CN104327026B - 一种提取分离木香烃内酯和去氢木香烃内酯的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种提取分离木香烃内酯和去氢木香烃内酯的方法，它是采用高速逆流色谱法进行分离的。本文首次对川木香中木香烃内酯和去氢木香内酯作了高速逆流分离研究。本发明中选择使用的三元体系，可以在15秒内迅速分层，有很高的固定相保留率，虽然溶剂种类少，但是能够有效将上述两种成分有效分离，得到了高纯度的目标化合物，同时因为是采用的毒性极小的石油醚和乙醇，并且分离时间可以在3小时内完成，有机溶剂用量少，对环境污染小，也降低了对操作人员的健康影响。

Description

一种提取分离木香烃内酯和去氢木香烃内酯的方法
技术领域
本发明涉及一种提取分离木香烃内酯和去氢木香烃内酯的方法。
背景技术
川木香为菊科植物川木香Vladimiriasouliei(Franch.)Ling或灰毛川木香Vladimiriasouliei(Franch.)Lingvar.cinereaLing的干燥根，能行气止痛。因四川阿坝藏族自治州是其主要产区之一，因此也被认为是藏系药材的一种，在藏药及藏成药中广泛使用。
川木香根中含挥发油类成分，目前用GC/MS鉴定了其中20多种成分，其主要成分为去氢木香烃内酯，除此之外，还含有木香烃内酯、愈创木-4(15)，10(14)，11(13)-三烯-12，6α-内酯[guaia-4(15)，10(14)，11(13)-triene-12，6α-olide]，3β-乙酰氧基愈创木-4(15)，10(14)，11(13)-三烯-12，6α-内酯[3β-acetoxyguaia-4(15)，10(14)，11(13)-trien-12，6α-olide]，3β-羟基-11βH-愈创木-4(15)，10(14)二烯-12，6α-内酯等多种成分。
高速逆流色谱(High-speedcounter-currentchromatography,简称HSCCC)分离技术是一种连续高效的液-液分配色谱分离技术,它不用任何固态的支撑物或载体，利用两相溶剂体系在高速旋转的螺旋管内建立起一种特殊的单向性流体动力学平衡,其中一相作为固定相,另一相作为流动相,在连续洗脱的过程中能保留大量的固定相，物质的分离依据其在两相中分配系数的不同而实现，特别适合于天然产物活性成分的分离。
木香和川木香两种药材都富含木香烃内酯与去氢木香内酯，只是川木香中的成分更为复杂一些。目前有文献报道了使用HSCCC技术，采用乙酸酯/正丙醇或丁醇/乙醇或甲醇/水这种四元体系溶剂系统对木香中所含的去氢木香烃内酯和木香烃内酯进行分离纯化的方法，这种系统溶剂种类较为复杂，操作不简便，并且，正丙醇沸点为97.1℃，正丁醇沸点为117.7℃，会带入木香烃内酯和去氢木香内酯的纯品中，难于除去，需要经过冷冻干燥或重结晶等纯化操作除去，增加了昂贵的仪器和更加繁琐的操作步骤。另外，也有人用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(2：0.5：2：1)溶剂系统对木香中的两种成分进行分离,该方法中溶剂体系同样较为复杂，而且使用了毒性较大的甲醇等有机溶剂，不值得推荐。
AifengLi等，以石油醚-甲醇-水(5:6.5：3.5)为溶剂系统，分离得到了纯度在98％以上的去氢木香烃内酯和木香烃内酯，其为三元溶剂系统，较之四元体系更为简单，然而，该方法所用溶剂中含有甲醇，分离时间极长，在250分钟以上，甲醇致癌，并且有视神经毒性，对操作人员的健康有害，时间长溶剂用量多；固定相保留率较低，仅有50％，固定相保留率越高，负载的样品量就多，固定相保留率低，对于样品的负载量就小，一般要求固定相保留率要大于50％(AifengLi,et.PreparativeisolationandpurificationofcostunolideanddehydrocostuslactonefromAucklandialappaDecnebyhigh-speedcounter-currentchromatography.J.Chromatogr.A1076,2005,193-197)。
发明内容
基于上述现有技术的缺点，本发明的目的旨在提供一种溶剂系统简单、毒性更低、且分离速度快、效果好的提取分离方法。
具体地，本发明提供了一种提取分离木香烃内酯和去氢木香烃内酯的方法，其特征在于：它包括如下操作步骤：
(1)提取：取木香或川木香药材，粉碎后，加石油醚、乙醇、甲醇、乙酸乙酯，丙酮，乙醚中的一种或两种以上的溶剂浸泡，提取，合并提取液，除去溶剂后，得粗提物；
(2)采用高速逆流色谱法分离：
取石油醚-乙醇-水＝＝5：5-10：1-10，置于分液漏斗中震荡，静置分层，取上相为固定相，下相位流动相；将固定相充满逆流色谱的色谱柱，主机正转,转速为400-1000r/min,然后以1-10ml/min的流速泵入流动相,至两相溶剂在柱中达到平衡状态；步骤(1)制备的粗提物，以流动相为溶剂溶解，制备样品溶液；将样品溶液进样,在紫外检测器监测下分别接收目标成分，将各流分减压回收溶剂后，干燥或浓缩后重结晶，即可分别得到木香烃内酯和去氢木香烃内酯。
