CN104876900A

CN104876900A - 一种从木香中提取、分离纯化木香烃内酯和去氢木香内酯的方法

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Publication number: CN104876900A
Application number: CN201510253201.7A
Authority: CN
Inventors: 杨冬芝; 杨方秀; 陆益红; 汤道权; 樊夏雷
Original assignee: Xuzhou Medical College
Current assignee: Xuzhou Medical College
Priority date: 2015-05-18
Filing date: 2015-05-18
Publication date: 2015-09-02

Abstract

本发明公开了一种从木香中提取、分离纯化木香烃内酯和去氢木香内酯的方法，涉及提取、分离纯化木香烃内酯和去氢木香内酯技术领域。本发明是以木香药材为原料，经过下述步骤：(1)木香中倍半萜内酯的提取；(2)木香中倍半萜内酯的分离分析；(3)木香中倍半萜内酯的分离纯化；(4)化合物的纯度检测及结构鉴定。用半制备型高效液相色谱进行分离纯化，流动相为甲醇-水，得到2种高纯度的成分，经鉴定分别是木香烃内酯和去氢木香内酯。本工艺过程绿色环保，对环境无严重危害，综合成本低。

Description

一种从木香中提取、分离纯化木香烃内酯和去氢木香内酯的方法

技术领域

本发明涉及提取、分离纯化木香烃内酯和去氢木香内酯技术领域，具体是一种从木香中提取、分离纯化木香烃内酯和去氢木香内酯的方法。

背景技术

中药木香为菊科植物木香Aucklandia lappa Decne.的干燥根，性辛、温，味苦，归脾、胃、大肠、三焦、胆经，有行气止痛、温中和胃、健脾消食之功效，用于胸腹胀痛、呕吐、腹泻、痢疾、里急后重、食积不消等症的治疗。药理研究表明木香在抗心血管疾病、抗炎、抗癌、抗溃疡、抗病原微生物等方面表现出良好的药理活性。化学成分研究表明倍半萜内酯为木香的主要有效成分，其中木香烃内酯和去氢木香内酯的含量最高，是木香及其相关制剂质量控制的主要指标。据文献报道，分离纯化木香中倍半萜内酯类成分的方法主要有反复硅胶柱层析法及高速逆流色谱法，硅胶柱层析法的操作过程繁琐，回收率较低，经常使用氯仿、苯等毒性较强的有机溶剂；在高速逆流色谱法中溶剂系统的选择比较困难，缺乏理论指导。因此，建立一种高效快速的提取、分离纯化木香烃内酯和去氢木香内酯的方法对于深化木香的药理研究及完善质量控制体系均具有重要的意义。

发明内容

本发明提供一种从木香中提取、分离纯化木香烃内酯和去氢木香内酯的方法，高效、快速、简便。

本发明是以如下技术方案实现的：一种从木香中提取、分离纯化木香烃内酯和去氢木香内酯的方法,其特征在于：具体步骤如下：

(1)木香中倍半萜内酯的提取：将木香药材粉碎，用有机溶剂进行提取，过滤，提取液经减压浓缩得粗提物，有机溶剂的用量是木蝴蝶药材用量的6～15倍；

(2)木香中倍半萜内酯的分离分析：用分析型高效液相色谱仪对步骤(1)中粗提物的组成进行分离分析，流动相为甲醇-水，甲醇与水的体积比为65:35，流速为1.0mL/min；

(3)木香中倍半萜内酯的分离纯化：用半制备型高效液相色谱仪对步骤1中粗提物中的成分进行分离纯化，流动相为甲醇-水，甲醇与水的体积比为70:30，流速为20～30mL/min；根据色谱图手动收集目标组分馏分，减压浓缩除去溶剂；(4)化合物的纯度检测及结构鉴定：将每一个目标组分馏分减压浓缩后用甲醇溶解，其纯度用高效液相色谱法进行检测，色谱条件见步骤(2)，分析结果表明2种化合物的纯度都达到了98％以上，经核磁共振波谱分析2种化合物分别是木香烃内酯和去氢木香内酯。

其进一步是：步骤(2)分析型高效液相色谱仪中的色谱柱采用分析型C₁₈柱，检测波长为220nm，柱温为室温。

步骤(3)中半制备型高效液相色谱仪中的色谱柱采用半制备型C₁₈柱。

步骤(1)中有机溶剂为甲醇或乙醇或石油醚或乙酸乙酯；提取方法为冷浸或超声或加热回流。乙醇的浓度为50％～100％。

步骤(1)提取次数为2-5次，步骤(1)提取时间为0.5-2小时。

步骤(1)提取次数为3次，步骤(1)提取时间为1小时。

步骤(2)分离纯化用甲醇-水洗脱液进行洗脱，洗脱方式有62％甲醇-水等度洗脱/65％甲醇-水等度洗脱/68％甲醇-水等度洗脱。

步骤(3)分离纯化用甲醇-水洗脱液进行洗脱，洗脱方式有甲醇-水梯度洗脱或65％甲醇-水等度洗脱或70％甲醇-水等度洗脱或75％甲醇-水等度洗脱。

本发明有益效果是：高效、快速从木香中提取、分离纯化木香烃内酯和去氢木香内酯2种化合物的纯度都达到了98％以上；工艺过程绿色环保，对环境无严重危害，综合成本低。

附图说明

图1是木香粗提物的分析型高效液相色谱图；

图2是木香粗提物的半制备型高效液相色谱图；

图3是木香烃内酯的高效液相色谱图及紫外光谱图；

图4是去氢木香内酯的高效液相色谱图及紫外光谱图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图详细说明本发明的技术方案，但保护范围不被此限制。实施例中所用设备或原料皆可从市场获得。所用试剂均购自天津市化学试剂三厂，所用水为去离子水。

从木香中提取、分离纯化木香烃内酯和去氢木香内酯的方法，其步骤为：

(1)木香中倍半萜内酯的提取：将木香药材粉碎，用8倍量95％乙醇加热回流提取3次，每次1h，过滤，将提取液合并，减压浓缩得粗提物。

(2)木香中倍半萜内酯的分离分析：用分析型高效液相色谱仪对粗提物的组成进行分离分析，色谱柱为C₁₈柱(250×4.6mm I.D.,5μm)，流动相为甲醇-水(65:35，V/V)；流速为1.0mL/min，检测波长为220nm，柱温为室温。

(3)木香中倍半萜内酯的分离纯化：用半制备型高效液相色谱仪对粗提物中的成分进行分离纯化，色谱柱为C₁₈柱(250×25.4mm I.D.,10μm)，流动相为甲醇-水(70:30，V/V)，流速为25.0mL/min，检测波长为220nm，柱温为室温。根据色谱图手动收集目标组分馏分，减压浓缩除去溶剂。

(4)化合物的纯度检测及结构鉴定：将每一个目标组分馏分减压浓缩后用甲醇溶解，其纯度用高效液相色谱法进行检测，色谱条件见步骤(2)，分析结果表明2种化合物的纯度都达到了98％以上。经核磁共振波谱分析2种化合物分别是木香烃内酯和去氢木香内酯。

发明人通过使用不同浓度的甲醇作流动相，采用不同的洗脱方式，控制甲醇-水洗脱液的流速为20-30mL/min(优选25mL/min)，优选出了实现本发明目的的纯化条件，有关实验结果如下：

表一木香粗提物的半制备型高效液相色谱分离条件

	洗脱条件
		实施例1	75％甲醇-水等度洗脱
实施例2	70％甲醇-水等度洗脱
		实施例3	65％甲醇-水等度洗脱
实施例4	甲醇-水梯度洗脱

在实施例1中，洗脱液中甲醇的浓度较高，洗脱时间较短，木香烃内酯和去氢木香内酯不能达到基线分离，所得化合物的纯度较低。实施例2中，洗脱液中甲醇的浓度适中，两成分之间分离效果良好，分离时间也较为适宜。实施例3中，洗脱液中甲醇的浓度较低，两成分之间分离效果良好，但分离时间太长。实施例4采用甲醇-水梯度洗脱，也可以在合适的时间内获得良好的分离效果，但由于洗脱液的浓度不断发生变化导致难以实现回收再利用。

