JP6654754B2 - イワベンケイ属植物からのヘルバセチン抽出方法 - Google Patents
イワベンケイ属植物からのヘルバセチン抽出方法 Download PDFInfo
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Description
本発明は、化学分野化合物の分離抽出方法に関し、具体的にはイワベンケイ属植物からヘルバセチンを製造する方法に関し、医薬品化学分野に属す。
ベンケイソウ科イワベンケイ属植物は、多年生草本または亜低木植物であり、全世界でイワベンケイ属植物は約90種以上存在し、中国には73種が存在する。多種のイワベンケイ属植物において、国内外の学者による研究は、主に、Rhodiola crenulata、Rhodiola rosea、Rhodiola dumulosa、Rhodiola sachalinensis、Rhodiola kirilowiiおよびRhodiola sacra等の十数種に集中している。イワベンケイの種類ごとに化学成分が大きく異なり、効果もそれぞれ異なる。2015年版「中国薬局方」に収載されているイワベンケイは、ベンケイソウ科植物Rhodiola crenulataの乾燥根および根茎であり、平性であり、味は甘苦く、肺および心臓の治療に用いられ、気を補充して血の流れをよくし、脈拍を強くして喘息を改善する効果を有し、気が弱まり血の流れが悪くなっている状態、胸の痛み、脳血管障害による半身不随、倦怠感、喘息に対して用いられ、その疲れをとる作用は、オタネニンジンやエゾウコギよりも優れており、認知機能を活性化する作用は、エゾウコギよりも優れており、民間では疲労回復や冷え対策のために滋養強壮薬としてよく服用されている。
現代医学では、イワベンケイの主な有効成分は、フラボノイド類、チロソールおよびその配糖体であり、フラボンは、主にヘルバセチンおよびそれに対応する配糖体成分であることが明らかになっている。ヘルバセチンは、DPPHラジカルおよびヒドロキシルラジカルを有効に消去し、タンパク質酸化の作用を抑制することができ、かつその抗酸化活性は、対応する配糖体成分よりも強い。また、研究によって、ヘルバセチン構造におけるA環7位のヒドロキシ基が配糖化した後、薬理活性が低下し、糖が多いほど活性が低くなり、フラボノイド類化合物の抗酸化活性は、分子中のフェノール性ヒドロキシ基の数の増加に伴い、活性が増強されることが明らかになっている。また、ヘルバセチンは、ヒト肝癌細胞HepG2のアポトーシスを誘導することができ、新型の抗癌剤として開発される潜在力を有している。
ヘルバセチンは、3,4′,5,7,8-ペンタヒドロキシフラボンであり、主にベンケイソウ科植物に存在しており、研究によって、イワベンケイ薬材中の遊離ヘルバセチンの含有量が低いことがわかっている。我々は、供給先が異なる12種のイワベンケイ薬材（中国食品薬品検定研究院が提供したロット番号121657-201101のイワベンケイおよびロット番号121412-200902のRhodiola cretinii対照薬材を含む）中の遊離ヘルバセチン含有量を分析した。得られた遊離ヘルバセチンの含有量はわずか0.0022%〜0.061%であった。表1に、具体的なデータを示している。
従来、ヘルバセチンに関する研究報告は比較的少なく、かつ量産に適した高純度ヘルバセチンの製造工程は開示されていない。
発明の目的：本発明は、酸加水分解、ポリアミドカラムクロマトグラフィー、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて、イワベンケイ薬材を原料としてヘルバセチンを製造する。簡易な工程であり、収率が高く（表1におけるチベット5号イワベンケイ薬材中の遊離ヘルバセチン含有量はわずか0.06%であるが、酸加水分解処理を経た後、加水分解液中のヘルバセチン含有量は4.36%に達し、含有量は72倍に向上した）、特異性が高く、量産に適しており、イワベンケイの抗酸化、抗腫瘍等の活性成分の探究およびヘルバセチンの開発利用のために、堅実な物質的な基盤となる。
