一种降血脂化合物茯茶素A的制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及一种降血脂化合物及其制备方法和用途。
背景技术
高脂血症(hyperlipidemia,HLP)是人体内脂质代谢失常,血浆中一种或多种脂质成分异常增高的一种病症,表现为高胆固醇血症、高甘油三酯血症或两者兼有。高脂血症可诱发动脉粥样硬化,心脑血管疾病,如高血压、冠心病、脑血管病、老年性痴呆等。因此,高脂血症的危害已成为世界范围关注的问题。
茯茶素A(Teadenol A)由日本学者在日本发酵茶中发现并命名,具有显著的降脂功效(Wulandari RA,Amano M,Yanagita T,Tanaka T,Kouno I,Kawamura D and IshimaruK.New phenolic compounds from Camellia sinensis L.leaves fermented withAspergillus sp.Journal of Natural Medicines 2011,65:594-597)。但目前尚未有一种成熟的茯茶素A(Teadenol A)的制备方法。
发明内容
本发明目的是提供一种降血脂化合物茯茶素A的制备方法,以及该化合物在降血脂方面的用途。通过接种黑曲霉发酵茶叶,并通过柱色谱、萃取等技术纯化加工制备茯茶素A。
本发明通过如下技术方案实现:
一种降血脂化合物茯茶素A的制备方法,所述化合物茯茶素A的结构式如下
制备步骤如下:
(1)原料发酵:发酵的原料为晒青毛茶,潮水至含水量25-40%,115-125℃灭菌20-30min,按接种量≥1×106孢子/g接入黑曲霉,28℃培养15-21d,取出茶叶在50-60℃的条件下烘干到含水率低于8%;
(2)粉粹:将发酵后的茶叶粉碎过50-60目筛;
(3)溶剂提取:粉碎茶叶中按质量比1:5-10加入体积浓度为80%甲醇,在50℃、50-60Hz和100-150w超声波条件下震荡浸提2次,每次1小时,过滤,合并滤液;
(4)浓缩:将浸提后合并的滤液用减压旋转浓缩仪,40℃浓缩20-30倍体积;
(5)柱色谱分离纯化:对步骤(4)得到的浓缩液,依次选用硅胶和葡聚糖凝胶为填料的硅胶色谱柱和葡聚糖凝胶色谱柱进行分离洗脱,先用硅胶色谱柱,体积浓度10%的乙醇溶液为洗脱剂,收集含有目标化合物的馏分并浓缩得到前期浓缩液;然后用葡聚糖凝胶色谱柱,以超纯水洗脱剂,分离得到的前期浓缩液,收集含有目标化合物的馏分并浓缩得到后期浓缩液;
(6)萃取:后期浓缩液中按质量体积比1:5加入乙腈,静置,待分层后放出下层浑浊液,收集上层清液;
(7)冷冻干燥:将收集的上层清液放入-80℃冰箱冷冻1小时,用冻干机在-67.1℃冷冻干燥24小时,经高效液相色谱法检测获得纯度达98%以上的化合物茯茶素A。
进一步优选的是,步骤(5)中所述的硅胶色谱柱为内径7cm,填料为MCI GEL CHP20P75~150μm,硅胶色谱柱分离时每100mL收集一次,收集在300~500mL之间液体旋转蒸发并浓缩。
进一步优选的是,步骤(5)中所述葡聚糖凝胶色谱柱为内径5.5cm和内径3cm,填料为SephadexTM LH-20;先用内径5.5cm葡聚糖色谱柱分离,每50mL收集1次,收集在100~200mL之间液体浓缩,然后用内径3cm葡聚糖色谱柱分离,每20mL分段收集;收集在40~100mL液体浓缩得后期浓缩液。
所述的化合物茯茶素A在制备降血脂药物中的应用。
本发明获得的单体化合物茯茶素A经过质谱检测其精确分子量为276.0638,分子式为C14H12O6,核磁共振H谱、C谱、DEPT谱、HMBC、HSQC和TOCOSY谱分析,与日本学者发现的茯茶素A(Teadenol A)结构相同,详细结果见表1。
表1 茯茶素A的核磁共振结果(in MeOD)
附图说明
图1:本发明提供的发酵茶样浓缩液1过内径7cm硅胶色谱柱(MCI GEL CHP 20P)分部收集样品HPLC检测结果,其中300~500mL之间液体含有目标化合物,旋转蒸发得浓缩液2。
图2:本发明提供的浓缩液2过内径5.5cm葡聚糖色谱柱(SephadexTM LH-20)分部收集样品HPLC检测结果,其中100~200mL之间液体含有目标化合物,浓缩得浓缩液3。
图3:本发明提供的浓缩液3过内径3.0cm葡聚糖色谱柱(SephadexTM LH-20))分部收集样品HPLC检测结果,其中40~100mL液体含有目标化合物,浓缩得浓缩液4。
具体实施方式
以下结合实施例及其附图进一步说明本发明。本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过购买获得的常规产品。
实施例一
茯茶素A的制备
