CN105061448A - 一种从白芷中提取、分离纯化3种香豆素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从白芷中提取、分离纯化3种香豆素的方法，是以白芷药材为原料，经过下述步骤：（1）白芷香豆素的提取；（2）白芷香豆素的分离分析；（3）白芷香豆素的分离纯化；（4）化合物的纯度检测及结构鉴定。用半制备型高效液相色谱进行分离纯化，流动相为甲醇-水，得到3种高纯度的成分，经鉴定分别是欧前胡素、氧化欧前胡素和异欧前胡素。本工艺过程绿色环保，对环境无严重危害，综合成本低。
Description
技术领域
本发明属于化工领域，具体是涉及一种从白芷中提取、分离纯化3种香豆素的方法。
背景技术
白芷始载于《神农本草经》，性温味辛，具有散风除湿、通窍止痛、消肿排脓的作用，临床上广泛用于治疗感冒头痛、眉棱骨痛、鼻塞、鼻渊、牙痛、白带和疮疡肿痛等症。此外，白芷还是各种保健品、化妆品、香料及调味品生产中必不可少的原料。白芷的化学成分复杂，主要含有香豆素和挥发油。药理研究表明，香豆素为白芷的主要活性成分，其中含量较高的有欧前胡素、异欧前胡素和氧化前胡素，这三种物质也是白芷及其相关制剂质量控制的主要指标。据文献报道，分离纯化白芷香豆素的方法主要有反复硅胶柱层析法及高速逆流色谱法，硅胶柱层析法的操作过程繁琐，回收率较低，经常使用氯仿、苯等毒性较强的有机溶剂；在高速逆流色谱法中溶剂系统的选择比较困难，缺乏理论指导。因此，建立一种高效快速的提取、分离纯化白芷香豆素的方法对于深化白芷的药理作用研究及完善质量控制体系均具有重要的意义。本发明提供了一种高效、快速、简便的从白芷中提取、分离纯化3种香豆素的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效、快速、简便的从白芷中提取、分离纯化3种香豆素的方法。
本发明的方案如下：
从白芷中提取、分离纯化3种香豆素的方法，其步骤为：
（1）白芷香豆素的提取：将白芷药材粉碎，用有机溶剂进行提取，过滤，提取液经减压浓缩得粗提物。
（2）白芷香豆素的分离分析：用分析型高效液相色谱仪对粗提物的组成进行分离分析，色谱柱为C18柱（250mm×4.6mmI.D.,5μm），流动相为甲醇-水（67：33，V/V），流速为1.0mL/min，检测波长为220nm，柱温为室温。
（3）白芷香豆素的分离纯化：用半制备型高效液相色谱仪对粗提物中的成分进行分离纯化，色谱柱为C18柱（250mm×25.4mmI.D.,10μm），流动相为甲醇-水（65：35，V/V），检测波长为220nm，柱温为室温。根据色谱图手动收集目标组分馏分，减压浓缩除去溶剂。
（4）化合物的纯度检测及结构鉴定：将每一个目标组分馏分经减压浓缩后用甲醇溶解，其纯度用高效液相色谱法进行检测，色谱条件见步骤（2），分析结果表明3种化合物的纯度都达到了98%以上。经核磁共振波谱分析3种化合物分别是欧前胡素、氧化前胡素和异欧前胡素。
前面所述的方法，优选的方案是，步骤（1）提取方法为冷浸、超声和加热回流（优选加热回流）。
前面所述的方法，优选的方案是，步骤（1）提取溶剂为甲醇、无水乙醇、石油醚和乙酸乙酯（优选石油醚）。
前面所述的方法，优选的方案是，步骤（1）提取时溶剂的用量为6-12倍量（优选10倍量）。
前面所述的方法，优选的方案是，步骤（1）提取次数为2-5次（优选3次）。
前面所述的方法，优选的方案是，步骤（1）提取时间为1-3小时（优选2小时）。