技術手法：本発明に記載のイワベンケイ属植物からのヘルバセチン抽出方法は、次のステップを含む。
1）粉砕したイワベンケイ薬材を、抽出溶媒で抽出し、抽出液を減圧濃縮して抽出物エキスを得る。
2)抽出物エキスを抽出し、抽出後の水層をさらに酸加水分解する。
3）酸加水分解した溶液を、有機溶媒で抽出し、抽出液を混合し、減圧濃縮してヘルバセチン抽出物を得る。
4）ヘルバセチン抽出物を、ポリアミドカラムクロマトグラフィーにより処理し、ヘルバセチンを含有する溶出液を収集し、乾燥するまで濃縮し、ヘルバセチン粗製品を得る。
5）ヘルバセチン粗製品を、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって処理し、ヘルバセチンを含有する溶出液を収集し、乾燥するまで濃縮し、再結晶して、ヘルバセチン精製品を得る。
2)抽出物エキスを抽出し、抽出後の水層をさらに酸加水分解する。
3）酸加水分解した溶液を、有機溶媒で抽出し、抽出液を混合し、減圧濃縮してヘルバセチン抽出物を得る。
4）ヘルバセチン抽出物を、ポリアミドカラムクロマトグラフィーにより処理し、ヘルバセチンを含有する溶出液を収集し、乾燥するまで濃縮し、ヘルバセチン粗製品を得る。
5）ヘルバセチン粗製品を、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって処理し、ヘルバセチンを含有する溶出液を収集し、乾燥するまで濃縮し、再結晶して、ヘルバセチン精製品を得る。
上記課題をさらに解決するために、前記ステップ1）におけるイワベンケイは、ヘルバセチン-7-O-ラムノシドおよびヘルバセチン-7-O-(3′′-β-D-グルコシル)-ラムノシドの合計含有量が0.08%以上のベンケイソウ科イワベンケイ属植物のうちいずれか1種のイワベンケイを含む。
上記課題をさらに解決するために、前記ステップ1）における抽出溶媒は、質量％濃度が30.0%〜99.9%のメタノール水溶液および質量％濃度が70.0%〜90.0%のエタノール水溶液から選ばれる。
上記課題をさらに解決するために、前記ステップ1）における抽出は、浸出、浸透、超音波および加熱還流のうちのいずれか1種の方法を含む。
上記課題をさらに解決するために、前記ステップ2）における抽出は、沸点が60〜90℃の石油エーテルを用いて分離して抽出を行った。1回における抽出石油エーテルの用量と抽出物エキスの用量との比は（1〜3）：1（v/v）である。
上記課題をさらに解決するために、前記ステップ2）における酸加水分解は、直接酸加水分解または2相酸加水分解の方法を用い、酸加水分解は、塩酸、硫酸およびギ酸のうちのいずれか1種の酸を用い、用いる酸の質量分率は、0.2%〜10.0%である。
上記課題をさらに解決するために、前記2相酸加水分解における有機相は、石油エーテル-酢酸エチル（1：1）（v/v）、トルエンおよび酢酸エチルのうちのいずれか1種を含む。
上記課題をさらに解決するために、前記ステップ2）における酸加水分解時の加熱還流温度は、50℃〜100℃であり、酸加水分解の時間は、0.5時間〜12.0時間である。
上記課題をさらに解決するために、前記ステップ3）の抽出用有機溶媒は、石油エーテル-酢酸エチル（1:1）（v/v）または酢酸エチルであり、1回における有機溶媒と酸加水分解溶液との比は（1〜3）：1（v/v）であり、抽出回数は3〜5回である。
上記課題をさらに解決するために、前記ステップ4）に記載のポリアミドカラムクロマトグラフィーの溶出条件は、石油エーテル-酢酸エチル（1：1）（v/v）で溶出する。
