个具体实施方式，将聚酰胺树脂用95vol％乙醇水溶液浸泡24h，然后用去离子水洗涤至中性，再用5wt％醋酸水溶液浸泡12h，然后用去离子水洗至中性，再用5wt％氢氧化钠水溶液浸泡12h，最后用去离子水洗至中性。

稀盐酸的用量为聚酰胺树脂柱的1.5～2.5BV，优选为2～2.5BV。在梯度洗脱之前，先用pH值为3～4的稀盐酸冲洗聚酰胺树脂柱。这样可以减少绿原酸的损失，进一步提高绿原酸产品的纯度，并使得提取工艺重现性好，适合工业化生产。

根据本发明的一个具体实施方式，用不同浓度的乙醇水溶液梯度洗脱，收集部分洗脱液。所述不同浓度的乙醇水溶液包括10vol％乙醇水溶液、20vol％乙醇水溶液、30vol％乙醇水溶液和40vol％乙醇水溶液。所述梯度洗脱为按照乙醇浓度由小到大依次洗脱，各浓度的乙醇水溶液用量均为1.5～3BV，优选为2～2.5BV。各浓度的乙醇水溶液的流速均为1.5～2.5BV/h，优选为1.8～2.2BV/h，更优选为1.8～2BV/h。收集部分洗脱液包括收集20vol％乙醇水溶液和30vol％乙醇水溶液的洗脱液。这样可以进一步提高绿原酸的纯度，并使得工艺稳定、重现性好而适合工业化生产。

将收集的洗脱液浓缩、过滤和重结晶，得到绿原酸。浓缩可以采用减压浓缩。将浓缩液降温至0～5℃，析出晶体后过滤，滤饼用乙酸乙酯重结晶。这样可以使得提取纯化的产品纯度提高，重现性好。

以下实施例中使用的原料说明如下：

0.1wt％磷酸溶液：优级纯磷酸，购于天津渤化化学试剂有限公司，配制成0.1wt％磷酸水溶液。

绿原酸标准品：购自武汉天植生物技术有限公司。

NKA-9大孔树脂：购于天津市光复精细化工研究所。

聚酰胺树脂：为聚酰胺粉，购于国药集团化学试剂有限公司，柱层析用100-200目。

<测试方法说明>

1)胎菊中绿原酸的高效液相色谱分析：

色谱柱为SB-C18(250×4.6mm，5μm)；流动相是色谱纯乙腈-0.1wt％磷酸水溶液；流速设置为1.0mL/min，柱温设置为25℃，检测波长设置为327nm，进样量设置为10μL，其中，流动相中乙腈和0.1wt％磷酸水溶液的体积随时间变化如下表1所示。

表1

2)绿原酸标准曲线的绘制：

准确称量绿原酸标准品5.0mg，用50vol％色谱纯甲醇水溶液溶解后定容在25ml棕色容量瓶中，即配制成浓度为0.2mg/mL的绿原酸标准溶液。放于冰箱中冷藏保存，待用。

分别量取0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL的绿原酸标准溶液(0.2mg/mL)到10mL的棕色容量瓶中，用50vol％的色谱纯甲醇定容。用高效液相色谱在327nm下测定其峰面积，以绿原酸浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。得到一元线性回归方程：y＝35993.84x-11.916，相关系数R＝0.9988，表明绿原酸在浓度为：0.01-0.06mg/mL范围内，峰面积与绿原酸质量浓度之间呈现良好的线性关系，可按标准曲线法进行(外标)定量分析。

3)所提取纯化的胎菊中绿原酸的纯度分析：

准确称量提取纯化的绿原酸产品5.0mg，用50vol％色谱纯甲醇水溶液溶解后定容在25ml棕色容量瓶中，即配制成浓度为0.2mg/mL的绿原酸产品溶液。将0.2mg/mL的胎菊绿原酸产品和0.2mg/mL的绿原酸标准品在相同的液相色谱条件下，进行高效液相色谱分析，记录绿原酸峰面积，代入下述公式计算产品纯度；

其中，P为提取纯化的胎菊绿原酸产品的定量纯度(％)，A为提取纯化的胎菊绿原酸产品的液相色谱峰面积(mAU·s)，As为绿原酸标准品的液相色谱峰面积(mAU·s)。

