CN110526888B - 一种从粗糙凤尾蕨中提取香豆素的方法 - Google Patents

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    • C07D311/06—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 2
    • C07D311/08—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 2 not hydrogenated in the hetero ring
    • C07D311/16—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 2 not hydrogenated in the hetero ring substituted in position 7

Abstract

一种从粗糙凤尾蕨中提取香豆素的方法，属于天然产物提取领域。本发明通过粗糙凤尾蕨根部粗提取、聚酰胺树脂柱色谱分离、洗脱物的中压制备和高效液相色谱检测及制备四个步骤完成从粗糙凤尾蕨中对香豆素的提取。本发明采用配备有DAD检测器的HPLC，从色谱图中快速锁定这些微量化合物，进而定向制备出微量化合物单体。制备的香豆素纯度较高，经高效液相色谱法检测香豆素的含量可达到95％以上。

Description

一种从粗糙凤尾蕨中提取香豆素的方法
技术领域
本发明属于天然产物提取领域，具体涉及一种从粗糙凤尾蕨中提取香豆素的方法。
背景技术
粗糙凤尾蕨隶属于凤尾蕨科凤尾蕨属，凤尾蕨全株含麦角甾醇、胆碱、鞣质、甙类等。其全株均可入药，具有降血压、驱虫、防癌等作用，对头晕失眠、高血压、慢性腰酸背痛、关节炎、慢性。肾炎、肺病诸症也有较好疗效，故称“长寿菜”。祖国医学认为，凤尾蕨性寒味甘，入脾、胃、肠经，具有清热化痰、降气滑肠、健胃功效。《食疗本草》谓其能补五脏不足，兼治气壅经络、骨问毒气诸症。《本草拾遗》谓蕨菜能够去暴热、利小水，主治食膈气膈、肠风热毒等病症，又可作驱虫剂。凤尾蕨味淡、性凉、清热、利湿、解毒、凉血、收敛、止血、止痢。
香豆素，英文名称为Coumarin，分子式：C9H6O2，相对分子量146.15，白色结晶固体，熔点68～70℃，沸点298℃/266Pa，相对密度0.9350。天然发现存在于黑香豆、香蛇鞭菊、野香荚兰、兰花中，具有新鲜干草香和香豆香，一般不作食用，允许烟用和外用。香豆素对人类的健康有很大的帮助，广泛应用于医药、农业等领域，被用于抗菌、抗病毒、抗癌、抗炎、抗氧化和抗凝等方面。现有的香豆素提取方法中纯度较低，难以有效的在医药领域中应用。
发明内容
针对上述不足，本发明提供一种从粗糙凤尾蕨中提取香豆素的方法，该方法操作过程简单、得到的香豆素纯度高。所述香豆素的结构如下式1所示：
Figure BDA0002209368010000011
本发明解决技术问题的具体步骤如下：
(1)粗糙凤尾蕨根部粗提取：干燥粗糙凤尾蕨根部粉碎，用95％乙醇浸泡5-6小时后，120摄氏度回流提取，料液比(kg/L)为1:5，反复提取3-5次，每次1小时，提取液减压回收，浓缩后得到粗糙凤尾蕨根部粗提物。
(2)聚酰胺树脂柱色谱分离：将粗糙凤尾蕨粗提物分散于水中，采用14目-30目的聚酰胺树脂柱色谱洗脱，分别用水和不同浓度的乙醇(30％、60％、95％)进行梯度洗脱，减压回收得到四个部位的洗脱物。
(3)洗脱物的中压制备：将30％部位的洗脱物浸膏采用体积溶度为10％-80％甲醇梯度洗脱的条件进行中压制备液相色谱分离，得到50个组分，其中色谱柱填料为ODS。
(4)高效液相色谱检测及制备：经过中压制备的50个组分减压回收后用全波长高效液相色谱进行检测分析，筛选出组分11中含有香豆素成分；将组分11的样品通过改变波长、流动相等条件找到分离度较好的制备条件，制备条件：色谱柱为半制备ODS色谱柱，A相为水+0.1％三氟乙酸，B相为甲醇，流动相为15％-17％甲醇，紫外检测波长为210nm和254nm，流速为3mL/min。
通过核磁共振(1H-NMR、13C-NMR)等手段对单体化合物进行结构鉴定。
有益效果：
(1)本发明采用配备有DAD检测器的HPLC，从色谱图中快速锁定这些微量化合物，进而定向制备出微量化合物单体。制备的香豆素纯度较高，经高效液相色谱法检测香豆素的含量可达到95％以上。
(2)本发明的原料为粗糙凤尾蕨，广泛分布在华南和西南地区，但目前对凤尾蕨属植物的研究较少，本发明能够充分利用我国的药用植物资源。
(3)本发明分离的香豆素为首次在粗糙凤尾蕨中分离得到，本发明为充分利用香豆素的药用价值提供了高纯度的制备方法。
附图说明
图1为实施例1中香豆素高效液相色谱检测图
图2为实施例1中香豆素核磁共振氢谱图
