CN107721857B - 一种从平卧菊三七中制备高纯度绿原酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种从平卧菊三七中制备高纯度绿原酸的方法，其以平卧菊三七的叶为原料，将平卧菊三七叶切分、烘干、粉碎，过筛，得到平卧菊三七叶粉末，平卧菊三七叶粉末采用微波辅助提取得到绿原酸粗提物，采用高效液相色谱法对绿原酸粗提物中的绿原酸含量进行测定，再通过中高压制备液相色谱法分离纯化绿原酸粗提物，能够分离得到纯度高、回收率高的绿原酸的单体。本发明分离效率高，处理量大，生产周期短以及分析方法重复性好，为平卧菊三七中高纯度绿原酸的工业化生产提供了有效的技术支持。
Description
技术领域
本发明属于绿原酸制备技术领域，尤其是涉及一种从平卧菊三七中制备高纯度绿原酸的方法。
背景技术
平卧菊三七(Gynura procumbens (Lour.) Merr.)为菊科三七属，又名蛇接骨、神仙草，多年生草本药食同源植物，生于林间溪旁坡地砂质土上，攀援于灌木或乔木上，在我国南方省区有广泛分布。2012年5月平卧菊三七被国家卫生部批准为新资源食品。平卧菊三七具有广泛的药理作用，据《中国中草药汇编》下册记载：其疗效为味甘淡，性平，通经活络，消炎止咳，散瘀消肿，活血生肌。主要用于治疗跌打损伤、风湿关节痛和痛风。在我国周边的东南亚民族地区，它还用于降糖降脂、抗肝癌、解脏毒和保护肠道。平卧菊三七主要活性成分有绿原酸、咖啡酸、黄酮类、生物碱、萜烯类、香豆素类、挥发油等。
绿原酸是由咖啡酸与奎尼酸组成的缩酚酸，异名咖啡鞣酸，化学名3-O-咖啡酰奎尼酸，是植物在有氧呼吸过程中由磷酸戊糖途径(HMS)的中间产物合成的一种苯丙素类物质，其包括绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸、莱蓟素等十多种同分异构体，具有抗菌、抗病毒、保肝利胆、抗肿瘤、降血压、降血脂、降糖、清除自由基等药理作用，是保健品、食品、药品及化妆品的重要原料，因此从植物中提取分离绿原酸具有重要的意义。
目前，提取纯化绿原酸的传统方法主要有水石灰乳法、水提醇沉法、乙酸乙酯提取法、稀酸提取、单相水提取法等。这些方法单一使用，绿原酸总收率为2.5%左右，纯度在40%以下，很难达到90%以上的纯度。目前，绿原酸的生产主要存在以下问题：能够提取高纯度绿原酸的方法不适用于工业化大规模生产，适于工业化大规模生产的方法得到的绿原酸的纯度又较低，不能满足高纯度绿原酸的市场需求。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的是提供一种从平卧菊三七中制备高纯度绿原酸的方法，其分离效率高，处理量大，产品安全性好，生产周期短，制备得到纯度达90%以上的绿原酸单体。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种从平卧菊三七中制备高纯度绿原酸的方法，其包括以下步骤：
步骤1、预处理：以平卧菊三七的叶为原料，将平卧菊三七叶按长度为30mm～40mm进行切分，然后置于恒温干燥箱中40～60℃干燥30～40min，干燥后平卧菊三七叶含水量保持在初始重量55%～70%，再进行粉碎，过40～80目筛，得到平卧菊三七叶粉末；
步骤2、粗提取：将步骤1得到的平卧菊三七叶粉末加入65～75%甲醇水溶液中，采用微波辅助提取，平卧菊三七叶粉末与甲醇水溶液的料液比1：20～50g/ml，提取温度50～80℃，提取时间为30～70min，提取功率为400～600W，过滤，得到提取液，提取液即为绿原酸粗提取物，绿原酸提取率为2.50～3.58 %；