上記課題をさらに解決するために、前記ステップ5）における逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーは、C18逆相カラムを用い、前記C18逆相カラムは、内径50mmのプレパックカラム、内径100mmのプレパックカラムまたはDAC分取カラムを選定する。
上記課題をさらに解決するために、前記ステップ5）における逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー処理の溶離液において、水を含むアセトニトリル溶液または水を含むメタノール溶液を用い、前記再結晶において、メタノール溶液を用いる。
1）本発明を用いることにより、高純度のヘルバセチンを製造することができ、ヘルバセチンの純度は90.0%〜99.9%に達する。
2）本発明を用いることにより、グラムレベルまたはキログラムレベルのヘルバセチンを得ることができ、量産に適している。
3）ヘルバセチンをアグリコンとする配糖体単体成分を原料としてヘルバセチンを製造する場合、工程が複雑で繁雑であり、かつコストが高く、精製サイクルが長い等の欠点を有するのに対し、本発明は、イワベンケイ薬材を原料としてヘルバセチンを製造し、簡易な工程であり、操作しやすく、経済的で、収率が高く、副生成物がなく、環境に優しい。
4）本発明は、クロマトグラフィー用ポリアミドを分離材料とし、ヘルバセチンに対して比較的優れた吸着性能および分離効果を有し、操作が簡単であり、経済的である。溶出再生しやすく、繰り返し利用でき、サイクルが短く、分離効果がよく、価格が低廉であり、フラボノイド類化合物を精製する模範的な方法の1つである。シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いた場合、ヘルバセチンの非特異的吸着が大きく、テーリングが問題であり、回収率が低く、溶出サイクルが長いのに対し、ポリアミドカラムクロマトグラフィーを用いた場合、上記課題を有効に解決することができる。
5）本発明は、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて精製し、分離効果は良好であり、操作しやすく、量産に適している。
6）本発明は、高純度のヘルバセチンを得ることができ、イワベンケイの抗酸化、心血管疾患の治療、抗腫瘍等薬理活性を探究する研究のために、堅実な物質的な基盤となる。
2）本発明を用いることにより、グラムレベルまたはキログラムレベルのヘルバセチンを得ることができ、量産に適している。
3）ヘルバセチンをアグリコンとする配糖体単体成分を原料としてヘルバセチンを製造する場合、工程が複雑で繁雑であり、かつコストが高く、精製サイクルが長い等の欠点を有するのに対し、本発明は、イワベンケイ薬材を原料としてヘルバセチンを製造し、簡易な工程であり、操作しやすく、経済的で、収率が高く、副生成物がなく、環境に優しい。
4）本発明は、クロマトグラフィー用ポリアミドを分離材料とし、ヘルバセチンに対して比較的優れた吸着性能および分離効果を有し、操作が簡単であり、経済的である。溶出再生しやすく、繰り返し利用でき、サイクルが短く、分離効果がよく、価格が低廉であり、フラボノイド類化合物を精製する模範的な方法の1つである。シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いた場合、ヘルバセチンの非特異的吸着が大きく、テーリングが問題であり、回収率が低く、溶出サイクルが長いのに対し、ポリアミドカラムクロマトグラフィーを用いた場合、上記課題を有効に解決することができる。
5）本発明は、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて精製し、分離効果は良好であり、操作しやすく、量産に適している。