4)胎菊中的绿原酸的核磁共振氢谱分析：

取适量绿原酸标准品、提取纯化的胎菊绿原酸产品，以氘代二甲基亚砜为溶剂进行核磁共振氢谱表征。

制备例1

NKA-9大孔树脂的预处理

用95vol％的乙醇水溶液把大孔树脂浸泡在烧杯中，24小时后，树脂溶胀充分，过滤，用去离子水冲洗树脂至无醇味；再次过滤，然后加入5wt％盐酸溶液浸泡12h，再用去离子水洗到中性并过滤；然后加入5wt％氢氧化钠溶液浸泡12h，将树脂洗到用去离子水冲洗中性，用去离子水浸泡，待用。

聚酰胺树脂的预处理

将聚酰胺树脂用95vol％乙醇水溶液浸泡24h，过滤，用去离子水洗涤至中性，再过滤，用5wt％醋酸水溶液浸泡12h，再过滤，再用去离子水洗至中性，然后用5wt％氢氧化钠水溶液浸泡12h，再用去离子水洗至用中性，待用。

实施例1

(1)胎菊粗提液的制备

将胎菊用粉碎机粉碎，过20目筛，称取30.0g粉碎的胎菊用840mL的60vol％乙醇水溶液(用15wt％盐酸调节pH值为2)分两次在80W、50℃下超声提取50min，并过滤，两次所得滤液合并，并减压浓缩至溶液中乙醇含量为5vol％，4℃下静置24h，3000r/min下离心分离10min，上清液即为胎菊粗提液。用去离子水适当稀释至浓度为0.022mg/mL(外标法定量分析)。

(2)用NKA-9大孔树脂柱对胎菊粗提液的初步分离

将预处理好的NKA-9大孔树脂装柱(柱高15cm)，加入12BV的0.022mg/mL的上柱液(即去离子水稀释后的胎菊粗提液)，将上柱液以3BV/h的吸附速率通过树脂柱，吸附完毕，用4BV的30vol％乙醇水溶液解吸，乙醇水溶液流速为3BV/h，收集解吸液，减压浓缩，得到初步分离的浓缩液。

(3)将初步分离的浓缩液反相分离

将初步分离的浓缩液调节pH值为2，用4倍体积的乙酸乙酯分两次萃取，合并两次乙酸乙酯的萃取液，并向乙酸乙酯萃取液中加入0.25倍体积的石油醚，搅拌5min，静置分层，收集下层，得到反相分离液，并减压浓缩，得到反相分离浓缩液。

(4)用聚酰胺树脂柱纯化反相分离浓缩液

将预处理好的聚酰胺树脂装柱(柱高15cm)，加入0.5BV的上柱液(即反相分离浓缩液)；吸附完毕，先用2BV的pH值为3的稀盐酸冲洗；然后分别依次用10vol％乙醇水溶液、20vol％乙醇水溶液、30vol％乙醇水溶液、40vol％乙醇水溶液梯度洗脱，各浓度的乙醇水溶液用量均为2BV，洗脱流速为2BV/h；收集合并20vol％和30vol％的洗脱液，并减压浓缩至晶体出现，5℃下静置，过滤，得到粗晶体。将粗晶体用乙酸乙酯重结晶，得到胎菊中绿原酸。外标定量分析其纯度以及进行核磁共振氢谱分析。

外标定量分析结果见表2，核磁共振氢谱见图1。氢谱数据如下(其结构式参见上文)：δH7.42(1H,d,J＝16.0Hz,H-7′),δH 7.04(1H,d,J＝2.0Hz,H-2′),δH 6.99(1H,dd,J＝8.2Hz,2.0Hz,H-6′),δH6.77(1H,d,J＝8.0Hz,H-5′),δH 6.15(1H,d,J＝16.0Hz,H-8′),δH5.04-5.09(1H,m,H-3),δH 3.92(1H,brs,H-5),δH 3.56(1H,brs,H-4),δH 1.75-2.05(4H,m,H-2,H-6)。绿原酸标准品的氢谱参见图2。各阶段以及标准品的高效液相分析谱图见图3A～F。

按照实施例1的方法重复两次，分别记为S2和S3，分别得到提取纯化的胎菊中绿原酸，并分别定量分析其纯度。

比较例1

(1)胎菊粗提液的制备

将胎菊用粉碎机粉碎，过20目筛，称取50.0g粉碎的胎菊用1000mL纯水分两次热水回流2小时，过滤，两次所得滤液合并，3000r/min下离心分离10min，取上清液浓缩，得到胎菊粗提液。

