CN108083992B - 一种提取分离五味子醇甲和五味子醇乙的简易方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药科技领域，公开了一种从五味子中提取分离五味子醇甲和五味子醇乙的简易方法，针对目前报道方法存在的工艺复杂、成本高、分离效果不佳、需要使用专用设备及大量有机溶剂等问题，本发明创造性的提出了采用提取油脂的方法提取五味子，再使用聚酰胺色谱法分离纯化其中五味子醇甲和五味子醇乙的方法。本发明提取过程中能减少杂质，尤其是多酚类成分的提出，减轻后续分离纯化工作的负担；提取物经简单处理后，仅需一次柱层析即可得到纯度大于90%的五味子醇甲和五味子醇乙，五味子醇甲回收率超过80%，五味子醇乙回收率超过15%。本方法工艺简单易行，成本低，有机溶剂用量少，尤其适用于工业生产。

Description

一种提取分离五味子醇甲和五味子醇乙的简易方法

技术领域

本发明属于医药科技领域，具体涉及一种简便易行、适用于工业生产的从五味子中提取分离五味子醇甲和五味子醇乙的方法。

背景技术

五味子（Schisandrae Chinensis Fructus）为木兰科植物五味子Schisandrachinensis (Turcz.) Baill. 的干燥成熟果实，具有联苯环辛二烯母核的木脂素类化合物是五味子中的主要成分，其中五味子醇甲和五味子醇乙含量最高，研究报道表明，其具有广泛的药理活性，涉及消化系统、中枢神经系统、心血管系统等多个方面，具有重要的研究和应用价值。目前有关五味子醇甲和五味子醇乙制备方法的文献报道较多，但同时也存在较多问题。

文献报道的五味子醇甲和五味子醇乙的提取方法，使用最多的为乙醇提取，如申请号为201510206880.2的发明专利“五味子木脂素单一组分的制备”，该方法简便易行，但提取液中成分复杂，给后续纯化工艺造成很大负担。此外还有以丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷为溶剂的浸提方法，如申请号为200910010631.0的发明专利“一种制备五味子醇甲和五味子醇乙的新工艺”，虽然能减少杂质提出，但这些提取溶剂危害性大，不适合在工业生产中大量使用。申请号为201410010518.3的发明专利“一种从北五味子中提取五味子乙素的复合式方法”采用离子液体、助剂和十六烷基三甲基溴化铵构成的复合提取剂，并添加碳酸钠辅助提取，使用试剂种类多、成本高，而且沸点高，不利于提取液的浓缩干燥。此外还有使用CO2超临界萃取的报道，如申请号为201310431854.0的发明专利，该方法环境污染小，但需要使用专用设备，而且每次提取的物料量较小。

在五味子醇甲和五味子醇乙的分离纯化上，文献报道的方法包括①大孔吸附树脂色谱法；②硅胶色谱法；③反相C18键合硅胶色谱法；④高速逆流色谱法。而这些方法在用于五味子木脂素类成分的分离时存在一些问题：比如采用大孔吸附树脂色谱法时，由于五味子木脂素类成分水溶性差，不利于样品的上样，而且在分离过程中易堵塞树脂床，有文献报道通过加入表面活性剂进行改善，如申请号为201510206880.2的发明专利“五味子木脂素单一组分的制备”，但由于大孔吸附树脂的分离效果差，多用于提取物中木脂素类成分的富集，难以制备单体化合物。硅胶色谱法的分离效果虽优于大孔吸附树脂色谱法，但其原理同为吸附色谱，文献报道中至少需经两次以上柱层析才能获得五味子醇甲和五味子醇乙的单体化合物，如申请号为200910010631.0的发明专利“一种制备五味子醇甲和五味子醇乙的新工艺”，且洗脱剂中的有机试剂种类多用量大，存在较严重的环境污染和生产安全性问题。反相C18键合硅胶色谱法为分配色谱，在分离结构相似的五味子木脂素时能取得较好效果，但价格昂贵，易污染，上样样品纯度要求高，需具备一定的水溶性，且上样量小，因此仅限于实验室规模级别的制备而难以放大应用于工业化生产。高速逆流色谱法需要使用专用设备，且使用的有机试剂种类多用量大，同样未能应用于工业化生产。文献报道中常将上述方法组合使用以获得更好的分离效果，如申请号为201510206880.2的发明专利“五味子木脂素单一组分的制备”，申请号为200910010631.0的发明专利“一种制备五味子醇甲和五味子醇乙的新工艺”，申请号为200910242188.X的发明专利“五味子单体成分的分离制备方法”等，但同时也增加了工序和损耗，提高了成本。

聚酰胺作为色谱填料使用时，具有氢键吸附色谱和分配色谱的双重性质，使用含水甲醇或乙醇为洗脱剂时，主要表现出类似于反相C18键合硅胶的分配色谱的性质，但价格低廉，因此适用于工业化生产级别的精细分离，如果能用于五味子醇甲和五味子醇乙的分离纯化，可在很大程度上弥补目前报道方法的不足。但是由于聚酰胺对多酚类成分吸附力很强，而五味子中多酚含量较高，可对聚酰胺造成很大毒性，影响其分离效果，因此目前尚未见将聚酰胺色谱法用于分离纯化五味子木脂素类单体化合物的报道。针对上述问题，综合考虑五味子木脂素极性小，以及五味子中含有较多油脂的特点，本发明创造性的提出了采用提取油脂的方法提取五味子以降低提取物中多酚含量，再使用聚酰胺色谱法分离纯化其中的五味子醇甲和五味子醇乙的方法，并进行了实验验证和工艺考察，为五味子醇甲和五味子醇乙的工业化生产提供了一种简便易行的新方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种简便易行的、适用于工业生产的五味子醇甲和五味子醇乙的提取分离方法。由于五味子醇甲和五味子醇乙极性较小，所以采用提取油脂的方法提取五味子，可减少杂质成分尤其是多酚的提出；提取物经甲醇处理后，采用聚酰胺色谱法进行分离，只需一次柱层析即可得到纯度大于90%的五味子醇甲（最高纯度可达98%）和五味子醇乙，五味子醇甲回收率超过80%，五味子醇乙回收率超过15%。

本发明采用的技术方案是：

1. 提取方法：提取五味子中的油脂，包括浸出法和压榨法两种方法。

（1）浸出法：取五味子，粉碎，干燥，加入5 ~ 15倍量（v/w）的植物油抽提溶剂，30 ~90℃下浸提2 ~ 3次，每次提取1 ~ 4小时，过滤，提取液回收溶剂，得五味子油提取物。

该步骤中，所述植物油抽提溶剂为正己烷、环己烷、石油醚中的任意一种或两种以上的混合溶剂。

（2）压榨法：取五味子，除去果肉，将种子洗净，干燥，使用榨油设备压榨出油，榨膛温度40 ~ 120℃，静置或离心除去杂质，得五味子油提取物。

2. 分离方法：采用聚酰胺色谱法分离纯化提取物中的五味子醇甲和五味子醇乙。

取步骤1中所得的五味子油提取物，加入20 ~ 100倍量（v/w）的甲醇，搅拌、超声使充分混合，静置或离心，取上清液，除去甲醇，剩余物为待分离样品，加适量有机溶剂溶解，加至1 ~ 3倍量（w/w）的聚酰胺粉末中拌样。取待分离样品20 ~ 100倍量（w/w）的聚酰胺粉末装入色谱柱并加入拌好的样品，加洗脱剂洗脱1 ~ 5个柱床体积（BV），收集含有五味子醇甲的流分，浓缩，静置或冷藏，收集沉淀，得五味子醇甲单体化合物（纯度最高可达98%）；继续洗脱2 ~ 10 BV，收集含有五味子醇乙的流分，浓缩，静置或冷藏，收集沉淀，得五味子醇乙单体化合物（纯度最高可大于90%）。

该步骤中，所使用的洗脱剂为甲醇水溶液、乙醇水溶液中的任意一种，甲醇水溶液或乙醇水溶液的浓度为5 ~ 45%；洗脱剂中可在甲醇水溶液或乙醇水溶液中加入浓度为0.1~ 2%的酸，酸的种类为甲酸、乙酸中的任意一种；洗脱速度为0.2 ~ 2 BV/h，洗脱过程使用高效液相色谱（HPLC）进行监测。

本发明的有益效果为：

1. 通过提取五味子中的油脂来提取其中的木脂素类成分，与报道的常用方法（如乙醇提取）相比，能减少杂质成分，尤其是多酚类成分的提出，减轻了后续分离纯化工作的负担，为聚酰胺色谱法的使用创造了有利条件。

2. 采用聚酰胺色谱法分离纯化五味子醇甲和五味子醇乙，和已报道的方法相比具有以下优势：和大孔吸附树脂色谱法相比，使用聚酰胺色谱法上样操作更简易，不需加助溶剂，分离过程中也不存在柱床堵塞的问题，且分离效果更好，能够直接分离到单体化合物。和硅胶色谱法相比，本发明所使用的洗脱剂主要组分为水，有机试剂的种类和用量都很少，在环境友好性和生产安全性方面更具优势。和反相键合硅胶相比，聚酰胺价格低廉，适用于大规模工业生产。