前面所述的方法，优选的方案是，步骤（2）高效液相色谱分离分析所用甲醇的浓度为65%-70%（优选67%）。
前面所述的方法，优选的方案是，步骤（3）半制备型高效液相色谱分离纯化所用甲醇的浓度分别为62%-68%（优选65%）。
前面所述的方法，优选的方案是，步骤（3）分离纯化用甲醇-水溶液进行洗脱，洗脱液的流速为20-30mL/min（优选25mL/min）。
本发明涉及一种从白芷中提取、分离纯化3种香豆素的方法，步骤为：（1）白芷香豆素的提取：将白芷药材粉碎，用有机溶剂进行提取，过滤，提取液经减压浓缩得粗提物。（2）白芷香豆素的分离分析：用分析型高效液相色谱仪对粗提物的组成进行分离分析，色谱柱为C18柱（250mm×4.6mmI.D.,5μm），流动相为甲醇-水（67：33，V/V）；流速为1.0mL/min，检测波长为220nm，柱温为室温。（3）白芷香豆素的分离纯化：用半制备型高效液相色谱仪对粗提物中的成分进行分离纯化，色谱柱为C18柱（250mm×25.4mmI.D.,10μm），流动相为甲醇-水（65：35，V/V），检测波长为220nm，柱温为室温。根据色谱图手动收集目标组分馏分，减压浓缩除去溶剂。（4）化合物的纯度检测及结构鉴定：将每一个目标组分馏分减压浓缩后用甲醇溶解，其纯度用高效液相色谱法进行检测，色谱条件见步骤（2），分析结果表明3种化合物的纯度都达到了98%以上。经核磁共振波谱分析3种化合物分别是欧前胡素、氧化前胡素和异欧前胡素。该工艺过程绿色环保，对环境无严重危害，综合成本低。
本发明从白芷中提取、分离纯化3种香豆素，首先用石油醚加热回流将香豆素类成分提取出来，可以使强极性成分不被溶出；接下来用分析型高效液相色谱仪对提取物的组成进行分离分析；然后，用半制备型高效液相色谱仪对提取物中的成分进行分离纯化就可以得到3种化合物；最后，用高效液相色谱法对化合物的纯度进行测定，根据核磁共振波谱分析对化合物的结构进行鉴定。该方法所得目标化合物纯度高，杂质含量极低，这一点可从图3至图5中看出。除此之外，还具有如下优势：
（1）用石油醚加热回流对白芷中香豆素类成分进行提取是利用了“相似相溶”的原理，白芷香豆素的极性很弱，因此在石油醚中的溶解度最大，温度升高，溶解度增大。因此，用石油醚加热回流提取可以使白芷香豆素最大程度溶出，而水溶性杂质尽量不被溶出。不仅提高了提取效率，而且可以使粗提物尽可能纯净，最大限度降低了制备型C18柱被污染的程度。
（2）用高效液相色谱法对白芷粗提物的组成进行分离分析，用甲醇-水作流动相等度洗脱可以在短时间内对3种目标化合物实现基线分离。
（3）用半制备型高效液相色谱法对化合物进行分离纯化，可以得到3种高纯度单体化合物，方法操作简单，效率高，工艺周期短，节省试剂，降低了生产成本。
（4）用高效液相色谱法对制备所得化合物的纯度进行测定，该方法准确、快速。
（5）提取、分离、纯化过程中仅用到石油醚、甲醇和水，不使用对环境和人体危害大的氯仿、苯等有机溶剂，石油醚提取液、甲醇-水洗脱液经减压蒸馏回收后可以重复使用多次，绿色环保。
（6）优化了层析方法的条件（洗脱液的组成和流速），使化合物的纯度和效率都大为提高。
附图说明
图1是白芷粗提物的分析型高效液相色谱图。
图2是白芷粗提物的半制备型高效液相色谱图。
图3是欧前胡素的高效液相色谱图及紫外光谱图。
图4是氧化欧前胡素的高效液相色谱图及紫外光谱图。
图5是异欧前胡素的高效液相色谱图及紫外光谱图。
在图1-5中，I：欧前胡素；II：氧化欧前胡素；III：异欧前胡素。
