CN115010618A

CN115010618A - 一种可降尿酸的金色酰胺醇酯分离纯化方法及其应用

Info

Publication number: CN115010618A
Application number: CN202210943054.6A
Authority: CN
Inventors: 吴磊; 吴静; 胡居吾; 熊伟; 谢传奇; 顾震
Original assignee: Institute of Applied Chemistry Jiangxi Academy of Sciences
Current assignee: Institute of Applied Chemistry Jiangxi Academy of Sciences
Priority date: 2022-08-08
Filing date: 2022-08-08
Publication date: 2022-09-06
Anticipated expiration: 2042-08-08
Also published as: CN115010618B

Abstract

本发明公开了一种可降尿酸的金色酰胺醇酯分离纯化方法及其应用，将蔓三七原料粉碎，溶剂提取，将提取液过滤浓缩后进行溶剂萃取，萃取液经浓缩；将萃取后的浸膏进行柱色谱分离；收集目标组分后，向浓缩液中搅拌加入溶剂至溶液微浑浊，进行析晶，离心收集结晶得从蔓三七分离的二肽化合物即为金色酰胺醇酯。本发明首次从蔓三七植物中分离得金色酰胺醇酯，所得金色酰胺醇酯纯度大于98%，得率大于1%，该化合物对降尿酸具有很好的效果。本发明的工艺路线，适合工业化生产。

Description

一种可降尿酸的金色酰胺醇酯分离纯化方法及其应用

技术领域

本发明属于植物有效活性成分提取技术领域，尤其是涉及一种具有降尿酸作用的二肽化合物-金色酰胺醇酯（Aurantiamide acetate）的分离纯化方法与其在降尿酸药物中的应用。

背景技术

蔓三七学名为“平卧菊三七（Gynura procumbens（Lour.）Merr.）”为菊科，三七属植物，又名蛇接骨、续命草、神仙草，味辛、微苦、性凉，为多年生草本药食两用植物。平卧菊三七具有广泛的药理作用，无毒、无致畸影响；其有效成份具有通经活络，消炎止咳，散淤消肿，活血生肌，治疗跌打损伤，支气管肺炎、肺结核等功效；能延缓衰老、激活免疫细胞、改善机体免疫功能、提高人体免疫力，增强人体的新陈代谢并对记忆障碍有一定改善作用；具有降血压、降血脂、降血糖、抗氧化、抗溃疡和预防慢性肾病、抑制乙型肝炎的显著效果；对预防和治疗心脑血管疾病、糖尿病等有一定的疗效；还具有抗病毒、抗菌活性、抑制骨髓癌和志贺样毒素细胞的活性。另一方面，平卧菊三七是一种药食兼可的独特植物，具有极好的营养价值，广泛利用于食品医药工业、日用化工工业等领域。迄今为止，蔓三七已知的成分仅仅限于生物碱（alkaloids）、黄酮类（flavonoids）、有机酸类物质，而对于其中的二肽类物质，尤其是Aurantiamide acetate单体化合物（金色酰胺醇酯）的提取分离一直处于空白。

针对于此，本发明针对蔓三七这一植物，采用提取浓缩、溶剂萃取、柱色谱分离以及结晶等步骤得到高纯度Aurantiamide acetate（金色酰胺醇酯）。

发明内容

金色酰胺醇酯单体化合物只是在其它属植物中少有报道，其分离纯化也只停留在实验室阶段。针对蔓三七这一原料，本发明提供一种可降尿酸的金色酰胺醇酯（Aurantiamide acetate）分离纯化方法，该方法工艺操作便捷，产品含量高，回收率高，所用溶剂危害小，适合于大生产操作。金色酰胺醇酯是一种具有降尿酸作用的二肽化合物，本发明还提供金色酰胺醇酯在降尿酸药物中的应用。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案为；一种可降尿酸的金色酰胺醇酯分离纯化方法，将蔓三七原料粉碎，溶剂提取，将提取液过滤浓缩后进行溶剂萃取，萃取液经浓缩；将萃取后的浸膏进行柱色谱分离；收集目标组分后，向浓缩液中搅拌加入溶剂至溶液微浑浊，进行析晶，离心收集结晶得从蔓三七分离的二肽化合物即为金色酰胺醇酯（Aurantiamide acetate）。

所得金色酰胺醇酯（Aurantiamide acetate）的结构式如下：

。

进一步优选，所述溶剂提取的过程为：按料液比1:10-30 g/mL加入体积百分浓度为60%-95%的乙醇水溶液，超声波提取1-5次，每次10-60分钟，得到提取液。

进一步优选，溶剂提取时，料液比优选地选择是1:10-20 g/mL，乙醇水溶液体积浓度优选地是80%-90%，超声波提取优选地是3-4次，每次20-30min。

进一步优选，提取液过滤浓缩得到浸膏，浸膏加入少量水超声振荡成悬浮液，再进行溶剂萃取。

进一步优选，所述溶剂萃取：使用有机溶剂进行萃取，萃取次数3-5次，减压浓缩成萃取后的浸膏。

进一步优选，作为萃取剂的有机溶剂是：饱和的正丁醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚、正己烷或正丙醇。

进一步优选，所述柱色谱分离采用干法上样，柱色谱分离所用填料为大孔吸附树脂、硅胶、葡聚糖凝胶、MCI或者C18中的一种；流动相为石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇和水的任意两个的比例组合（体积比）。洗脱液经薄层色谱(Thin LayerChromatography，TLC)检测，有紫红色斑点的洗脱液即确定含有二肽类物质，确定为特征馏分；收集特征馏分，将具有相同特征的馏分浓缩至干。

进一步优选，收集目标组分后，向浓缩物中搅拌加入溶剂至溶液微浑浊，加入溶剂是：浓度为80-100%的甲醇或乙醇溶液，加入质量为浓缩物的1-4倍。

进一步优选，所述蔓三七原料为蔓三七根、茎、叶和花的一种。

本发明还提供了一种金色酰胺醇酯的应用，用于制备降尿酸的药物。

由于采用如上所述的技术方案，本发明具有如下优越性：

利用萃取、柱色谱以及结晶等方法快速从蔓三七中首次分离得到一种未见报道的二肽类物质金色酰胺醇酯（Aurantiamide acetate），在纯度和收率保证的前提下，此工艺简易、高效、投资少，且适合大规模生产。

附图说明

图1是实施例1所得Aurantiamide acetate的质谱图。

图2是实施例1所得Aurantiamide acetate的氢谱图。

图3是实施例1所得Aurantiamide acetate的碳谱图。

图4是实施例1所得Aurantiamide acetate的HMBC谱图。

图5是本发明Aurantiamide acetate对高尿酸血症小鼠血清尿酸的影响。

具体实施方式

参照以下实施例可以对本发明作进一步详细说明；但是，以下实施例仅仅是例证，本发明并不局限于这些实施例。

一种可降尿酸的金色酰胺醇酯分离纯化方法，如下：

（1）将干燥的蔓三七粉碎，按料液比1:10-30 g/mL加入体积百分浓度为60%-95%的乙醇水溶液，超声波提取1-5次，每次10-60分钟，过滤，减压浓缩成超声波提取后的浸膏。其中，料液比优选地选择是1:10-20，乙醇水溶液体积浓度优选地是80%-90%，超声波提取优选地是3-4次，每次20-30min。

（2）将超声波提取后的浸膏加入少量水超声振荡成悬浮液，使用有机溶剂进行萃取，萃取次数3-5次，减压浓缩成萃取后的浸膏。作为萃取剂的有机溶剂是：饱和的正丁醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚、正己烷或正丙醇。

（3）将萃取后的浸膏经过柱色谱分离，干法上样，柱色谱分离所用填料为大孔吸附树脂、硅胶、葡聚糖凝胶、MCI或者C18中的一种；流动相为石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇和水的任意两个的比例组合（体积比）。洗脱液经薄层色谱(Thin LayerChromatography，TLC)检测，有紫红色斑点的洗脱液即确定含有二肽类物质，确定为特征馏分；收集特征馏分，将具有相同特征的馏分浓缩至干。

（4）收集目标组分后，向浓缩物中搅拌加入溶剂至溶液微浑浊，加入溶剂是：浓度为80-100%的甲醇或乙醇溶液，加入质量为浓缩物的1-4倍。进行析晶，离心收集结晶得从蔓三七分离的二肽化合Aurantiamide acetate。

实施例1

取500g粉碎的蔓三七叶，按料液比1:10（g/mL）的比例加入体积百分浓度80%的乙醇水溶液，超声波提取5次，每次20分钟，过滤，减压浓缩成超声波提取后的浸膏。在超声波提取后的浸膏中加入少量水超声震荡成悬浮液，使用正丁醇进行萃取，萃取次数3次，减压浓缩成萃取后的浸膏。萃取后的浸膏用大孔树脂填料干法拌样，进行大孔树脂柱色谱分离，用20—100%的乙醇梯度洗脱，洗脱液经TLC检测80%乙醇段馏分显色有紫色斑点，TLC检测结果如图2所示，收集80%乙醇段馏分作为特征馏分，将特征馏分浓缩至干。向特征馏分浓缩物中加入质量为浓缩物4倍的浓度为90%的乙醇，室温静置，离心过滤后，反复结晶，得白色粉末状物质5.12g，用液相检测纯度为98.35%。

所得白色粉末状物质的结构式如下：

分子式为C27H28N2O4，化合名为：金色酰胺醇酯，其对应英文名： Aurantiamideacetate。该化合物为白色，其熔点为（mp）：188—190℃，

=-23.6°(c0.2, CHCl3)；紫外光谱分析其在218nm有最大吸收，红外光谱分析显示在3320cm-1（-NH-）、1659， 1629cm-1（酰胺C=O）、1723cm-1（COOR）处有吸收。质谱图如图1所示，ESI-MSm/z[M+H]+为 445、[M+Na]+为467。化合物Aurantiamide acetate的波谱数据如图2、图3和图4所示。¹H- NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 7.72 (2H, d, J= 7.5 Hz, H-16, 20), 7.44 (2H, t, J= 7.5 Hz, H-17, 19), 7.20 (1H, t, J= 7.2 Hz, H-7), 7.07 (2H, d, J= 7.5 Hz, H-6, 8), 3.93 (1H, dd, J= 11.3, 4.8 Hz, H-10a), 3.23 (1H, dd, J= 13.6, 5.8 Hz, H- 21b), 3.05 (1H, dd, J = 13.6, 8.5 Hz, H-21a); ¹³C-NMR (100 MHz, CDCl₃) δ: 170.77 (C-11), 170.23 (C-1), 167.10 (C-14), 136.69 (C-22), 136.62 (C-4), 133.67 (C-15), 131.92 (C-18), 129.29~129.13 (C-23, 24, 26, 27), 128.77 (C-6， 8), 128.64 (C-5, 9), 128.58 (C-17, 19), 127.15 (C-25), 127.05 (C-16, 20), 126.75 (C-7), 64.58 (C-10), 54.99 (C-13), 49.45 (C-2), 38.42 (C-21), 37.44 (C-3), 20.80 (C-12)。

实施例2

取500g粉碎的蔓三七根，按料液比1:15（g/mL）的比例加入体积百分浓度90%的乙醇水溶液，超声波提取2次，每次10分钟，过滤，减压浓缩成超声波提取后的浸膏。在超声波提取后的浸膏中加入少量水超声震荡成悬浮液，使用乙酸乙酯进行萃取，萃取次数3次，减压浓缩成萃取后的浸膏。萃取后的浸膏用硅胶填料干法拌样，进行硅胶柱色谱分离，用20—100%的石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱，洗脱液经TLC检测60%石油醚段馏分显色有紫色斑点，收集60%石油醚段馏分作为特征馏分，将特征馏分浓缩至干。向特征馏分浓缩物中加入质量为浓缩物4倍的浓度为80%的乙醇，室温静置，离心过滤后，反复结晶，得白色粉末状物质6.68g，用液相检测纯度为98.79%。

实施例3

取500g粉碎的蔓三七花，按料液比1:30（g/mL）的比例加入体积百分浓度95%的乙醇水溶液，超声波提取2次，每次30分钟，过滤，减压浓缩成超声波提取后的浸膏。在超声波提取后的浸膏中加入少量水超声震荡成悬浮液，使用二氯甲烷进行萃取，萃取次数3次，减压浓缩成萃取后的浸膏。萃取后的浸膏用C18填料干法拌样，进行C18柱色谱分离，用20—100%的甲醇梯度洗脱，洗脱液经TLC检测70%甲醇段馏分显色有紫色斑点，收集70%甲醇段馏分作为特征馏分，将特征馏分浓缩至干。向特征馏分浓缩物中加入质量为浓缩物4倍的浓度为90%的乙醇，室温静置，离心过滤后，反复结晶，得白色粉末状物质5.76g，用液相检测纯度为98.14%。

实施例4

取500g粉碎的蔓三七茎，按料液比1:20（g/mL）的比例加入体积百分浓度60%的乙醇水溶液，超声波提取4次，每次20分钟，过滤，减压浓缩成超声波提取后的浸膏。在超声波提取后的浸膏中加入少量水超声震荡成悬浮液，使用正丙醇进行萃取，萃取次数3次，减压浓缩成萃取后的浸膏。萃取后的浸膏用MCI填料干法拌样，进行MCI柱色谱分离，用20—100%的乙醇水溶液梯度洗脱，洗脱液经TLC检测60%乙醇段馏分显色有紫色斑点，收集60%乙醇段馏分作为特征馏分，将特征馏分浓缩至干。向特征馏分浓缩物中加入质量为浓缩物4倍的浓度为90%的甲醇，室温静置，离心过滤后，反复结晶，得白色粉末状物质5.12g，用液相检测纯度为98.32%。

实施例5

取500g粉碎的蔓三七叶，按料液比1:30（g/mL）的比例加入体积百分浓度95%的乙醇水溶液，超声波提取3次，每次30分钟，过滤，减压浓缩成超声波提取后的浸膏。在超声波提取后的浸膏中加入少量水超声震荡成悬浮液，使用乙酸乙酯进行萃取，萃取次数3次，减压浓缩成萃取后的浸膏。萃取后的浸膏用葡聚糖凝胶填料干法拌样，进行葡聚糖凝胶柱色谱分离，用20—100%的二氯甲烷/甲醇梯度洗脱，洗脱液经TLC检测60%甲醇段馏分显色有紫色斑点，收集60%乙醇段馏分作为特征馏分，将特征馏分浓缩至干。向特征馏分浓缩物中加入质量为浓缩物4倍的浓度为80%的乙醇，室温静置，离心过滤后，反复结晶，得白色粉末状物质6.58g，用液相检测纯度为98.75%。

1．待评价样品：上述制备的Aurantiamide acetate的降尿酸活性评价。

2.试验方法：

（1）药物配制

0.5%CMC-Na过滤后用于配制Aurantiamide acetate低剂量、中剂量组和高剂量三个剂量组；用生理盐水配制氧嗪酸钾（35mg/mL）；用灭菌水配制酵母膏（30g/kg）。

（2）动物分组和建模

小鼠为雄性ICR小鼠（20.0±2.0g），小鼠在恒温（23±2℃），相对湿度50%～60%，光照/黑夜各12h，适应性喂养3d后，随机分为六组，每组7只。即正常对照组（NC）、模型组（MC）、阳性对照组（别嘌呤醇，5mg/kg,PC）、金色酰胺醇酯低剂量组（金色酰胺醇酯，15mg/kg，LC）、金色酰胺醇酯中剂量组（金色酰胺醇酯，30 mg/kg MiC）和金色酰胺醇酯高剂量组（金色酰胺醇酯，60mg/kg， HC），通过在胃内施用酵母膏（30g/kg）腹膜内注射氧嗪酸钾（PO，350mg/kg）来建立高尿酸血症小鼠模型。

正常对照组（NC）：小鼠每天给予0.5%CMC-Na载体剂量。

模型组（MC）：小鼠连续灌胃酵母膏21天，最后一次灌胃酵母膏后并腹腔注射氧嗪酸钾。

阳性对照组（PC）：小鼠前7天处理同模型组相同，自8日起，小鼠灌胃酵母膏1小时后，灌胃5mg/kg的别嘌呤醇，第21天，最后一次灌胃给药后腹腔注射氧嗪酸钾。

金色酰胺醇酯低剂量组、金色酰胺醇酯中剂量组和金色酰胺醇酯高剂量组：小鼠前7天处理同模型组相同；自8日起，小鼠灌胃醇母膏1小时后，金色酰胺醇酯低剂量组、金色酰胺醇酯中剂量组和金色酰胺醇酯高剂量组分别按15 mg/kg、30 mg/kg、60 mg/kg剂量灌胃金色酰胺醇酯，第21天，最后一次灌胃给药后并腹腔注射氧嗪酸钾。

（3）血清中尿酸的测定

在最后一天，小鼠禁食，从眼球取血，将取出的血样沿着1.5mLEP管壁轻轻打出，室温下静置4h后，在4℃下以3000r/min离心10min，取上清液按照UA试剂盒说明书测定血清尿酸的含量。

3.实验结果：

高尿酸血症是由于嘌呤代谢异常或尿酸排出受阻导致的，以高血尿酸为特征的代谢性疾病，而持续性的高尿酸水平可能会诱发痛风、关节炎等病症。目前对于高尿酸血症小鼠模型的造模方法，文献报道较多为腹腔注射次黄嘌呤、氧嗪酸钾和尿酸；连续灌胃酵母膏、酵母膏加氧嗪酸钾等。本实验采用灌胃酵母膏（30g/kg）和腹腔注射氧嗪酸钾（300mg/kg），建立高尿酸血症小鼠模型。结果如图5所示，与正常组相比，模型组小鼠血清中尿酸含量为248 μmol/L，显著高于正常组（p<0.05）；与模型组相比，金色酰胺醇酯低剂量组、金色酰胺醇酯中剂量组、金色酰胺醇酯高剂量组均显示出不同程度降低小鼠血尿酸水平（p<0.05）。说明金色酰胺醇酯对酵母膏和氧嗪酸钾联合诱导的高尿酸血症小鼠有一定的降低尿酸作用。可广泛应用在降尿酸药品中。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种可降尿酸的金色酰胺醇酯分离纯化方法，其特征在于，将蔓三七原料粉碎，溶剂提取，将提取液过滤浓缩后进行溶剂萃取，萃取液经浓缩；将萃取后的浸膏进行柱色谱分离；收集目标组分后，向浓缩液中搅拌加入溶剂至溶液微浑浊，进行析晶，离心收集结晶得从蔓三七分离的二肽化合物即为金色酰胺醇酯。

2.根据权利要求1所述的可降尿酸的金色酰胺醇酯分离纯化方法，其特征在于，所述溶剂提取的过程为：按料液比1:10-30 g/mL加入体积百分浓度为60%-95%的乙醇水溶液，超声波提取，得到提取液。

3.根据权利要求2所述的可降尿酸的金色酰胺醇酯分离纯化方法，其特征在于，溶剂提取时，料液比选择1:10-20 g/mL，乙醇水溶液体积浓度是80%-90%。

4.根据权利要求1所述的可降尿酸的金色酰胺醇酯分离纯化方法，其特征在于，提取液过滤浓缩得到浸膏，浸膏加入少量水超声振荡成悬浮液，再进行溶剂萃取。

5.根据权利要求1所述的可降尿酸的金色酰胺醇酯分离纯化方法，其特征在于，所述溶剂萃取：使用有机溶剂进行萃取，萃取次数3-5次，减压浓缩成萃取后的浸膏。

6.根据权利要求5所述的可降尿酸的金色酰胺醇酯分离纯化方法，其特征在于，作为萃取剂的有机溶剂是：饱和的正丁醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚、正己烷或正丙醇。

7.根据权利要求1所述的可降尿酸的金色酰胺醇酯分离纯化方法，其特征在于，所述柱色谱分离采用干法上样，柱色谱分离所用填料为大孔吸附树脂、硅胶、葡聚糖凝胶、MCI或者C18中的一种；流动相为石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇和水的任意两个的比例组合；洗脱液经薄层色谱检测，有紫红色斑点的洗脱液即确定含有二肽类物质，确定为特征馏分；收集特征馏分，将具有相同特征的馏分浓缩至干。

8.根据权利要求1所述的可降尿酸的金色酰胺醇酯分离纯化方法，其特征在于，收集目标组分后，向浓缩物中搅拌加入溶剂至溶液微浑浊，加入溶剂是：浓度为80-100%的甲醇或乙醇溶液，加入质量为浓缩物的4倍。

9.根据权利要求1所述的可降尿酸的金色酰胺醇酯分离纯化方法，其特征在于，所述蔓三七原料为其根、茎、叶和花的一种。

10.一种权利要求1-9任意一项所述金色酰胺醇酯分离纯化方法所制备的金色酰胺醇酯的应用，其特征在于，用于制作降尿酸的药物。