步骤3、检测：将绿原酸对照品用流动相稀释制备对照品溶液，对步骤2得到的绿原酸粗提取物取样，样品用流动相稀释后，再通过孔径为0.45μm～0.60μm的滤膜过滤，滤液即为供试品溶液；将对照品溶液、供试品溶液分别进行HPLC分析，HPLC色谱条件：ODS C18色谱柱，4.6mm×250mm，5μm；流动相为乙腈-0.5%乙酸水溶液，乙腈与乙酸水溶液体积比为10：90；检测波长327nm；流速0.5～1.0mL/min；进样量为20μL；柱温为30℃；根据液相色谱结果，以样品峰面积与对照品峰面积比较来测定绿原酸含量；
步骤4、分离纯化：步骤2得到的绿原酸粗提取物，经MCI树脂柱分离，获得洗脱液，洗脱液用中高压制备液相色谱分离纯化，制备色谱的分离条件：ODS C18色谱柱，920mm ×70mm；流动相为甲醇和水，甲醇和水的体积比35～45:55～70，梯度洗脱，流速为10～15 mL/min，检测波长327 nm，进样量为10～20mL；收集含有绿原酸的洗脱液，再通过减压蒸馏、真空干燥得到白色粉末状绿原酸，绿原酸单体纯度为93.24～95.85%，回收率为75.22～80.67%。
优选地，上述的步骤2中，料液比1：40 g/ml，提取温度50℃，提取时间30 min，提取功率400W，绿原酸的提取率达3.58%。
优选地，上述的步骤4中，制备色谱的分离条件：流动相甲醇和水的体积比40:60、流速为10mL/min、检测波长327 nm、进样量为10mL的条件下，绿原酸单体纯度为95.85%，回收率为80.67%。
进一步地，上述的步骤4中，减压蒸馏的温度为40～60℃，真空度为0.03～0.08Mpa。
进一步地，上述的步骤4中，真空干燥的温度为50～70℃，真空度为92.0～99.5Kpa，时间为5～12h。
本发明从平卧菊三七中制备高纯度绿原酸的方法，其制备得到的白色粉末状绿原酸结构式如下：
上述的绿原酸粗提取物用中高压制备液相分离纯化过程中，流动相采用甲醇和水作为最佳流动相比例，这是由于随着流动相中乙醇的含量增加，产品的纯度和回收率先升后降。原因是在甲醇含量低于40%时，流动相洗脱能力不强，绿原酸不能和杂质很好的分离，并且拖尾严重，不能完全收集到所有的绿原酸，从而使得产品的纯度和回收率较低；在甲醇含量增加到40%的过程中，流动相洗脱能力逐渐增强，分离度增大，最终绿原酸与杂质分离；高于40%时，对绿原酸的洗脱能力过强，又与杂质不能很好的分离，使得纯度和回收率降低。
由于采用如上所述的技术方案，本发明具有如下优越性：
该从平卧菊三七中制备高纯度绿原酸的方法，其采用中高压制备液相色谱法分离纯化绿原酸粗提物，流速快，柱效高，不拖尾，能够根据分离度过载上样并快速制备大量纯品；使用ODS C18色谱柱，能较好地分离绿原酸与杂质，保留时间较好，实验结果准确，精密度，重复性好，作为平卧菊三七的质量控制方法；反相液相制备色谱柱分离纯化平卧菊三七叶粗提物，能够分离得到绿原酸的单体纯度高，回收率高；本发明分离效率高，处理量大，生产周期短以及分析方法重复性好，为平卧菊三七中高纯度绿原酸的工业化生产提供了有效的技术支持。
具体实施方式
参照以下实施例可以对本发明作进一步详细说明；但是，以下实施例仅仅是例证，本发明并不局限于这些实施例。
实施例1
一种从平卧菊三七中制备高纯度绿原酸的方法，其包括以下具体步骤：
步骤1、将平卧菊三七叶按长度为30mm～40mm进行切分，然后置于恒温干燥箱中40℃干燥40min，干燥后平卧菊三七叶含水量保持在初始重量55%，再进行粉碎，过80目筛，得到平卧菊三七叶粉末，装袋备用；
步骤2、称取平卧菊三七叶粉末100g加入2000ml体积百分比浓度为65%甲醇水溶液中，将其放入超声波清洗器中，提取温度为60℃，提取时间为40min，提取功率为450W，提取次数为3次，过滤，得到提取液，提取液即为绿原酸粗提取物，绿原酸提取率为3.35 %；