具体实施方式
下面结合实施例和附图详细说明本发明的技术方案，但保护范围不被此限制。实施例中所用设备或原料皆可从市场获得。所用试剂均购自济南试剂总厂，所用水为去离子水。
实施例：从白芷中提取、分离纯化3种香豆素的方法，其步骤为：
（1）白芷香豆素的提取：将白芷药材粉碎，用10倍量石油醚加热提取3次，每次2h，过滤，将提取液合并，减压浓缩得粗提物。
（2）白芷香豆素的分离分析：用分析型高效液相色谱仪对粗提物的组成进行分离分析，色谱柱为C18柱（250mm×4.6mmI.D.,5μm），流动相为甲醇-水（67：33，V/V）；流速为1.0mL/min，检测波长为220nm，柱温为室温。
（3）白芷香豆素的分离纯化：用半制备型高效液相色谱仪对粗提物中的成分进行分离纯化，色谱柱为C18柱（250mm×25.4mmI.D.,10μm），流动相为甲醇-水（65：35，V/V），检测波长为220nm，柱温为室温。根据色谱图手动收集目标组分馏分，减压浓缩除去溶剂。
（4）化合物的纯度检测及结构鉴定：将每一个目标组分馏分减压浓缩后用甲醇溶解，其纯度用高效液相色谱法进行检测，色谱条件见步骤（2），分析结果表明3种化合物的纯度都达到了98%以上。经核磁共振波谱分析3种化合物分别是欧前胡素、氧化前胡素和异欧前胡素。
发明人通过使用不同浓度的甲醇作流动相，采用不同的洗脱方式，控制甲醇-水洗脱液的流速为20-30mL/min（优选25mL/min），优选出了实现本发明目的的纯化条件，有关实验结果如下：
表一白芷粗提物的半制备型高效液相色谱分离条件
在实施例1中，洗脱液中甲醇的浓度较高，洗脱时间较短，欧前胡素与其附近的杂质组分之间分离效果不够理想，所得欧前胡素的纯度较低。实施例2中，洗脱液中甲醇的浓度适中，各成分之间分离效果良好，分离时间也较为适宜。实施例3中，洗脱液中甲醇的浓度较低，欧前胡素与其附近的杂质组分之间分离效果良好，但分离时间太长。实施例4采用甲醇-水梯度洗脱，也可以在合适的时间内获得良好的分离效果，但由于洗脱液的浓度不断发生变化导致难以实现回收再利用。
图2是当选用实施例2体系时白芷粗提物的半制备型高效液相色谱图，由图可见，各成分分离良好，分离时间也较为适宜。根据色谱图手动收集各峰组分，回收溶剂后，即可得到相应的高纯度化合物。经高效液相色谱面积归一化法分析测试，纯度高于98%，这一点可从图3至图5中看出。
经核磁共振波谱分析证实所提取纯化得到的3个化合物的化学结构式如下：
3个化合物的鉴定结果如下：
欧前胡素：1H-NMR(400MHz,CDCl3):δppm:7.76(1H,d,J=9.6Hz,4-H),7.69(1H,d,J=2.0Hz,12-H),7.36(1H,s,5-H),6.81(1H,d,J=2.0Hz,11-H),6.37(1H,d,J=9.6Hz,3-H),5.61(1H,m,2'-H),5.01(2H,d,J=7.2Hz,1'-H),1.74,1.72(3Heach,s,2′CH3).13C-NMR(100MHz,CDCl3):δppm:160.51(C-2),148.58(C-7),146.58(C-12),144.31(C-4),143.81(C-9),139.74(C-3'),131.02(C-8),125.81(C-6),119.72(C-2'),116.45(C-10),114.67(C-3),113.10(C-5),106.66(C-11),70.12(C-1'),25.77(-CH3),18.08(-CH3).