图1是木香粗提物的分析型高效液相色谱图。图2是当选用实施例2体系时木香粗提物的半制备型高效液相色谱图，由图可见，各成分分离良好，分离时间也较为适宜。根据色谱图手动收集各峰组分，回收溶剂后，即可得到相应的高纯度化合物。经高效液相色谱峰面积归一化法分析测试，纯度高于98％，这一点可从图3至图4中看出。在图1-4中，I：木香烃内酯；II：去氢木香内酯。

经核磁共振波谱分析证实所提取纯化得到的2个化合物的化学结构式如下：

2个化合物的鉴定结果如下：

木香烃内酯：¹H-NMR(400MHz,CDCl₃):δ ppm:6.3(1H,d,J＝3.6Hz,13a-H),5.5(1H,d,J＝3.6Hz,13b-H),4.9(1H,dd,J＝10.5,4.2Hz,1-H),4.7(1H,d,J＝9.6Hz,5-H),4.6(1H,t,J＝9.3Hz,6-H),1.7(3H,s,15-H),1.4(3H,s,14-H).¹³C-NMR(100MHz,CDCl₃):δ ppm:170.5(C-12),141.5(C-11),140.0(C-4),137.0(C-10),127.2(C-5),127.0(C-1),119.7(C-13),81.9(C-6),50.3(C-7),40.9(C-3),39.4(C-9),28.0(C-2),26.2(C-8),17.4(C-15),16.1(C-14).

去氢木香内酯：¹H-NMR(400MHz,CDCl₃):δ ppm:6.2(1H,d,J＝3.2Hz,13a-H),5.5(1H,d,J＝3.2Hz,13b-H),5.3(1H,brs,15a-H),5.1(1H,brs,15b-H),4.9(1H,brs,14a-H),4.8(1H,brs,14b-H),4.0(1H,t,J＝9.2Hz,5-H).¹³C-NMR(100MHz,CDCl₃):δ ppm:170.2(C-12),151.2(C-11),149.2(C-3),139.7(C-9),120.2(C-13),112.6(C-15),109.5(C-14),85.2(C-5),52.0(C-4),47.5(C-6),45.0(C-10),36.2(C-2),32.5(C-8),30.9(C-7),30.2(C-1).

本发明从木香中提取、分离纯化木香烃内酯和去氢木香内酯，首先用95％乙醇加热回流将倍半萜内酯类成分提取出来；接下来用分析型高效液相色谱仪对提取物的组成进行分离分析；然后，用半制备型高效液相色谱仪对提取物中的成分进行分离纯化就可以得到2种化合物；最后，用高效液相色谱法对化合物的纯度进行测定，根据核磁共振波谱分析对化合物的结构进行鉴定。该方法所得目标化合物纯度高，杂质含量极低，这一点可从图3至图4中看出。除此之外，还具有如下优势：

(1)木香中的倍半萜内酯类成分为挥发油类成分，其提取方法主要有水蒸气蒸馏及超临界CO₂萃取，超临界CO₂萃取需要复杂的仪器设备，水蒸气蒸馏的提取效率较低，原因在于木香烃内酯在水中不能稳定存在。此外，木香还含有糖、氨基酸、脂肪酸及脂肪等成分。本发明用95％乙醇加热回流对木香中的倍半萜内酯类成分进行提取是利用了“相似相溶”的原理，倍半萜内酯的极性较弱，在95％乙醇中的溶解度最大，温度升高，溶解度增大，可以使倍半萜内酯最大程度溶出，而强极性的糖、氨基酸及弱极性的脂肪酸、脂肪尽量不被溶出。不仅提高了提取效率，而且可以使粗提物尽可能纯净，最大限度降低了制备型C₁₈柱被污染的程度。

(2)用高效液相色谱法对木香粗提物的组成进行分离分析，用甲醇-水作流动相等度洗脱可以在短时间内对2种目标化合物实现基线分离。

(3)用半制备型高效液相色谱法对化合物进行分离纯化，可以得到2种高纯度单体化合物，方法操作简单，效率高，工艺周期短，节省试剂，降低了生产成本。

(4)用高效液相色谱法对制备所得化合物的纯度进行测定，该方法准确、快速。

(5)提取、分离、纯化过程中仅用到乙醇、甲醇和水，不使用对环境和人体危害大的氯仿、苯等有机溶剂，甲醇-水洗脱液经减压蒸馏回收后可以重复使用多次，绿色环保。

(6)优化了层析方法的条件(洗脱液的组成和流速)，使化合物的纯度和纯化效率都大为提高。

具体实施方式只是本发明比较有代表性的例子，显然本发明的技术方案不限于上述实施例。还可以有很多变形。本领域的普通技术人员，从此文件中所公开提到或是联想到的，均应认为是本专利所要保护的范围。

Claims

1.一种从木香中提取、分离纯化木香烃内酯和去氢木香内酯的方法,其特征在于：具体步骤如下：

(2)木香中倍半萜内酯的分离分析：用分析型高效液相色谱仪对步骤(1)中粗提物的组成进行分离分析，流动相为甲醇-水，甲醇与水的体积比为65:35，流速为1.0mL/min；(3)木香中倍半萜内酯的分离纯化：用半制备型高效液相色谱仪对步骤1中粗提物中的成分进行分离纯化，流动相为甲醇-水，甲醇与水的体积比为70:30，流速为20～30mL/min；根据色谱图手动收集目标组分馏分，减压浓缩除去溶剂；

(4)化合物的纯度检测及结构鉴定：将每一个目标组分馏分减压浓缩后用甲醇溶解，其纯度用高效液相色谱法进行检测，色谱条件见步骤(2)，分析结果表明2种化合物的纯度都达到了98％以上，经核磁共振波谱分析2种化合物分别是木香烃内酯和去氢木香内酯。

2.根据权利要求1所述的一种从木香中提取、分离纯化木香烃内酯和去氢木香内酯的方法，其特征在于：步骤(2)分析型高效液相色谱仪中的色谱柱采用分析型C₁₈柱，检测波长为220nm，柱温为室温。

3.根据权利要求1所述的一种从木香中提取、分离纯化木香烃内酯和去氢木香内酯的方法，其特征在于：步骤(3)中半制备型高效液相色谱仪中的色谱柱采用半制备型C₁₈柱，检测波长为220nm，柱温为室温。

4.根据权利要求1所述的一种从木香中提取、分离纯化木香烃内酯和去氢木香内酯的方法，其特征在于：步骤(1)中有机溶剂为甲醇或乙醇或石油醚或乙酸乙酯；提取方法为冷浸或超声或加热回流。

5.根据权利要求4所述的一种从木香中提取、分离纯化木香烃内酯和去氢木香内酯的方法，其特征在于：乙醇的浓度为50％～100％。

6.根据权利要求1所述的一种从木香中提取、分离纯化木香烃内酯和去氢木香内酯的方法，其特征在于：步骤(1)提取次数为2-5次，步骤(1)提取时间为0.5-2小时。

7.根据权利要求1所述的一种从木香中提取、分离纯化木香烃内酯和去氢木香内酯的方法，其特征在于：步骤(1)提取次数为3次，步骤(1)提取时间为1小时。

8.根据权利要求1所述的一种从木香中提取、分离纯化木香烃内酯和去氢木香内酯的方法，其特征在于：步骤(2)分离纯化用甲醇-水洗脱液进行洗脱，洗脱方式有62％甲醇-水等度洗脱/65％甲醇-水等度洗脱/68％甲醇-水等度洗脱。

9.根据权利要求1所述的一种从木香中提取、分离纯化木香烃内酯和去氢木香内酯的方法，其特征在于：步骤(3)分离纯化用甲醇-水洗脱液进行洗脱，洗脱方式有甲醇-水梯度洗脱或65％甲醇-水等度洗脱或70％甲醇-水等度洗脱或75％甲醇-水等度洗脱。