6）本発明は、高純度のヘルバセチンを得ることができ、イワベンケイの抗酸化、心血管疾患の治療、抗腫瘍等薬理活性を探究する研究のために、堅実な物質的な基盤となる。
本発明に対する理解を深めるため、次に実施例を用いて本発明についてさらに詳述する。これらの実施例は、本発明の解釈に寄与するものであるが、本発明の保護範囲を限定するものではない。
ヘルバセチンの化学構造（図1参照）の決定方法は次のとおりである。核磁気共鳴装置を用いて、試料を分析した。1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ: 11.91(1H, s, 5-OH), 10.37(1H, s, 7-OH), 10.08(1H, s, 4′-OH),9.29(1H, s, 3-OH),8.62(1H, s, 8-OH),8.17 (2H, d, J=8.4Hz,H-2′,6′),6.94(2H, d, J=8.4Hz,H-3′,5′),6.27(1H, s, H-6)。以上のデータは、文献で報告されているヘルバセチンの核磁気データと一致し、ヘルバセチン(herbacetin)であると同定した。
図2に示すようにし、ヘルバセチン純度の測定条件は、次のとおりである。移動相がアセトニトリル(A)-0.1%酢酸水溶液(B)、勾配溶出[0min,A-B(8:92);10min,A-B(31:69); 25min,A-B(45:55)]、波長が275nm, Kromasil C18カラム（4.6×250mm，5μm）、流速が1.0 mL・min-1、カラム温度が35℃の条件で、試料を高速液体クロマトグラフで測定し、試料はHPLCクロマトグラムにおいて単一の対称ピークであった。
ポリアミドカラムクロマトグラフィーおよび逆相カラムクロマトグラフィーのプロセスにおいて、得られた溶出液に薄層クロマトグラフィー法を実施し，薄層クロマトグラフィー用展開溶媒の条件は、クロロホルム-メタノール-ギ酸（12：1：1）とし、展開後に紫外線ランプの下で検出した。
＜実施形態１＞
チベット産イワベンケイ薬材（高速液体クロマトグラフで測定したヘルバセチン-7-O-ラムノシドの含有量およびヘルバセチン-7-O-(3′′-β-D-グルコシル)-ラムノシドの含有量は、それぞれ0.12%および0.11%であった。薬材液体測定クロマトグラムを図3に示している。酸加水分解後の測定クロマトグラムは図4を参照。）を20kg秤量し、粉砕して20メッシュの篩にかけ、10倍量の質量分率が70%のエタノール溶液で2回加熱還流抽出し、1回1.5時間とし、抽出液を混合して減圧濃縮し、エタノール抽出物エキス（相対密度は1.072）を得た。エタノール抽出物エキスと等体積の石油エーテル（60〜90℃）で3回抽出し、抽出後の水層に、等体積の質量分率が1%の硫酸および抽出物エキスの2倍の体積の酢酸エチルを加え、撹拌し、加熱還流して2相酸加水分解処理を行い、12時間加水分解して、冷却した。次いで、加水分解液を石油エーテル-酢酸エチル（1:1）（v/v）で3回抽出した。1回の石油エーテル-酢酸エチル（1:1）（v/v）の用量と加水分解液との比は、1:1（v/v）とした。抽出液を混合して減圧濃縮し、831.2gの抽出物を得た。測定の結果、抽出物中のヘルバセチン含有量は11.38質量%であった。
チベット産イワベンケイ薬材（高速液体クロマトグラフで測定したヘルバセチン-7-O-ラムノシドの含有量およびヘルバセチン-7-O-(3′′-β-D-グルコシル)-ラムノシドの含有量は、それぞれ0.12%および0.11%であった。薬材液体測定クロマトグラムを図3に示している。酸加水分解後の測定クロマトグラムは図4を参照。）を20kg秤量し、粉砕して20メッシュの篩にかけ、10倍量の質量分率が70%のエタノール溶液で2回加熱還流抽出し、1回1.5時間とし、抽出液を混合して減圧濃縮し、エタノール抽出物エキス（相対密度は1.072）を得た。エタノール抽出物エキスと等体積の石油エーテル（60〜90℃）で3回抽出し、抽出後の水層に、等体積の質量分率が1%の硫酸および抽出物エキスの2倍の体積の酢酸エチルを加え、撹拌し、加熱還流して2相酸加水分解処理を行い、12時間加水分解して、冷却した。次いで、加水分解液を石油エーテル-酢酸エチル（1:1）（v/v）で3回抽出した。1回の石油エーテル-酢酸エチル（1:1）（v/v）の用量と加水分解液との比は、1:1（v/v）とした。抽出液を混合して減圧濃縮し、831.2gの抽出物を得た。測定の結果、抽出物中のヘルバセチン含有量は11.38質量%であった。
＜実施形態2＞
吉林省長白山（白頭山）産Rhodiola cretinii薬材（高速液体クロマトグラフで測定したヘルバセチン-7-O-ラムノシドの含有量およびヘルバセチン-7-O-(3′′-β-D-グルコシル)-ラムノシドの含有量は、それぞれ0.067%および0.028%であった、図5に、薬材液体測定クロマトグラムを示している。図6に、酸加水分解後に測定したクロマトグラムを示している。）を80kg秤量し、粉砕して20メッシュの篩にかけ、12倍量の質量分率が90%のエタノール溶液で浸透抽出し、浸透液を減圧濃縮し、エタノール抽出物エキスを得た。抽出液を混合して減圧濃縮し、エタノール抽出物エキス（相対密度は1.136）を得た。エタノール抽出物エキスと等体積の石油エーテル（60〜90℃）で3回抽出し、抽出後の水層に、先ず等体積の質量分率が5%の塩酸を加えてから、抽出物エキスの2倍の体積の酢酸エチルを加え、撹拌し、加熱還流して酸加水分解を3時間行い、冷却した。加水分解液を酢酸エチルで3回抽出した。1回の酢酸エチルの用量と加水分解液の用量との比は、1:1（v/v）とした。抽出液を混合して減圧濃縮し、1689.4gの抽出物を得た。測定の結果、抽出物中のヘルバセチン含有量は7.56%であった。
吉林省長白山（白頭山）産Rhodiola cretinii薬材（高速液体クロマトグラフで測定したヘルバセチン-7-O-ラムノシドの含有量およびヘルバセチン-7-O-(3′′-β-D-グルコシル)-ラムノシドの含有量は、それぞれ0.067%および0.028%であった、図5に、薬材液体測定クロマトグラムを示している。図6に、酸加水分解後に測定したクロマトグラムを示している。）を80kg秤量し、粉砕して20メッシュの篩にかけ、12倍量の質量分率が90%のエタノール溶液で浸透抽出し、浸透液を減圧濃縮し、エタノール抽出物エキスを得た。抽出液を混合して減圧濃縮し、エタノール抽出物エキス（相対密度は1.136）を得た。エタノール抽出物エキスと等体積の石油エーテル（60〜90℃）で3回抽出し、抽出後の水層に、先ず等体積の質量分率が5%の塩酸を加えてから、抽出物エキスの2倍の体積の酢酸エチルを加え、撹拌し、加熱還流して酸加水分解を3時間行い、冷却した。加水分解液を酢酸エチルで3回抽出した。1回の酢酸エチルの用量と加水分解液の用量との比は、1:1（v/v）とした。抽出液を混合して減圧濃縮し、1689.4gの抽出物を得た。測定の結果、抽出物中のヘルバセチン含有量は7.56%であった。
＜実施形態３＞
雲南省麗江産イワベンケイ薬材（高速液体クロマトグラフで測定したヘルバセチン-7-O-ラムノシドの含有量およびヘルバセチン-7-O-(3′′-β-D-グルコシル)-ラムノシドの含有量は、それぞれ0.10%および0.10%であった。）を10kg秤量し、粉砕して20メッシュの篩にかけ、12倍量の質量分率が90%のメタノール溶液で3回超音波抽出し、1回1時間とし、抽出液を混合して減圧濃縮し、メタノール抽出物エキス（相対密度は1.025）を得た。メタノール抽出物エキスの3倍の体積の石油エーテル（60〜90℃）で3回抽出し、抽出後の水層に、等体積の質量分率が1%の塩酸を加え、撹拌し、加熱還流して酸加水分解処理を行い、1時間加水分解して、冷却した。加水分解液中に石油エーテル-酢酸エチル（1:1）（v/v）を加えて5回抽出した。1回における石油エーテル-酢酸エチル（1:1）（v/v）の用量と加水分解液の用量との比は、1:1（v/v）とした。抽出液を混合して減圧濃縮し、402.7gの抽出物を得た。測定の結果、抽出物中のヘルバセチン含有量は10.69%であった。
雲南省麗江産イワベンケイ薬材（高速液体クロマトグラフで測定したヘルバセチン-7-O-ラムノシドの含有量およびヘルバセチン-7-O-(3′′-β-D-グルコシル)-ラムノシドの含有量は、それぞれ0.10%および0.10%であった。）を10kg秤量し、粉砕して20メッシュの篩にかけ、12倍量の質量分率が90%のメタノール溶液で3回超音波抽出し、1回1時間とし、抽出液を混合して減圧濃縮し、メタノール抽出物エキス（相対密度は1.025）を得た。メタノール抽出物エキスの3倍の体積の石油エーテル（60〜90℃）で3回抽出し、抽出後の水層に、等体積の質量分率が1%の塩酸を加え、撹拌し、加熱還流して酸加水分解処理を行い、1時間加水分解して、冷却した。加水分解液中に石油エーテル-酢酸エチル（1:1）（v/v）を加えて5回抽出した。1回における石油エーテル-酢酸エチル（1:1）（v/v）の用量と加水分解液の用量との比は、1:1（v/v）とした。抽出液を混合して減圧濃縮し、402.7gの抽出物を得た。測定の結果、抽出物中のヘルバセチン含有量は10.69%であった。
＜実施形態４＞
実施例1における831.2gの抽出物を、充填剤が200〜400メッシュの常圧ポリアミドカラムに注入し、径と長さの比は1:15とし、石油エーテル-酢酸エチル（1:1）（v/v）で溶出した。薄層クロマトグラフィーで測定し、ヘルバセチンを含む溶出液を収集し、乾燥するまで減圧濃縮して、ヘルバセチン粗製品167.4gを得た。次いで、ヘルバセチン粗製品に対して、逆相DAC分取カラム（200×250mm,10μm）でカラムクロマトグラフィーを行い、質量％濃度が26%のアセトニトリル溶液（0.1%酢酸を含む）で溶出した。薄層クロマトグラフィーで測定し、目的溶出液を混合し、乾燥するまで減圧して溶媒を回収し、メタノール溶解で再結晶処理を行った。4℃で一晩置き、結晶をろ過し、減圧して乾燥させ、ヘルバセチン54.5gを得た。純度は90.10%であった。
実施例1における831.2gの抽出物を、充填剤が200〜400メッシュの常圧ポリアミドカラムに注入し、径と長さの比は1:15とし、石油エーテル-酢酸エチル（1:1）（v/v）で溶出した。薄層クロマトグラフィーで測定し、ヘルバセチンを含む溶出液を収集し、乾燥するまで減圧濃縮して、ヘルバセチン粗製品167.4gを得た。次いで、ヘルバセチン粗製品に対して、逆相DAC分取カラム（200×250mm,10μm）でカラムクロマトグラフィーを行い、質量％濃度が26%のアセトニトリル溶液（0.1%酢酸を含む）で溶出した。薄層クロマトグラフィーで測定し、目的溶出液を混合し、乾燥するまで減圧して溶媒を回収し、メタノール溶解で再結晶処理を行った。4℃で一晩置き、結晶をろ過し、減圧して乾燥させ、ヘルバセチン54.5gを得た。純度は90.10%であった。
＜実施形態５＞
実施例2における563.1gの抽出物を、充填剤が200〜400メッシュの常圧ポリアミドカラムに注入し、径と長さの比は1:17とし、石油エーテル-酢酸エチル（1:1）（v/v）で溶出した。薄層クロマトグラフィーで測定し、ヘルバセチンを含む溶出液を収集し、乾燥するまで減圧濃縮して、ヘルバセチン粗製品80.1gを得た。次いで、ヘルバセチン粗製品に対して、C18分取カラム（50×250mm,10μm）でカラムクロマトグラフィーを行い、質量％濃度が32%のメタノール溶液（0.1%酢酸を含む）で溶出した。薄層クロマトグラフィーで測定し、目的溶出液を合併し、乾燥するまで減圧して溶媒を回収し、メタノール溶解で再結晶処理を行った。4℃で一晩置き、結晶をろ過し、減圧して乾燥させ、ヘルバセチン18.7gを得た。純度は95.25%であった。
実施例2における563.1gの抽出物を、充填剤が200〜400メッシュの常圧ポリアミドカラムに注入し、径と長さの比は1:17とし、石油エーテル-酢酸エチル（1:1）（v/v）で溶出した。薄層クロマトグラフィーで測定し、ヘルバセチンを含む溶出液を収集し、乾燥するまで減圧濃縮して、ヘルバセチン粗製品80.1gを得た。次いで、ヘルバセチン粗製品に対して、C18分取カラム（50×250mm,10μm）でカラムクロマトグラフィーを行い、質量％濃度が32%のメタノール溶液（0.1%酢酸を含む）で溶出した。薄層クロマトグラフィーで測定し、目的溶出液を合併し、乾燥するまで減圧して溶媒を回収し、メタノール溶解で再結晶処理を行った。4℃で一晩置き、結晶をろ過し、減圧して乾燥させ、ヘルバセチン18.7gを得た。純度は95.25%であった。
＜実施形態６＞
実施例3における402.7gの抽出物を、充填剤が200〜400メッシュの常圧ポリアミドカラムに注入し、径と長さの比は1:14とし、石油エーテル-酢酸エチル（1:1）（v/v）で溶出した。薄層クロマトグラフィーで測定し、ヘルバセチンを含む溶出液を収集し、乾燥するまで減圧濃縮して、ヘルバセチン粗製品90.2gを得た。次いで、ヘルバセチン母液に対して、C18分取カラム（100×200mm,10μm）でカラムクロマトグラフィーを行い、質量％濃度が26%のアセトニトリル溶液（0.1%酢酸を含む）で溶出した。薄層クロマトグラフィーで測定し、目的溶出液を合併し、乾燥するまで減圧して溶媒を回収し、メタノール溶解で再結晶処理を行った。4℃で一晩置き、結晶をろ過し、減圧して乾燥させ、ヘルバセチン23.4gを得た。純度は99.90%であった。
実施例3における402.7gの抽出物を、充填剤が200〜400メッシュの常圧ポリアミドカラムに注入し、径と長さの比は1:14とし、石油エーテル-酢酸エチル（1:1）（v/v）で溶出した。薄層クロマトグラフィーで測定し、ヘルバセチンを含む溶出液を収集し、乾燥するまで減圧濃縮して、ヘルバセチン粗製品90.2gを得た。次いで、ヘルバセチン母液に対して、C18分取カラム（100×200mm,10μm）でカラムクロマトグラフィーを行い、質量％濃度が26%のアセトニトリル溶液（0.1%酢酸を含む）で溶出した。薄層クロマトグラフィーで測定し、目的溶出液を合併し、乾燥するまで減圧して溶媒を回収し、メタノール溶解で再結晶処理を行った。4℃で一晩置き、結晶をろ過し、減圧して乾燥させ、ヘルバセチン23.4gを得た。純度は99.90%であった。
上記実施例は、本発明の技術的概念および特徴について説明するためのものにすぎず、その目的は、当業者が本発明の内容を理解し実施できるようにすることであり、これらは本発明の保護範囲を限定することはできない。本発明の主旨に基づき実質的に行われた同等の変更または修正は、いずれも本発明の保護範囲内に含まれるべきである。
Claims (11)
- 次のステップを含むことを特徴とする、イワベンケイ属植物からのヘルバセチンの抽出方法。
1）粉砕したイワベンケイ薬材を、抽出溶媒で抽出し、抽出液を減圧濃縮して抽出物エキスを得る
2）抽出物エキスを抽出し、抽出後の水層をさらに酸加水分解する
3）酸加水分解した溶液を、有機溶媒で抽出し、抽出液を混合し、減圧濃縮してヘルバセチン抽出物を得る
4）ヘルバセチン抽出物を、ポリアミドカラムクロマトグラフィーで処理し、ヘルバセチンを含有する溶出液を収集し、乾燥するまで濃縮し、ヘルバセチン粗製品を得る
ここで、前記ポリアミドカラムクロマトグラフィーの溶出条件を、石油エーテル−酢酸エチル（1：1）（v/v）で溶出することとする
5）ヘルバセチン粗製品を、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーで処理し、ヘルバセチンを含有する溶出液を収集し、乾燥するまで濃縮し、再結晶して、ヘルバセチン精製品を得る - 前記ステップ1）におけるイワベンケイは、ヘルバセチン-7-O-ラムノシドおよびヘルバセチン-7-O-(3′′-β-D-グルコシル)-ラムノシドの合計含有量が0.08%以上のベンケイソウ科イワベンケイ属植物のうちいずれか1種のイワベンケイを含むことを特徴とする請求項1に記載のイワベンケイ属植物からのヘルバセチンの抽出方法。
- 前記ステップ1）における抽出溶媒は、質量％濃度が30.0%〜99.9%のメタノール水溶液および質量％濃度が70.0%〜90.0%のエタノール水溶液から選ばれることを特徴とする請求項1に記載のイワベンケイ属植物からのヘルバセチンの抽出方法。
- 前記ステップ1）における抽出は、浸出、浸透、超音波および加熱還流のうちのいずれか1種の方法を含むことを特徴とする請求項1に記載のイワベンケイ属植物からのヘルバセチンの抽出方法。
- 前記ステップ2）における抽出は、沸点範囲が60〜90℃の石油エーテルで分離して抽出を行い、1回の抽出石油エーテルの用量と抽出物エキスとの比は（1〜3）：1（v/v）であることを特徴とする請求項1に記載のイワベンケイ属植物からのヘルバセチンの抽出方法。
- 前記ステップ2）における酸加水分解は、直接酸加水分解または2相酸加水分解の方法を用い、酸加水分解は、塩酸、硫酸、ギ酸のうちのいずれか1種の酸を用い、用いる酸の質量分率は、0.2%〜10.0%であることを特徴とする請求項1に記載のイワベンケイ属植物からのヘルバセチンの抽出方法。
- 前記2相酸加水分解における有機相は、石油エーテル-酢酸エチル（1：1）（v/v）、トルエンおよび酢酸エチルのうちのいずれか1種を含むことを特徴とする請求項6に記載のイワベンケイ属植物からのヘルバセチンの抽出方法。
- 前記ステップ2）における酸加水分解時の加熱還流温度は、50℃〜100℃であり、酸加水分解の時間は、0.5時間〜12.0時間であることを特徴とする請求項1に記載のイワベンケイ属植物からのヘルバセチンの抽出方法。
- 前記ステップ3）の抽出用有機溶媒は、石油エーテル-酢酸エチル（1:1）（v/v）または酢酸エチルであり、1回の有機溶媒と酸加水分解溶液との比は（1〜3）：1（v/v）であり、抽出回数は3〜5回であることを特徴とする請求項1に記載のイワベンケイ属植物からのヘルバセチンの抽出方法。
- 前記ステップ5）における逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーは、C18逆相カラムを用い、前記C18逆相カラムは、内径50mmのプレパックカラムもしくは内径100mmのプレパックカラムまたはDAC分取カラムを選定することを特徴とする請求項1に記載のイワベンケイ属植物からのヘルバセチンの抽出方法。
- 前記ステップ5）における逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー処理の溶離液は、水を含むアセトニトリル溶液または水を含むメタノール溶液を用い、前記再結晶は、メタノール溶液を用いることを特徴とする請求項1に記載のイワベンケイ属植物からのヘルバセチンの抽出方法。
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