采用本发明方法对两成分进行分离时，在相应紫外波长下，会形成两个较为突出的色谱峰，并且杂峰极少，操作过程中可以按照常规方法分段收集，再做成分比对、分析，即可实现对木香烃内酯和去氢木香烃内酯的收集、分离，即便试验人员、试验仪器等导致出峰时间的偏差，也不会影响对两种成分的有效分离。
步骤(1)中，所述提取方法为超声、浸渍、回流、微波、超临界流体或渗漉提取中的任一种。两种成分提取是否完全，可以通过液相或气相等常规检测手段进行考察。
进一步地，步骤(1)中，药材与溶剂的质量体积比为1：1-20g/ml。
本发明一个具体实施方式中，药材与溶剂的质量体积比为1:5g/ml。
进一步地，步骤(1)中，所述溶剂选自石油醚或乙醇。
在HSCCC技术领域中，一般使用的石油醚沸程为60-90℃，乙醇通常也采用95％乙醇或无水乙醇，因此，本发明使用到的两种溶剂也同样如此。
更进一步地，超声提取时间为10-60min，本发明一个具体实施方式中，超声提取时间为30min。
当然，本发明中，对药材的提取以是否将木香烃内酯和去氢木香烃内酯提取完全为标准，可以使用高效液相色谱法或气相色谱进行监测，以便找到较为适宜的提取条件如溶剂用量、提取时间和溶剂种类，不应限于上述描述。
本发明研究表明，使用如下溶剂系统石油醚-乙醇-水＝5：5：2.5、石油醚-乙醇-水＝5：7：3、石油醚-乙醇-水＝5：5：5、石油醚-乙醇-水＝5：6.5：3.5，均能够有效分离川木香中的木香烃内酯和去氢木香烃内酯，因此，本发明将溶剂系统配比范围进一步限定为石油醚-乙醇-水＝5：(5-7)：(2.5-5)。
另外，本发明实验还发现，当溶剂系统选自石油醚-乙醇-水＝5：7：3时，可以在150min内完成分离，加速了对两种成分的分离进程，因此，本发明优选此溶剂系统。
进一步地，步骤(2)中，转速为900r/min，流速为2ml/min。
进一步地，步骤(2)中，紫外检测器的检测波长为210-280nm，本发明一个具体实施方式中，检测波长为254nm。
进一步地，步骤(2)中，每次进样量以粗提物计为10mg-2g，本发明一个具体实施方式中，每次进样量以粗提物计为100～200mg。
进一步地，步骤(2)中，粗提物与溶解用流动相的质量体积比为0.01:20g/ml-2:20g/ml，本发明一个具体实施方式中，粗提物与溶解用流动相的质量体积比为0.1:20g/ml。
本文首次对川木香中木香烃内酯和去氢木香内酯作了高速逆流分离研究。本发明中选择使用的三元体系，可以在15秒内迅速分层，有很高的固定相保留率，虽然溶剂种类少，但是能够有效将上述两种成分有效分离，得到了高纯度的目标化合物，同时还采用毒性极小的石油醚和乙醇，并且分离时间可以在3小时内完成，有机溶剂用量少，对环境污染小，也降低了对操作人员的健康影响。
由于木香和川木香两种药材都富含木香烃内酯与去氢木香内酯，只是川木香中的成分更为复杂一些，因此，本发明方法亦适用于对成分更简单的木香中两种成分进行提取分离。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1川木香粗提物高速逆流色谱图
图2UPLC图，(A)川木香粗提物,(B)图2HSCCC流分Ⅰ,(C)图2HSCCC流分Ⅱ,(D)对照品1-木香烃内酯，2-去氢木香内酯
具体实施方式
实施例1本发明提取分离方法
A、溶剂系统的配制：室温下按石油醚-乙醇-水(5:7:3)比例配制溶液适量,置分液漏斗中震荡,静置分层，上相作为固定相，下相作为流动相。
B、样品制备：取100g木香药材(过三号筛)，加500ml石油醚，浸泡过夜，超声提取30分钟。同法提取两次。合并提取液、过滤，滤液旋转蒸干，得3.8g川木香粗提物。取100mg川木香粗提物浸膏加流动相20ml,使样品充分溶解。
C、高速逆流色谱分离HSCCC：将色谱柱由首端向尾端充满固定相(上相),主机正转,转速为900r/min,然后以2ml/min的流速泵入流动相(下相),待流动相流出两相溶剂在柱中达到平衡状态时,固定相保留率为78％。通过进样阀注入样品,用紫外检测器在波长254nm进行监测,同时用记录仪记录色谱图,如图1所示，收集峰Ⅰ和峰Ⅱ的流出液。
D、分离所得产物的结构鉴定及纯度分析：流分Ⅰ，Ⅱ减压回收溶剂后真空干燥分别得20.1mg、24.5mg白色晶体,取少量晶体用甲醇溶解后进行UPLC分析,并与标准品对照,结果见图2(B、C、D)，表明流分Ⅰ为木香烃内酯，Ⅱ为去氢木香内酯,UPLC外标法测定木香烃内酯纯度为98.1％,去氢木香内酯为98.4％。
进行H谱与C谱的测定，鉴定出Ⅰ为木香烃内酯，Ⅱ为去氢木香内酯。
UPLC分析条件XtimateTMC18色谱柱(2.1mm×100mm，1.8μm)；流动相为甲醇-水(75：25)；检测波长254nm；流速0.25ml/min；柱温35℃；进样量2μL，对上述粗提物进行分析，得到2个明显的色谱峰见图2(A)。
实施例2本发明提取分离方法
A、溶剂系统的配制：室温下按石油醚-乙醇-水(5:5:2.5)比例配制溶液适量,置分液漏斗中震荡,静置分层，上相作为固定相，下相作为流动相。
B、样品制备：取200mg川木香粗提物浸膏加流动相20ml,使样品充分溶解。
C、高速逆流色谱分离HSCCC：将色谱柱由首端向尾端充满固定相(上相),主机正转,转速为900r/min,然后以2ml/min的流速泵入流动相(下相),待流动相流出两相溶剂在柱中达到平衡状态时,固定相保留率为78％。通过进样阀注入样品,用紫外检测器在波长254nm进行监测,同时用记录仪记录色谱图,收集峰Ⅰ和峰Ⅱ的流出液。
D、流分Ⅰ，Ⅱ减压回收溶剂后真空干燥分别得木香烃内酯和去氢木香内酯。
实施例3本发明提取分离方法
A、溶剂系统的配制：室温下按石油醚-乙醇-水(5:5:5)比例配制溶液适量,置分液漏斗中震荡,静置分层，上相作为固定相，下相作为流动相。
B、样品制备：取100g木香药材(过三号筛)，加500ml石油醚，浸泡过夜，超声提取30分钟。同法提取两次。合并提取液、过滤，滤液旋转蒸干，得3.8g川木香粗提物。取100mg川木香粗提物浸膏加流动相20ml,使样品充分溶解。
C、高速逆流色谱分离HSCCC：将色谱柱由首端向尾端充满固定相(上相),主机正转,转速为900r/min,然后以2ml/min的流速泵入流动相(下相),待流动相流出两相溶剂在柱中达到平衡状态时,固定相保留率为78％。通过进样阀注入样品,用紫外检测器在波长254nm进行监测,同时用记录仪记录色谱图,收集峰Ⅰ和峰Ⅱ的流出液。
D、流分Ⅰ，Ⅱ减压回收溶剂后真空干燥分别得木香烃内酯和去氢木香内酯。
对比研究
在本发明相同的试验条件下，采用“AifengLi,et.J.Chromatogr.A1076,2005”中的分离方法对本发明粗提物进行分离：溶剂系统为石油醚-甲醇-水(5：6.5：3.5)，其固定相保留率仅为50％，分离时间需260分钟。
本发明仅仅用乙醇替代甲醇，即溶剂系统为石油醚-乙醇-水(5：6.5：3.5)，固定相保留率为78％，分离时间170分钟。
上述比较说明，本发明提供的分离方法，能够更加迅速且有效地将两种目标成分分离，且固定相保留率更高，溶剂毒性明显更低，显著优于AifengLi等公开的分离技术。

Claims (14)

1.一种提取分离木香烃内酯和去氢木香烃内酯的方法，其特征在于：它包括如下操作步骤：
(1)提取：取木香或川木香药材，粉碎后，加石油醚、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、丙酮、乙醚中的一种或两种以上的溶剂浸泡、提取，合并提取液，除去溶剂后，得粗提物；
(2)采用高速逆流色谱法分离：
取石油醚-乙醇-水＝5：5-7：2.5-5，置于分液漏斗中震荡，静置分层，取上相为固定相，下相为流动相；将固定相充满逆流色谱的色谱柱，主机正转,转速为400-1000r/min,然后以1-10ml/min的流速泵入流动相,至两相溶剂在柱中达到平衡状态；步骤(1)制备的粗提物，以流动相为溶剂溶解，制备样品溶液；将样品溶液进样,在紫外检测器监测下分别接收目标成分，将各流分减压回收溶剂后，干燥或浓缩后重结晶，即可分别得到木香烃内酯和去氢木香烃内酯。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述提取方法为超声、浸渍、回流、微波、超临界流体或渗漉提取中的任一种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，药材与溶剂的质量体积比为1：1-20g/ml。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，药材与溶剂的质量体积比为1:5g/ml。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：超声提取时间为10-60min。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：超声提取时间为30min。
7.权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，石油醚-乙醇-水＝5：7：3。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，转速为900r/min，流速为2ml/min。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，紫外检测器的检测波长为210-280nm。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，紫外检测器的检测波长为254nm。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，每次进样量以粗提物计为10mg-2g。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，每次进样量以粗提物计为100～200mg。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，粗提物与溶解用流动相的质量体积比为0.01:20g/ml-2:20g/ml。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，粗提物与溶解用流动相的质量体积比为0.1:20g/ml。
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