图3为实施例1中香豆素核磁共振碳谱图
具体实施方式
下面通过具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从商业途径获得。
实施例1
(1)干燥粗糙凤尾蕨根部(25kg)粉碎，用125L 95％乙醇浸泡6小时后，120摄氏度回流提取，反复提取4次，每次1小时，提取液减压回收，浓缩后得到粗糙凤尾蕨根部粗提物。
(2)将粗糙凤尾蕨粗提物分散于水中，采用14目-30目的聚酰胺树脂柱色谱洗脱，分别用水和不同浓度的乙醇(30％、60％、95％)进行梯度洗脱，减压回收得到四个部位的洗脱物。
(3)将30％部位的洗脱物浸膏采用体积溶度为10％-80％甲醇梯度洗脱的条件进行中压制备液相色谱分离，得到50个组分，其中色谱柱填料为ODS。
(4)经过中压制备的50个组分减压回收后用全波长高效液相色谱进行检测分析，筛选出组分11中含有香豆素成分；将组分11的样品通过改变波长、流动相等条件找到分离度较好的制备条件，制备条件：色谱柱为半制备ODS色谱柱，A相为水+0.1％三氟乙酸，B相为甲醇，流动相为17％甲醇，紫外检测波长为210nm和254nm，流速为3mL/min。
制备后样品的高效液相检测图如图1所示，经检测可得香豆素纯度为96.87％。通过核磁共振(1H-NMR、13C-NMR)等手段对单体化合物进行结构鉴定。1H-NMR和13C-NMR的谱图见附图。
实施例2
(1)干燥粗糙凤尾蕨根部(25kg)粉碎，用125L 95％乙醇浸泡6小时后，120摄氏度回流提取，反复提取4次，每次1小时，提取液减压回收，浓缩后得到粗糙凤尾蕨根部粗提物。
(2)将粗糙凤尾蕨粗提物分散于水中，采用14目-30目的聚酰胺树脂柱色谱洗脱，分别用水和不同浓度的乙醇(30％、60％、95％)进行梯度洗脱，减压回收得到四个部位的洗脱物。
(3)将30％部位的洗脱物浸膏采用体积溶度为10％-80％甲醇梯度洗脱的条件进行中压制备液相色谱分离，得到50个组分，其中色谱柱填料为ODS。
(4)经过中压制备的50个组分减压回收后用全波长高效液相色谱进行检测分析，筛选出组分11中含有香豆素成分；将组分11的样品通过改变波长、流动相等条件找到分离度较好的制备条件，制备条件：色谱柱为半制备ODS色谱柱，A相为水+0.1％三氟乙酸，B相为甲醇，流动相为15％甲醇，紫外检测波长为210nm和254nm，流速为3mL/min。
实施例3
(1)干燥粗糙凤尾蕨根部(25kg)粉碎，用125L 95％乙醇浸泡6小时后，120摄氏度回流提取，反复提取4次，每次1小时，提取液减压回收，浓缩后得到粗糙凤尾蕨根部粗提物。
(2)将粗糙凤尾蕨粗提物分散于水中，采用14目-30目的聚酰胺树脂柱色谱洗脱，分别用水和不同浓度的乙醇(30％、60％、95％)进行梯度洗脱，减压回收得到四个部位的洗脱物。
(3)将30％部位的洗脱物浸膏采用体积溶度为10％-80％甲醇梯度洗脱的条件进行中压制备液相色谱分离，得到50个组分，其中色谱柱填料为ODS。
(4)经过中压制备的50个组分减压回收后用全波长高效液相色谱进行检测分析，筛选出组分11中含有香豆素成分；将组分11的样品通过改变波长、流动相等条件找到分离度较好的制备条件，制备条件：色谱柱为半制备ODS色谱柱，A相为水+0.1％三氟乙酸，B相为甲醇，流动相为16％甲醇，紫外检测波长为210nm和254nm，流速为3mL/min。
对比例1
步骤(1)(2)(3)同实施例1相同。
步骤(4)如下：经过中压制备的50个组分减压回收后用全波长高效液相色谱进行检测分析，筛选出组分11中含有香豆素成分；将组分11的样品通过改变波长、流动相等条件找到分离度较好的制备条件，制备条件：色谱柱为半制备ODS色谱柱，A相为水+0.1％三氟乙酸，B相为甲醇，流动相为20％甲醇，紫外检测波长为210nm和254nm，流速为3mL/min。由于甲醇的比例较高，虽然分离时间较短，但化合物之间没有实现基线分离，纯度较低。经高效液相检测可得香豆素纯度为85.16％。
对比例2
步骤(1)(2)(3)同实施例1相同。
步骤(4)如下：经过中压制备的50个组分减压回收后用全波长高效液相色谱进行检测分析，筛选出组分11中含有香豆素成分；将组分11的样品通过改变波长、流动相等条件找到分离度较好的制备条件，制备条件：色谱柱为半制备ODS色谱柱，A相为水+0.1％三氟乙酸，B相为甲醇，流动相为13％甲醇，紫外检测波长为210nm和254nm，流速为3mL/min。由于甲醇的比例较低，化合物之间可以实现基线分离，但化合物的保留时间太长。
上述实施例只是用于对本发明的举例和说明，而非意在将本发明限制于所描述的实施例范围内。此外本领域技术人员可以理解的是，本发明不局限于上述实施例，根据本发明的教导还可以做出更多种的变型和修改，这些变型和修改均落在本发明所要求保护的范围内。

Claims (1)

1.一种从粗糙凤尾蕨中提取式1所示化合物的方法，其特征在于，该方法的步骤如下：
S1.粗糙凤尾蕨根部粗提取：干燥粗糙凤尾蕨根部粉碎，用95%乙醇浸泡5-6小时后，120摄氏度回流提取，提取液减压回收，浓缩后得到粗糙凤尾蕨根部粗提物；其中，加热回流提取的料液比kg/L为1:5，提取3-5次，每次提取1小时；
S2.聚酰胺树脂柱色谱分离：将粗糙凤尾蕨粗提物分散于水中，采用14目-30目的聚酰胺树脂柱色谱洗脱，分别用水和乙醇进行梯度洗脱，减压回收得到四个部位的洗脱物；其中，乙醇的浓度为30%、60%和95%中的一种；
S3.洗脱物的中压制备：将30%部位的洗脱物浸膏采用体积溶度为10%-80% 甲醇梯度洗脱的条件进行中压制备液相色谱分离，得到50个组分，其中色谱柱填料为ODS；
S4.高效液相色谱检测及制备：经过中压制备的50个组分减压回收后用全波长高效液相色谱进行检测分析，筛选出组分11中含有香豆素成分；将组分11的样品通过改变波长、流动相的条件找到分离度较好的制备条件，制备条件：色谱柱为半制备ODS色谱柱，A相为水+0.1%三氟乙酸，B相流动相为15%-17%甲醇，流速为3mL/min，紫外检测波长为210nm和254nm；
所述式1所示化合物的结构如下：
式1：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
。
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