步骤3、将绿原酸对照品用流动相稀释制备对照品溶液，对步骤2得到的绿原酸粗提取物取样，样品用流动相稀释后，再通过孔径为0.45μm的滤膜过滤，滤液即为供试品溶液；将对照品溶液、供试品溶液分别进行HPLC分析，HPLC色谱条件：ODS C18色谱柱，4.6mm×250mm，5μm；流动相为乙腈-0.5%乙酸水溶液，乙腈与乙酸水溶液体积比为10：90；检测波长327nm；流速0.5mL/min；进样量为20μL；柱温为30℃；根据液相色谱结果，以样品峰面积与对照品峰面积比较来测定绿原酸含量；
步骤4、步骤2得到的绿原酸粗提取物，经MCI树脂柱分离，获得洗脱液，质量浓度为3.5mg/mL的洗脱液用中高压制备液相色谱分离纯化，制备色谱的分离条件：ODS C18色谱柱，920mm ×70mm；流动相为甲醇和水，甲醇和水的体积比40：60，梯度洗脱，浓度分别为10wt％、20wt％、30wt％、40wt％、50wt％甲醇，流速为12mL/min，检测波长327 nm，进样量为20mL；收集含有绿原酸的洗脱液，再通过温度为40℃、真空度为0.08Mpa减压蒸馏、温度为50℃、真空度为99.5Kpa、烘干时间为12h的真空干燥得到白色粉末状绿原酸，绿原酸单体纯度为93.24%，回收率为75.22%。
实施例2
一种从平卧菊三七中制备高纯度绿原酸的方法，其包括以下具体步骤：
步骤1、将平卧菊三七叶按长度为30mm～40mm进行切分，然后置于恒温干燥箱中50℃干燥34min，干燥后平卧菊三七叶含水量保持在初始重量60%，再进行粉碎，过60目筛，得到平卧菊三七叶粉末，装袋备用；
步骤2、称取平卧菊三七叶粉末100g加入4000ml体积百分比浓度为70%甲醇水溶液中，将其放入超声波清洗器中，提取温度为50℃，提取时间为30min，提取功率为400W，提取次数为3次，过滤，得到提取液，提取液即为绿原酸粗提取物，绿原酸提取率为3.58 %；
步骤3、将绿原酸对照品用流动相稀释制备对照品溶液，对步骤2得到的绿原酸粗提取物取样，样品用流动相稀释后，再通过孔径为0.50μm的滤膜过滤，滤液即为供试品溶液；将对照品溶液、供试品溶液分别进行HPLC分析，HPLC色谱条件：ODS C18色谱柱，4.6mm×250mm，5μm；流动相为乙腈-0.5%乙酸水溶液，乙腈与乙酸水溶液体积比为10：90；检测波长327nm；流速0.5mL/min；进样量为20μL；柱温为30℃；根据液相色谱结果，以样品峰面积与对照品峰面积比较来测定绿原酸含量；
步骤4、步骤2得到的绿原酸粗提取物，经MCI树脂柱分离，获得洗脱液，质量浓度为4.2mg/mL的洗脱液用中高压制备液相色谱分离纯化，制备色谱的分离条件：ODS C18色谱柱，920mm ×70mm；流动相为甲醇和水，甲醇和水的体积比40：60，梯度洗脱，浓度分别为10wt％、20wt％、30wt％、40wt％、50wt％甲醇，流速为10mL/min，检测波长327 nm，进样量为10mL；收集含有绿原酸的洗脱液，再通过温度为50℃、真空度为0.05 Mpa的减压蒸馏、温度为60℃、真空度为95.0Kpa、烘干时间为8h的真空干燥得到白色粉末状绿原酸，绿原酸单体纯度为95.85%，回收率为80.67%。
实施例3
一种从平卧菊三七中制备高纯度绿原酸的方法，其包括以下具体步骤：
步骤1、将平卧菊三七叶按长度为30mm～40mm进行切分，然后置于恒温干燥箱中60℃干燥30min，干燥后平卧菊三七叶含水量保持在初始重量70%，再进行粉碎，过40目筛，得到平卧菊三七叶粉末，装袋备用；
步骤2、称取平卧菊三七叶粉末100g加入5000ml体积百分比浓度为75%甲醇水溶液中，将其放入超声波清洗器中，提取温度为75℃，提取时间为30min，提取功率为600W，提取次数为5次，过滤，得到提取液，提取液即为绿原酸粗提取物，绿原酸提取率为3.33 %；