称取500g(干重)的晒青毛茶,潮水至含水量为30-35%,分装在500ml三角瓶中,121℃灭菌20min,将黑曲霉接入茶叶中,接种量5×106孢子/g,放入28℃的生化培养箱中培养,15d后取出茶样在50℃烘箱中烘干到含水率6%;将茶样粉碎过60目筛;称取250g粉碎茶叶,加入茶叶重量五倍量的体积浓度为80%甲醇,用超声波清洗器在50℃、50Hz、120w条件下震荡浸提2次,每次1h,过滤,合并滤液;将浸提后的滤液用减压旋转浓缩仪在40℃浓缩得浓缩液1(50ml);柱色谱分离纯化,选用内径7cm硅胶(MCI GEL CHP 20P 75~150μ)色谱柱,10%乙醇溶液为洗脱剂,每100mL收集1次;收集在300~500mL之间液体旋转蒸发得浓缩液2(50ml);以葡聚糖凝胶(SephadexTM LH-20)为填料,用直径5.5cm色谱柱分离浓缩液2,以超纯水为洗脱剂,每50mL收集1次,收集在100~200mL之间液体浓缩得浓缩液3(20ml);然后用直径3cm葡聚糖色谱柱分离浓缩液3,以超纯水进行洗脱,每20mL分段收集;收集在40~100mL液体中浓缩得浓缩液4(20ml)。将浓缩液4加入分液漏斗,加入100ml乙腈,待分层后放出下层浑浊液,收集上层清液进行旋转蒸发浓缩得浓缩液5(20ml);冷冻干燥,将收集的上层清液放入-80℃冰箱冷冻1h,后用冻干机(-67.1℃)冷冻干燥24h,获得11.32g纯度为98.94%的茯茶素A。
实施例二
茯茶素A的制备
称取1000g(干重)的晒青毛茶,潮水至含水量为28-30%,分装在500ml三角瓶中,115℃灭菌28min,将黑曲霉接入茶叶中,接种量2×107孢子/g,放入28℃的生化培养箱中培养,21d后取出茶样在60℃烘箱中烘干到含水率5%;将茶样粉碎过60目筛;称取350g粉碎茶叶,加入茶叶重量八倍量的体积浓度为80%甲醇,用超声波清洗器在50℃、60Hz、100w条件下震荡浸提2次,每次1h,过滤,合并滤液;将浸提后的滤液用减压旋转浓缩仪40℃浓缩得浓缩液1(50ml);柱色谱分离纯化,选用内径7cm硅胶(MCI GEL CHP 20P 75~150μ)色谱柱,10%乙醇溶液为洗脱剂、每100mL收集1次;收集在300~500mL之间液体 旋转蒸发得浓缩液2(50ml);以葡聚糖凝胶(SephadexTM LH-20)为填料,用内径5.5cm色谱柱分离浓缩液2,以超纯水洗脱剂,每50mL收集1次,收集在100~200mL之间液体浓缩得浓缩液3(20ml);然后用内径3cm葡聚糖色谱柱分离浓缩液3,以超纯水进行洗脱,每20mL分段收集;收集在40~100mL液体中浓缩得浓缩液4(20ml)。将浓缩液4加入分液漏斗,加入100ml乙腈,待分层后放出下层浑浊液,收集上层清液进行旋转蒸发浓缩得浓缩液5(20ml);冷冻干燥,将收集的上层清液放入-80℃冰箱冷冻1h,后用冻干机(-67.1℃)冷冻干燥24h,获得10.2g纯度为97.0%的茯茶素A。
实施例三
茯茶素A的制备
称取2000g(干重)的晒青毛茶,潮水至含水量为26-28%,分装在500ml三角瓶中,125℃灭菌30min,将黑曲霉接入茶叶中,接种量5×106孢子/g,放入28℃的生化培养箱中培养,20d后取出茶样在55℃烘箱中烘干到含水率4%;将茶样粉碎过50目筛;称取550g粉碎茶叶,加入茶叶重量十倍量的体积浓度为80%甲醇,用超声波清洗器在50℃、60Hz、150w条件下震荡浸提2次,每次1h,过滤,合并滤液;将浸提后的滤液用减压旋转浓缩仪40℃浓缩得浓缩液1(50ml);柱色谱分离纯化,选用内径7cm硅胶(MCI GEL CHP 20P 75~150μ)色谱柱,10%乙醇溶液为洗脱剂、每100mL收集1次;收集在300~500mL之间液体旋转蒸发得浓缩液2(50ml);以葡聚糖凝胶(SephadexTM LH-20)为填料,用内径5.5cm色谱柱分离浓缩液2,以超纯水洗脱剂,每50mL收集1次,收集在100~200mL之间液体浓缩得浓缩液3(20ml);然后用内径3cm葡聚糖色谱柱分离浓缩液3,以超纯水进行洗脱,每20mL分段收集;收集在40~100mL液体中浓缩得浓缩液4(20ml)。将浓缩液4加入分液漏斗,加入100ml乙腈,待分层后放出下层浑浊液,收集上层清液进行旋转蒸发浓缩得浓缩液5(20ml);冷冻干燥,将收集的上层清液放入-80℃冰箱冷冻1h,后用冻干机(-67.1℃)冷冻干燥24h,获得13.5g纯度为97.5%的茯茶素A。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例,对于本领域的普通技术人员而言,可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。