(2)用AB-8大孔树脂柱对上述上清液的初步分离

将预处理好的AB-8大孔树脂(预处理方法与本发明NKA-9大孔树脂的预处理方法相同)装柱(柱高12cm)，加入1.8mg/mL的上柱液(即胎菊粗提液)，上柱液体积(mL)与大孔树脂质量(g)比值为12，上柱液的pH值为4，将上柱液以1.2BV/h的吸附速率通过树脂柱，吸附完毕用4BV的20vol％乙醇水溶液洗，控制洗脱流速为2.4BV/h，将吸附在树脂上的物质洗脱下来，收集解吸液。减压浓缩得到初步分离的浓缩液。

(3)聚酰胺树脂的预处理

将聚酰胺树脂用95vol％的乙醇浸泡，不断搅拌，装柱，去气泡，用3-4倍柱体积的95vol％乙醇洗脱，洗至洗脱液透明并在蒸干后无残渣。再次用2-2.5倍柱体积的5wt％氢氧化钠溶液、1倍体积的蒸馏水、2-2.5倍体积的5wt％醋酸水溶液洗脱至pH为7，待用。

(4)用聚酰胺树脂柱纯化反相分离液

将预处理好的聚酰胺树脂装柱(柱高15cm)，加入5mg/mL的上柱液(即初步分离的浓缩液)，上柱液体积(mL)与聚酰胺树脂质量(g)的比值为10，上柱液的pH值为4，吸附流速为1.2BV/h，吸附完毕分别依次用1BV的蒸馏水洗脱除杂(不收集流出液)，再开始洗脱，洗脱液为5BV的20vol％乙醇水溶液，洗脱流速为2.4BV/h，收集洗脱液，浓缩，得到粗晶体。将粗晶体重结晶，得到胎菊中绿原酸，并定量分析其纯度。按照比较例1的方法重复两次，分别记为B2和B3。

表2

由表可知，采用实施例1的方法进行提取纯化胎菊中绿原酸，可以得到定量纯度高的绿原酸，且重现性好。

本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。

Claims (10)

1.一种提取纯化胎菊中绿原酸的方法，其特征在于，其包括如下步骤：

(1)将粉碎后的胎菊置于乙醇水溶液中，并超声30～70min，然后过滤、浓缩和离心，得到胎菊粗提液；

(2)将胎菊粗提液置于大孔树脂柱中，用25～35vol％的乙醇水溶液解吸，收集解吸液，并浓缩，得到初步分离的浓缩液；

(3)将初步分离的浓缩液用乙酸乙酯和石油醚反相分离，得到反相分离液，并浓缩，得到反相分离浓缩液；

(4)将反相分离浓缩液置于预处理的聚酰胺树脂柱中，先用pH值为3～4的稀盐酸冲洗，然后用不同浓度的乙醇水溶液梯度洗脱，收集部分洗脱液，并浓缩、过滤和重结晶，得到绿原酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤(1)中，所述乙醇水溶液的乙醇浓度为40～80vol％；所述乙醇水溶液与胎菊的质量比为10～18:1；且所述乙醇水溶液用稀酸调节pH值至1.5～3；

步骤(1)中，超声之前，还包括将粉碎的胎菊过15～35目筛。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述超声的功率为60～100W，超声的温度为45～55℃，超声的时间为40～60min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述大孔树脂为天津市光复精细化工研究所的NKA-9大孔树脂；乙醇水溶液的流速为2.5～3BV/h；其中，所述的BV表示柱体积单位。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述反相分离包括：先将初步分离的浓缩液调节pH值为1.5～2.5，然后用4～6倍体积的乙酸乙酯分两次萃取，合并乙酸乙酯萃取液，并向乙酸乙酯萃取液中加入0.2～0.5倍体积的石油醚，搅拌5～10min，静置分层，取下层溶液，即得反相分离液。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述预处理包括：将聚酰胺树脂用90～98vol％乙醇水溶液浸泡12～36h，然后用水洗涤至中性，再用3～8wt％醋酸水溶液浸泡6～15h，然后用水洗至中性，再用3～8wt％氢氧化钠水溶液浸泡6～15h。

7.根据权利要求1～6任一项所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述稀盐酸的用量为1.5～2.5BV。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述不同浓度的乙醇水溶液包括10vol％乙醇水溶液、20vol％乙醇水溶液、30vol％乙醇水溶液和40vol％乙醇水溶液。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述梯度洗脱为按照乙醇浓度由小到大依次洗脱，各浓度的乙醇水溶液用量均为1.5～3BV，各浓度的乙醇水溶液的流速均为1.5～2.5BV/h；

所述收集部分洗脱液包括收集20vol％乙醇水溶液和30vol％乙醇水溶液的洗脱液。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述重结晶用溶剂为乙酸乙酯。