氧化前胡素：1H-NMR(400MHz,CDCl3):δppm:8.13(1H,d,J=9.6Hz,4-H),7.63(1H,d,J=2.0Hz,12-H),7.10(1H,broad,8-H),7.00(1H,d,J=2.0Hz,11-H),6.29(1H,d,J=9.6Hz,3-H),4.85(2H,d,J=7.2Hz,1'-H),3.66(1H,t,J=7.2Hz,2'-H),1.74,1.71(3Heach,s,2′CH3).13C-NMR(100MHz,CDCl3):δppm:160.52(C-2),158.09(C-7),150.76(C-9),148.92(C-5),145.05(C-12),139.36(C-4),114.17(C-6),112.79(C-3),107.49(C-11),105.01(C-10),94.21(C-8),70.34(C-1'),60.76(C-2'),58.31(C-3'),25.56(-CH3),18.04(-CH3).
异欧前胡素：1H-NMR(400MHz,CDCl3):δppm:8.16(1H,d,J=9.6Hz,4-H),7.61(1H,d,J=2.3Hz,12-H),7.16(1H,s,8-H),6.96(1H,d,J=2.3Hz,11-H),6.28(1H,d,J=9.6Hz,3-H),5.54(1H,t,2'-H),4.92(2H,d,J=6.8Hz,1'-H),1.80,1.70(3Heach,s,2′CH3).13C-NMR(100MHz,CDCl3):δppm:161.31(C-2),158.09(C-7),152.62(C-9),148.92(C-5),144.86(C-12),139.70(C-11),139.57(C-4),119.04(C-2'),114.17(C-6),112.53(C-3),107.54(C-10),105.01(C-3'),94.21(C-8),69.70(C-1'),25.79(-CH3),18.19(-CH3).
应当指出的是，具体实施方式只是本发明比较有代表性的例子，显然本发明的技术方案不限于上述实施例。还可以有很多变形。本领域的普通技术人员，从此文件中所公开提到或是联想到的，均应认为是本专利所要保护的范围。
Claims (9)
1.一种从白芷中提取、分离纯化3种香豆素的方法,其特征是，步骤为：
（1）白芷香豆素的提取：将白芷药材粉碎，用有机溶剂进行提取，过滤，提取液经减压浓缩得粗提物；
（2）白芷香豆素的分离分析：用分析型高效液相色谱仪对粗提物的组成进行分离分析，色谱柱为C18柱（250mm×4.6mmI.D.,5μm），流动相为甲醇-水（67：33，V/V）；流速为1.0mL/min，检测波长为220nm，柱温为室温；
（3）白芷香豆素的分离纯化：用半制备型高效液相色谱仪对粗提物中的成分进行分离纯化，色谱柱为C18柱（250mm×25.4mmI.D.,10μm），流动相为甲醇-水（65：35，V/V），检测波长为220nm，柱温为室温；根据色谱图手动收集目标组分馏分，减压浓缩除去溶剂；
（4）化合物的纯度检测及结构鉴定：将每一个目标组分馏分减压浓缩后用甲醇溶解，其纯度用高效液相色谱法进行检测，色谱条件见步骤（2），分析结果表明3种化合物的纯度都达到了98%以上；经核磁共振波谱分析3种化合物分别是欧前胡素、氧化前胡素和异欧前胡素。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤（1）提取方法为冷浸、超声和加热回流（优选加热回流）。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤（1）提取溶剂为甲醇、无水乙醇、石油醚和乙酸乙酯（优选石油醚）。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤（1）提取过程中溶剂的用量为6倍量-12倍量（优选10倍量）。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤（1）提取次数为2-5次（优选3次）。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤（1）提取时间为1-3小时（优选2小时）。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤（2）分离分析用甲醇-水洗脱液进行洗脱，洗脱方式有65%甲醇-水等度洗脱/67%甲醇-水等度洗脱/70%甲醇-水等度洗脱。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤（3）分离纯化用甲醇-水洗脱液进行洗脱，洗脱方式有甲醇-水梯度洗脱/62%甲醇-水等度洗脱/65%甲醇-水等度洗脱/68%甲醇-水等度洗脱。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤（3）中控制甲醇-水洗脱液流速为20-30mL/min（优选25mL/min）。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20151118 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |