CN105131007A

CN105131007A - 一种从蛇床子中提取、分离纯化欧前胡素和蛇床子素的方法

Info

Publication number: CN105131007A
Application number: CN201510566780.0A
Authority: CN
Inventors: 李爱峰; 亢静静; 柳仁民; 孙爱玲
Original assignee: Liaocheng University
Current assignee: Liaocheng University
Priority date: 2015-09-08
Filing date: 2015-09-08
Publication date: 2015-12-09

Abstract

本发明涉及一种从蛇床子中提取、分离纯化欧前胡素和蛇床子素的方法，是以蛇床子药材为原料，经过下述步骤：（1）提取；（2）高效液相色谱分离分析；（3）半制备型高效液相色谱分离纯化；（4）化合物的纯度检测及结构鉴定。用半制备型高效液相色谱进行分离纯化，流动相为甲醇-水，得到2种高纯度的成分，经鉴定分别是欧前胡素和蛇床子素。本工艺过程绿色环保，对环境无严重危害，综合成本低。

Description

一种从蛇床子中提取、分离纯化欧前胡素和蛇床子素的方法

技术领域

本发明属于化工领域，具体是涉及一种从蛇床子中提取、分离纯化欧前胡素和蛇床子素的方法。

背景技术

蛇床子为伞形科蛇床属植物蛇床Cnidiummonnieri(L.)Cuss.的干燥成熟果实，具有温肾壮阳、散寒祛风、燥湿杀虫等功效。蛇床子中的化学成分以香豆素、挥发油为主，已报道的香豆素有蛇床子素、欧前胡素等，其中蛇床子素是主要活性成分，含量占总香豆素的60%左右，是蛇床子及相关制剂质量控制的主要指标。药理研究表明蛇床子有抗炎、抗诱变、抗菌、抗肿瘤、抗心律失常、抗骨质疏松、抗艾滋病、降压等作用。据文献报道，分离纯化蛇床子香豆素的方法主要有反复硅胶柱层析法及高速逆流色谱法，硅胶柱层析法的操作过程繁琐，回收率较低，经常使用氯仿、苯等毒性较强的有机溶剂；在高速逆流色谱法中溶剂系统的选择比较困难，缺乏理论指导。因此，建立一种高效快速的提取、分离纯化蛇床子香豆素的方法对于深化蛇床子的药理作用研究及完善质量控制体系均具有重要的意义。本发明提供了一种高效、快速、简便的从蛇床子中提取、分离纯化欧前胡素和蛇床子素的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效、快速、简便的从蛇床子中提取、分离纯化欧前胡素和蛇床子素的方法。

本发明的方案如下：

从蛇床子中提取、分离纯化欧前胡素和蛇床子素的方法，其步骤为：

（1）蛇床子香豆素的提取：将蛇床子药材粉碎，用有机溶剂进行提取，过滤，提取液经减压浓缩得粗提物。

（2）蛇床子香豆素的分离分析：用分析型高效液相色谱仪对粗提物的组成进行分离分析，色谱柱为C₁₈柱（250mm×4.6mmI.D.,5μm），流动相为甲醇-水（67：33，V/V）；流速为1.0mL/min，检测波长为254nm，柱温为室温。

（3）蛇床子香豆素的分离纯化：用半制备型高效液相色谱仪对粗提物中的成分进行分离纯化，色谱柱为C₁₈柱（250mm×25.4mmI.D.,10μm），流动相为甲醇-水（70：30，V/V），检测波长为254nm，柱温为室温。根据色谱图手动收集目标组分馏分，减压浓缩除去溶剂。

（4）化合物的纯度检测及结构鉴定：将每一个目标组分馏分减压浓缩后用甲醇溶解，其纯度用高效液相色谱法进行检测，色谱条件见步骤（2），分析结果表明2种化合物的纯度都达到了98%以上。经核磁共振波谱分析2种化合物分别是欧前胡素和蛇床子素。

前面所述的方法，优选的方案是，步骤（1）提取方法为冷浸、超声和加热回流（优选加热回流）。

前面所述的方法，优选的方案是，步骤（1）提取溶剂为甲醇、乙醇、石油醚和乙酸乙酯（优选乙醇）。

前面所述的方法，优选的方案是，步骤（1）提取用乙醇-水溶液的浓度为30-95%（优选85%）。

前面所述的方法，优选的方案是，步骤（1）提取时溶剂的用量为6-12倍量（优选8倍量）。

前面所述的方法，优选的方案是，步骤（1）提取次数为2-5次（优选4次）。

前面所述的方法，优选的方案是，步骤（1）提取时间为1-3小时（优选2小时）。

前面所述的方法，优选的方案是，步骤（2）高效液相色谱分离分析所用甲醇的浓度为65%-70%（优选67%）。

前面所述的方法，优选的方案是，步骤（3）半制备型高效液相色谱分离纯化所用甲醇的浓度分别为65%-75%（优选70%）。

前面所述的方法，优选的方案是，步骤（3）分离纯化用甲醇-水溶液进行洗脱，洗脱液的流速为20-30mL/min（优选25mL/min）。

本发明涉及一种从蛇床子中提取、分离纯化欧前胡素和蛇床子素的方法，步骤为：（1）蛇床子香豆素的提取：将蛇床子药材粉碎，用有机溶剂进行提取，过滤，提取液经减压浓缩得粗提物。（2）蛇床子香豆素的分离分析：用分析型高效液相色谱仪对粗提物的组成进行分离分析，色谱柱为C₁₈柱（250mm×4.6mmI.D.,5μm），流动相为甲醇-水（67：33，V/V）；流速为1.0mL/min，检测波长为254nm，柱温为室温。（3）蛇床子香豆素的分离纯化：用半制备型高效液相色谱仪对粗提物中的成分进行分离纯化，色谱柱为C₁₈柱（250mm×25.4mmI.D.,10μm），流动相为甲醇-水（70：30，V/V），检测波长为254nm，柱温为室温。根据色谱图手动收集目标组分馏分，减压浓缩除去溶剂。（4）化合物的纯度检测及结构鉴定：将每一个目标组分馏分减压浓缩后用甲醇溶解，其纯度用高效液相色谱法进行检测，色谱条件见步骤（2），分析结果表明2种化合物的纯度都达到了98%以上。经核磁共振波谱分析2种化合物分别是欧前胡素和蛇床子素。该工艺过程绿色环保，对环境无严重危害，综合成本低。

本发明从蛇床子中提取、分离纯化欧前胡素和蛇床子素，首先85%乙醇加热回流提取使香豆素类成分溶出，可以使强极性成分不被溶出；接下来用分析型高效液相色谱仪对提取物的组成进行分离分析；然后，用半制备型高效液相色谱仪对提取物中的成分进行分离纯化就可以得到2种化合物；最后，用高效液相色谱法对化合物的纯度进行测定，根据核磁共振波谱分析对化合物的结构进行鉴定。该方法所得目标化合物纯度高，杂质含量极低，这一点可从图3至图4中看出。除此之外，还具有如下优势：

（1）用85%乙醇加热回流提取蛇床子中的香豆素类成分是利用了“相似相溶”的原理，蛇床子香豆素的极性较弱，因此在85%乙醇中的溶解度最大，温度升高，溶解度增大。同时水溶性杂质（如糖类成分等）溶出较少，不仅提高了提取效率，而且可以使粗提物尽可能纯净，最大程度降低了制备型C₁₈柱被污染的程度。

（2）用高效液相色谱法对蛇床子粗提物的组成进行分离分析，用甲醇-水作流动相等度洗脱可以在短时间内对2种目标化合物实现基线分离。

（3）用半制备型高效液相色谱法对化合物进行分离纯化，可以得到2种高纯度单体化合物，方法操作简单，效率高，工艺周期短，节省试剂，降低了生产成本。

（4）用高效液相色谱法对制备所得化合物的纯度进行测定，该方法准确、快速。

（5）提取、分离、纯化过程中仅用到乙醇、甲醇和水，不使用对环境和人体危害大的氯仿、苯等有机溶剂，乙醇提取液、甲醇-水洗脱液经减压蒸馏回收后可以重复使用多次，绿色环保。

（6）优化了层析方法的条件（洗脱液的组成和流速），使化合物的纯度和纯化效率都大为提高。

附图说明

图1是蛇床子粗提物的分析型高效液相色谱图。

图2是蛇床子粗提物的半制备型高效液相色谱图。

图3是欧前胡素的高效液相色谱图及紫外光谱图。

图4是蛇床子素的高效液相色谱图及紫外光谱图。

在图1-4中，I：欧前胡素；II：蛇床子素。

具体实施方式

下面结合实施例和附图详细说明本发明的技术方案，但保护范围不被此限制。实施例中所用设备或原料皆可从市场获得。所用试剂均购自济南试剂总厂，所用水为去离子水。

实施例：从蛇床子中提取、分离纯化欧前胡素和蛇床子素的方法，其步骤为：

（1）蛇床子香豆素的提取：将蛇床子药材粉碎，用8倍量85%乙醇加热回流提取4次，每次2小时，过滤，将乙醇提取液合并，减压浓缩得粗提物。

发明人通过使用不同浓度的甲醇作流动相，采用不同的洗脱方式，控制甲醇-水洗脱液的流速为20-30mL/min（优选25mL/min），优选出了实现本发明目的的纯化条件，有关实验结果如下：

表一蛇床子粗提物的半制备型高效液相色谱分离条件

在实施例1中，洗脱液中甲醇的浓度较高，洗脱时间较短，欧前胡素与蛇床子素不能达到基线分离，所得化合物的纯度较低。实施例2中，洗脱液中甲醇的浓度适中，两组分之间分离效果良好，分离时间也较为适宜。实施例3中，洗脱液中甲醇的浓度较低，两组分之间分离效果良好，但分离时间太长。实施例4采用甲醇-水梯度洗脱，也可以在合适的时间内获得良好的分离效果，但由于洗脱液的浓度不断发生变化导致难以实现回收再利用。

图2是当选用实施例2体系时蛇床子粗提物的半制备型高效液相色谱图，由图可见，各成分分离良好，分离时间也较为适宜。根据色谱图手动收集各峰组分，回收溶剂后，即可得到相应的高纯度化合物。经高效液相色谱面积归一化法分析测试，纯度高于98%，这一点可从图3至图4中看出。

经核磁共振波谱分析证实所提取纯化得到的2个化合物的化学结构式如下：

2个化合物的鉴定结果如下：

欧前胡素：¹H-NMR(400MHz,CDCl₃):dppm:7.77(1H,d,J=9.6Hz,4-H),7.69(1H,d,J=2.0Hz,12-H),7.36(1H,s,5-H),6.82(1H,d,J=2.0Hz,11-H),6.37(1H,d,J=10Hz,3-H),5.61(1H,m,2'-H),5.00(2H,d,J=7.2Hz,1'-H),1.74(3H,s,4'-CH₃),1.72(3H,s,5'-CH₃).¹³C-NMR(100MHz,CDCl₃):dppm:160.5(C-2),148.7(C-7),146.7(C-12),144.3(C-4),143.8(C-9),139.7(C-3'),131.1(C-8),125.8(C-6),119.8(C-2'),116.5(C-10),114.7(C-3),113.1(C-5),106.7(C-11),70.1(C-1'),25.8(C-4'),18.1(C-5').

蛇床子素：¹H-NMR(400MHz,CDCl₃):dppm:7.87(1H,d,J=9.6Hz,4-H),7.47(1H,d,J=8.4Hz,5-H),7.03(1H,d,J=8.4Hz,6-H),6.25(1H,d,J=9.6Hz,3-H),5.22(1H,m,12-H),3.98(3H,s,-OCH₃),3.51(2H,d,J=7.2Hz,11-H),1.86(3H,s,14-H),1.68(3H,s,15-H).¹³C-NMR(100MHz,CDCl₃):dppm:161.9(C-7),161.8(C-2),153.8(C-9),146.2(C-4),133.3(C-5),128.1(C-12),122.4(C-6),118.6(C-13),114.4(C-10),113.1(C-3),109.1(C-8),56.6(C-16),25.9(C-15),22.7(C-11),18.1(C-14).

应当指出的是，具体实施方式只是本发明比较有代表性的例子，显然本发明的技术方案不限于上述实施例。还可以有很多变形。本领域的普通技术人员，从此文件中所公开提到或是联想到的，均应认为是本专利所要保护的范围。

Claims

1.一种从蛇床子中提取、分离纯化欧前胡素和蛇床子素的方法,其特征是，步骤为：

（1）蛇床子香豆素的提取：将蛇床子药材粉碎，用有机溶剂进行提取，过滤，提取液经减压浓缩得粗提物；

（2）蛇床子香豆素的分离分析：用分析型高效液相色谱仪对粗提物的组成进行分离分析，色谱柱为C₁₈柱（250mm×4.6mmI.D.,5μm），流动相为甲醇-水（67：33，V/V）；流速为1.0mL/min，检测波长为254nm，柱温为室温；

（3）蛇床子香豆素的分离纯化：用半制备型高效液相色谱仪对粗提物中的成分进行分离纯化，色谱柱为C₁₈柱（250mm×25.4mmI.D.,10μm），流动相为甲醇-水（70：30，V/V），检测波长为254nm，柱温为室温；根据色谱图手动收集目标组分馏分，减压浓缩除去溶剂；

（4）化合物的纯度检测及结构鉴定：将每一个目标组分馏分减压浓缩后用甲醇溶解，其纯度用高效液相色谱法进行检测，色谱条件见步骤（2），分析结果表明2种化合物的纯度都达到了98%以上；经核磁共振波谱分析2种化合物分别是欧前胡素和蛇床子素。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤（1）提取方法为冷浸、超声和加热回流（优选加热回流）。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤（1）提取溶剂为甲醇、乙醇、石油醚和乙酸乙酯（优选乙醇）。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤（1）提取用乙醇-水溶液的浓度为30-95%（优选85%）。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤（1）提取过程中溶剂的用量为6倍量-12倍量（优选8倍量）。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤（1）提取次数为2-5次（优选4次）。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤（1）提取时间为1-3小时（优选2小时）。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤（2）分离分析用甲醇-水洗脱液进行洗脱，洗脱方式有65%甲醇-水等度洗脱/67%甲醇-水等度洗脱/70%甲醇-水等度洗脱。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤（3）分离纯化用甲醇-水洗脱液进行洗脱，洗脱方式有甲醇-水梯度洗脱/65%甲醇-水等度洗脱/70%甲醇-水等度洗脱/75%甲醇-水等度洗脱。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤（3）中控制甲醇-水洗脱液流速为20-30mL/min（优选25mL/min）。