步骤3、将绿原酸对照品用流动相稀释制备对照品溶液，对步骤2得到的绿原酸粗提取物取样，样品用流动相稀释后，再通过孔径为0.60μm的滤膜过滤，滤液即为供试品溶液；将对照品溶液、供试品溶液分别进行HPLC分析，HPLC色谱条件：ODS C18色谱柱，4.6mm×250mm，5μm；流动相为乙腈-0.5%乙酸水溶液，乙腈与乙酸水溶液体积比为10：90；检测波长327nm；流速0.8mL/min；进样量为20μL；柱温为30℃；根据液相色谱结果，以样品峰面积与对照品峰面积比较来测定绿原酸含量；
步骤4、步骤2得到的绿原酸粗提取物，经MCI树脂柱分离，获得洗脱液，质量浓度为5.0mg/mL的洗脱液用中高压制备液相色谱分离纯化，制备色谱的分离条件：ODS C18色谱柱，920mm ×70mm；流动相为甲醇和水，甲醇和水的体积比40：60，梯度洗脱，浓度分别为10wt％、20wt％、30wt％、40wt％、50wt％甲醇，流速为12mL/min，检测波长327 nm，进样量为15mL；收集含有绿原酸的洗脱液，再通过温度为60℃、真空度为0.08Mpa的减压蒸馏、温度为70℃、真空度为99.0Kpa、烘干时间为10h的真空干燥得到白色粉末状绿原酸，绿原酸单体纯度为91.61%，回收率为73.12%。
实施例4
一种从平卧菊三七中制备高纯度绿原酸的方法，其包括以下具体步骤：
步骤1、将平卧菊三七叶按长度为30mm～40mm进行切分，然后置于恒温干燥箱中60℃干燥30min，干燥后平卧菊三七叶含水量保持在初始重量70%，再进行粉碎，过40目筛，得到平卧菊三七叶粉末，装袋备用；
步骤2、称取平卧菊三七叶粉末100g加入4500ml体积百分比浓度为70%甲醇水溶液中，将其放入超声波清洗器中，提取温度为50℃，提取时间为30min，提取功率为400W，提取次数为5次，过滤，得到提取液，提取液即为绿原酸粗提取物，绿原酸提取率为3.37%；
步骤3、将绿原酸对照品用流动相稀释制备对照品溶液，对步骤2得到的绿原酸粗提取物取样，样品用流动相稀释后，再通过孔径为0.48μm的滤膜过滤，滤液即为供试品溶液；将对照品溶液、供试品溶液分别进行HPLC分析，HPLC色谱条件：ODS C18色谱柱，4.6mm×250mm，5μm；流动相为乙腈-0.5%乙酸水溶液，乙腈与乙酸水溶液体积比为10：90；检测波长327nm；流速1.0mL/min；进样量为20μL；柱温为30℃；根据液相色谱结果，以样品峰面积与对照品峰面积比较来测定绿原酸含量；
步骤4、步骤2得到的绿原酸粗提取物，经MCI树脂柱分离，获得洗脱液，质量浓度为4.8mg/mL的洗脱液用中高压制备液相色谱分离纯化，制备色谱的分离条件：ODS C18色谱柱，920mm ×70mm；流动相为甲醇和水，甲醇和水的体积比40：60，梯度洗脱，浓度分别为10wt％、20wt％、30wt％、40wt％、50wt％甲醇，流速为10mL/min，检测波长327 nm，进样量为10mL；收集含有绿原酸的洗脱液，再通过温度为60℃、真空度为0.06Mpa的减压蒸馏、温度为70℃、真空度为99.5Kpa、烘干时间为12h的真空干燥得到白色粉末状绿原酸，绿原酸单体纯度为93.95%，回收率为75.24%。
上述的各个实施例中，步骤3中，对绿原酸粗提取物进行的HPLC检测方法，其包括以下步骤：
3.1、对照品溶液的制备：精密称取绿原酸对照品8 mg，置于100 mL容量瓶中，用流动相稀释摇匀并定容至刻度，即得含绿原酸80 μg/mL的对照品溶液；取1 mL对照品溶液，分别稀释2倍、4倍、8倍、16倍，得40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL的标准对照品溶液；
3.2、样品溶液制备：称取10g绿原酸提取物，用流动相稀释后，再通过孔径为0.45μ的的滤膜过滤，滤液即为供试品溶液；
3.3、分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定;
3.4、根据液相色谱结果，以样品峰面积与对照品峰面积比较来测定绿原酸含量。
3.5、线性关系考察
在HPLC条件下，分别将5种溶度的对照品溶液进样20μL，记录色谱峰面积。将对照品的峰面积设为纵坐标（Y），对照品的质量浓度设为横坐标（X），建立标准曲线方程，得回归方程为y=105046x-26123，r = 0.9997。结果显示，绿原酸在0.10~1.60μg范围内，Y与X呈良好线性关系。
3.6、样品含量测定及重复性实验
准确称取同一样品共5份，在步骤2的提取条件下提取后，按步骤3.2的操作制备5份供试品溶液，测得绿原酸含量平均值为3.53%，RSD为1.1%，表明测定方法重复性良好。
3.7、稳定性试验
对同一供试品溶液分别于制备后0、2、4、8、24 h测定绿原酸峰面积，结果RSD为1.3%，表明样品在24 h内具有良好的稳定性。
3.8、精密度试验
取同一批供试品溶液，连续进样5次，每次进样20 mL，测定峰面积值，RSD为0.94%。
3.9、回收率考察
精密称取已知含量的同批样品6份(平均含量为3.53%)，分别精密加入一定量的绿原酸对照品溶液，按步骤3.2的操作制备供试品溶液，测定并计算加样回收率。结果如表1所示。
表1 绿原酸加样回收率试验
从表1结果可见，加入绿原酸对照品后测得的绿原酸总量基本等于样品及对照品中绿原酸总量之和，且6组的绿原酸回收率均在98％以上，平均回收率达98.5％。可见本测试方法的绿原酸回收率较高。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，而非对本发明的限制，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明的专利保护范围之内。
Claims (3)
1.一种从平卧菊三七中制备高纯度绿原酸的方法，其特征是：其包括以下步骤：
步骤1、将平卧菊三七叶按长度为30mm～40mm进行切分，然后置于恒温干燥箱中50℃干燥34min，干燥后平卧菊三七叶含水量保持在初始重量60％，再进行粉碎，过60目筛，得到平卧菊三七叶粉末，装袋备用；
步骤2、称取平卧菊三七叶粉末100g加入4000ml体积百分比浓度为70％甲醇水溶液中，将其放入超声波清洗器中，提取温度为50℃，提取时间为30min，提取功率为400W，提取次数为3次，过滤，得到提取液，提取液即为绿原酸粗提取物，绿原酸提取率为3.58％；
步骤3、将绿原酸对照品用流动相稀释制备对照品溶液，对步骤2得到的绿原酸粗提取物取样，样品用流动相稀释后，再通过孔径为0.50μm的滤膜过滤，滤液即为供试品溶液；将对照品溶液、供试品溶液分别进行HPLC分析，HPLC色谱条件：ODS C18色谱柱，4.6mm×250mm，5μm；流动相为乙腈-0.5％乙酸水溶液，乙腈与乙酸水溶液体积比为10：90；检测波长327nm；流速0.5mL/min；进样量为20μL；柱温为30℃；根据液相色谱结果，以样品峰面积与对照品峰面积比较来测定绿原酸含量；
步骤4、步骤2得到的绿原酸粗提取物，经MCI树脂柱分离，获得洗脱液，质量浓度为4.2mg/mL的洗脱液用中高压制备液相色谱分离纯化，制备色谱的分离条件：ODS C18色谱柱，920mm×70mm；流动相为甲醇和水，甲醇和水的体积比40：60，梯度洗脱，浓度分别为10wt％、20wt％、30wt％、40wt％、50wt％甲醇，流速为10mL/min，检测波长327nm，进样量为10mL；收集含有绿原酸的洗脱液，再通过温度为50℃、真空度为0.05Mpa的减压蒸馏、温度为60℃、真空度为95.0Kpa、烘干时间为8h的真空干燥得到白色粉末状绿原酸，绿原酸单体纯度为95.85％，回收率为80.67％。
2.一种从平卧菊三七中制备高纯度绿原酸的方法，其特征是：其包括以下步骤：
步骤1、将平卧菊三七叶按长度为30mm～40mm进行切分，然后置于恒温干燥箱中40℃干燥40min，干燥后平卧菊三七叶含水量保持在初始重量55％，再进行粉碎，过80目筛，得到平卧菊三七叶粉末，装袋备用；
步骤2、称取平卧菊三七叶粉末100g加入2000ml体积百分比浓度为65％甲醇水溶液中，将其放入超声波清洗器中，提取温度为60℃，提取时间为40min，提取功率为450W，提取次数为3次，过滤，得到提取液，提取液即为绿原酸粗提取物，绿原酸提取率为3.35％；
步骤3、将绿原酸对照品用流动相稀释制备对照品溶液，对步骤2得到的绿原酸粗提取物取样，样品用流动相稀释后，再通过孔径为0.45μm的滤膜过滤，滤液即为供试品溶液；将对照品溶液、供试品溶液分别进行HPLC分析，HPLC色谱条件：ODS C18色谱柱，4.6mm×250mm，5μm；流动相为乙腈-0.5％乙酸水溶液，乙腈与乙酸水溶液体积比为10：90；检测波长327nm；流速0.5mL/min；进样量为20μL；柱温为30℃；根据液相色谱结果，以样品峰面积与对照品峰面积比较来测定绿原酸含量；
步骤4、步骤2得到的绿原酸粗提取物，经MCI树脂柱分离，获得洗脱液，质量浓度为3.5mg/mL的洗脱液用中高压制备液相色谱分离纯化，制备色谱的分离条件：ODS C18色谱柱，920mm×70mm；流动相为甲醇和水，甲醇和水的体积比40：60，梯度洗脱，浓度分别为10wt％、20wt％、30wt％、40wt％、50wt％甲醇，流速为12mL/min，检测波长327nm，进样量为20mL；收集含有绿原酸的洗脱液，再通过温度为40℃、真空度为0.08Mpa减压蒸馏、温度为50℃、真空度为99.5Kpa、烘干时间为12h的真空干燥得到白色粉末状绿原酸，绿原酸单体纯度为93.24％，回收率为75.22％。
3.一种从平卧菊三七中制备高纯度绿原酸的方法，其特征是：其包括以下步骤：
步骤1、将平卧菊三七叶按长度为30mm～40mm进行切分，然后置于恒温干燥箱中60℃干燥30min，干燥后平卧菊三七叶含水量保持在初始重量70％，再进行粉碎，过40目筛，得到平卧菊三七叶粉末，装袋备用；
步骤2、称取平卧菊三七叶粉末100g加入4500ml体积百分比浓度为70％甲醇水溶液中，将其放入超声波清洗器中，提取温度为50℃，提取时间为30min，提取功率为400W，提取次数为5次，过滤，得到提取液，提取液即为绿原酸粗提取物，绿原酸提取率为3.37％；
步骤3、将绿原酸对照品用流动相稀释制备对照品溶液，对步骤2得到的绿原酸粗提取物取样，样品用流动相稀释后，再通过孔径为0.48μm的滤膜过滤，滤液即为供试品溶液；将对照品溶液、供试品溶液分别进行HPLC分析，HPLC色谱条件：ODS C18色谱柱，4.6mm×250mm，5μm；流动相为乙腈-0.5％乙酸水溶液，乙腈与乙酸水溶液体积比为10：90；检测波长327nm；流速1.0mL/min；进样量为20μL；柱温为30℃；根据液相色谱结果，以样品峰面积与对照品峰面积比较来测定绿原酸含量；
步骤4、步骤2得到的绿原酸粗提取物，经MCI树脂柱分离，获得洗脱液，质量浓度为4.8mg/mL的洗脱液用中高压制备液相色谱分离纯化，制备色谱的分离条件：ODS C18色谱柱，920mm×70mm；流动相为甲醇和水，甲醇和水的体积比40：60，梯度洗脱，浓度分别为10wt％、20wt％、30wt％、40wt％、50wt％甲醇，流速为10mL/min，检测波长327nm，进样量为10mL；收集含有绿原酸的洗脱液，再通过温度为60℃、真空度为0.06Mpa的减压蒸馏、温度为70℃、真空度为99.5Kpa、烘干时间为12h的真空干燥得到白色粉末状绿原酸，绿原酸单体纯度为93.95％，回收率为75.24％。
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