3. 本发明解决了已报道的五味子醇甲和五味子醇乙制备方法中存在的问题，不需要使用特殊设备和大量有机溶剂，不需要两种或多种分离方法联用，不需要反复柱层析操作。将五味子经简单的提取、处理之后，只经一次柱层析即可得到高纯度的五味子醇甲和五味子醇乙单体化合物，而且具有较高的得率和回收率，方法简便易行，尤其适合工业生产使用。

附图说明

图1为实施例4制得的五味子醇甲的高效液相色谱图。

图2为实施例4制得的五味子醇乙的高效液相色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1：提油法与其他方法提取五味子的对比试验

取五味子300 g，粉碎，干燥，分别采用以下方法提取：

（1）提油法（浸出法）：加入10倍量（v/w）的植物油抽提溶剂（正己烷），60℃下浸提3次，每次提取1.5小时，过滤，提取液回收溶剂，得五味子油提取物。

（2）乙醇提取法：加入10倍量（v/w）的75%乙醇水溶液，回流提取3次，每次提取1.5小时，过滤，提取液回收溶剂，得五味子乙醇提取物。

（3）丙酮提取法：加入10倍量（v/w）的80%丙酮水溶液，回流提取3次，每次提取1.5小时，过滤，提取液回收溶剂，得五味子丙酮提取物。

（4）乙酸乙酯提取法：加入10倍量（v/w）的乙酸乙酯，60℃下浸提3次，每次提取1.5小时，过滤，提取液回收溶剂，得五味子乙酸乙酯提取物。

以上提取物分别精密称定重量，计算提取物得率（提取物量/药材量），并采用福林酚法测定总酚含量，采用HPLC外标法测定五味子醇甲和五味子醇乙含量，计算得率（提取物中产物量/所使用药材量）和回收率（提取物中产物量/所使用药材中产物总量），结果见表1。

结果表明，使用浸出提油法提取五味子时，五味子醇甲和五味子醇乙的回收率分别接近90%和100%，表明已提取完全，同时，与常用提取方法如乙醇提取法相比，采用提油法可将提取物得率降低60%，总酚得率降低98%，即提油法在保证五味子醇甲和五味子醇乙提取充分的同时，可显著降低杂质成分的提取率，从而减轻后续分离纯化工作的负担。

实施例2：不同提油法提取五味子的对比试验

取五味子300 g，分别采用以下方法提取五味子油：

（1）浸出法（正己烷）：方法同实施例1中的方法（1）。

（2）浸出法（环己烷）：改用环己烷作为植物油抽提溶剂，其余方法同实施例1中的方法（1）。

（3）浸出法（石油醚）：改用石油醚（60-90）作为植物油抽提溶剂，其余方法同实施例1中的方法（1）。

（4）压榨法：五味子除去果肉，将种子洗净，干燥，使用榨油设备压榨出油，榨膛温度105℃，静置或离心除去杂质，得五味子油提取物。

以上五味子油提取物分别精密称定重量，计算出油率，并测定五味子醇甲和五味子醇乙含量，计算得率和回收率，结果见表2。

结果表明，使用三种植物油抽提溶剂浸出提取得到的五味子油中，五味子醇甲和五味子醇乙的得率和回收率相近，而压榨法的出油率为浸出法的30%，五味子醇甲和五味子醇乙的得率也较低，推测是由于药材和设备中有残留导致。

实施例3：聚酰胺与其他色谱法分离纯化五味子醇甲和五味子醇乙的对比试验

取五味子油提取物13.5g（相当于原药材100g），加入50倍量（v/w）的甲醇，搅拌、超声使充分混合，静置或离心，取上清液，除去甲醇，剩余物5g，为待分离样品，分别采用以下色谱法进行分离纯化，柱层析次数仅限一次。

（1）将待分离样品加适量有机溶剂溶解，加至2倍量（w/w）的聚酰胺粉末中拌样，除去有机溶剂。取待分离样品60倍量（w/w）的聚酰胺粉末装入色谱柱并加入拌好的样品，以5%乙醇水溶液为洗脱剂，洗脱速度0.3 BV/h，使用HPLC进行监测，洗脱3 BV后，收集含有五味子醇甲的流分，浓缩，静置或冷藏，收集沉淀；以8%乙醇水溶液继续洗脱5 BV后，收集含有五味子醇乙的流分，浓缩，静置或冷藏，收集沉淀。

（2）将待分离样品加适量无水乙醇溶解，吸附于6倍量（w/w）的AB-8型大孔吸附树脂上，除去溶剂。取待分离样品60倍量（w/w）的大孔吸附树脂装入色谱柱并加入拌好的样品，以20%、40%、60%、80%乙醇水溶液为洗脱剂依次洗脱，洗脱速度1 BV/h，每个浓度梯度洗脱5 BV，使用HPLC进行监测，收集含有五味子醇甲、五味子醇乙的流分，浓缩，静置或冷藏，收集沉淀。

（3）大孔吸附树脂型号替换为HPD300，其余方法与（2）相同。

（4）大孔吸附树脂型号替换为NKA-9，其余方法与（2）相同。

（5）大孔吸附树脂型号替换为D101，其余方法与（2）相同。

（6）将待分离样品加适量有机溶剂溶解，加至2倍量（w/w）的柱层析硅胶中拌样，除去有机溶剂。取待分离样品60倍量（w/w）的柱层析硅胶装入色谱柱并加入拌好的样品，以石油醚-乙酸乙酯20:1、10:1、8:1为洗脱剂依次洗脱，洗脱速度0.6 BV/h，每个浓度梯度洗脱8BV，使用薄层色谱（TLC）进行监测，收集含有五味子醇甲、五味子醇乙的流分，浓缩，静置或冷藏，收集沉淀或结晶。

以上收集的产物分别精密称定重量，并测定五味子醇甲和五味子醇乙的含量，计算五味子醇甲（纯度>98%和纯度>90%）、五味子醇乙（纯度>90%）的得率和回收率，结果见表3。

结果表明，使用聚酰胺色谱法时，仅经过一次柱层析，即可获得纯度大于90%的五味子醇甲（最高纯度可达98%）和五味子醇乙单体化合物，得率为硅胶色谱法的40倍和8倍，且有机溶剂的用量远远少于硅胶色谱法。而以几种大孔吸附树脂为色谱填料时均无法获得五味子醇甲和五味子醇乙单体化合物。

实施例4：聚酰胺色谱法分离纯化五味子醇甲和五味子醇乙的洗脱条件考察

（1）方法同实施例3中的方法（1）。

（2）将洗脱剂替换为以8%甲醇水溶液为洗脱剂，洗脱3 BV后，收集含有五味子醇甲的流分；以12%甲醇水溶液继续洗脱5 BV后，收集含有五味子醇乙的流分；其余方法同实施例3中的方法（1）。

（3）将洗脱剂替换为以8%甲醇水溶液（含0.1%甲酸）为洗脱剂，洗脱3 BV后，收集含有五味子醇甲的流分；以12%甲醇水溶液（含0.4%甲酸）继续洗脱5 BV后，收集含有五味子醇乙的流分；其余方法同实施例3中的方法（1）。

（4）将洗脱剂替换为以8%甲醇水溶液（含0.2%乙酸）为洗脱剂，洗脱3 BV后，收集含有五味子醇甲的流分；以12%甲醇水溶液（含0.8%乙酸）继续洗脱5 BV后，收集含有五味子醇乙的流分；其余方法同实施例3中的方法（1）。

以上方法收集的产物分别精密称定重量，HPLC法分别测定五味子醇甲和五味子醇乙的含量，结果见表4、5和附图1、2，并计算五味子醇甲（纯度>98%和纯度>90%）、五味子醇乙（纯度>90%）的得率和回收率，结果见表6。

结果表明相较于乙醇水溶液，以甲醇水溶液为洗脱剂时，分离得到的五味子醇甲纯度更高，五味子醇乙的得率和回收率也提高，而在洗脱剂中加入甲酸或乙酸，能够进一步提高五味子醇甲的纯度和五味子醇乙的得率。

Claims (5)

1.一种提取分离五味子醇甲和五味子醇乙的简易方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）取五味子，提取其中的油脂，所使用的提取方法为浸出法，得到五味子油提取物；所述浸出法的工艺为：物料加入5 ~ 15倍量v/w的植物油抽提溶剂，30 ~ 90℃下浸提2 ~ 3次，每次提取1 ~ 4小时，所使用的植物油抽提溶剂为正己烷、环己烷、石油醚中的任意一种或两种以上的混合溶剂；

（2）取步骤（1）中的五味子油提取物，用聚酰胺拌样，再经聚酰胺柱色谱进行分离，加洗脱剂洗脱，分别收集含有五味子醇甲、五味子醇乙的流分，得五味子醇甲、五味子醇乙单体化合物；所述五味子油提取物拌样前先除去部分脂肪方法为：加入五味子油提取物20 ~100倍量v/w的甲醇，使充分混合，静置或离心，取上清液，除去甲醇，剩余物为待分离样品。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中聚酰胺柱色谱装填使用的聚酰胺用量为待分离样品的20 ~ 100倍量w/w。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中所使用的洗脱剂为甲醇水溶液或乙醇水溶液，甲醇水溶液或乙醇水溶液浓度为5 ~ 45%。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（2）中所使用的甲醇水溶液或乙醇水溶液中可加入浓度为0.1 ~ 2%的酸，所述酸的种类为甲酸或乙酸。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中的洗脱速度为0.2 ~ 2 BV/h，洗脱过程使用高效液相色谱监测。

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