CN102146114B

CN102146114B - 一种丹参酮ⅱa的制备方法

Info

Publication number: CN102146114B
Application number: CN 201010110579
Authority: CN
Inventors: 乔善义; 孙磊; 王燕; 于孟琦; 杨楠; 刘万仓
Original assignee: Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Current assignee: Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Priority date: 2010-02-10
Filing date: 2010-02-10
Publication date: 2013-01-09
Anticipated expiration: 2030-02-10
Also published as: CN102146114A

Abstract

本发明涉及丹参酮IIA的制备方法，特别是涉及一种从黑骨藤中制备丹参酮IIA的方法，所述方法包括粗提、柱色谱分离、重结晶等步骤，具体地，如下步骤：1)将黑骨藤进行一次或多次粗提，并除去固体杂质，得到粗提物；2)将粗提物进行柱色谱分离，并用与该柱色谱相适宜的洗脱剂进行梯度洗脱；3)通过薄层色谱法检查得到的洗脱流份，然后合并含有丹参酮IIA的洗脱流份，浓缩后放置，得到沉淀或红色片状晶体；4)收集沉淀或红色片状晶体，进行重结晶，得到桔红色针状结晶，即为丹参酮IIA。本发明为首次从植物黑骨藤中制备得到丹参酮IIA。

Description

一种丹参酮ⅡA的制备方法

技术领域

本发明属于天然药物领域，涉及一种丹参酮IIA的制备方法，特别是涉及一种从黑骨藤中制备丹参酮IIA的方法。

背景技术

黑骨藤学名为西南杠柳(Periploca forrestii Schltr.)，是萝藦科(Asclepiadaceae)杠柳属(Periploca L.)植物，在我国西南地区称之为黑骨藤。黑骨藤主要产于贵州、云南、四川、广西等省区，是千百年来苗族人用来治疗风湿、类风湿疾病及颈肩臂腰腿疼痛的佳品。根据《中国植物志》(中国科学院中国植物志编辑委员会编，中国植物志，北京：科学出版社，1977，63：272)中的记载，黑骨藤为藤状灌木，长达10米，具乳汁，多分枝，全株无毛。该药味苦、辛，性凉，小毒，其全株供药用，可舒筋活络、祛风除湿，用于治疗风湿性关节炎、跌打损伤、胃痛、消化不良、闭经、痢疾等。

近年来，有关于黑骨藤化学成分的研究不断涌现，从中分离了多种不同类型的化合物，主要以强心苷元、强心苷、C₂₁甾体苷和三萜为主，还包括一些酚酸、黄酮、寡糖等类型的化合物(张援虎等，杠柳属植物化学成分研究进展，天然产物研究与开发，2003，15(2)：157-161；张援虎等，黑龙骨化学成分的研究，中草药，2006，37(3)：345-347；张援虎等，黑龙骨中两个新强心苷的结构鉴定，有机化学，2006，26(3)：329-332；Feng JQ et al.Immunosuppressive pregnane glycosides fromPeriploca sepium and Periploca forrestii.Phytochemistry，2008，69：2716-2723；Feng JQ，Zhao WM.Complete 1H and ¹³C NMRassignments of four new oligosaccharides and two new glycosides fromPeriploca forrestii.Magn Reson Chem，2009，47(8)：701-705；甘秀海等，黑骨藤中极性部位化学成分研究，中国中药杂志，2009，34(24)：3225-3228；甘秀海等，黑骨藤化学成分的研究，中草药，2009，40(5)：708-710)。

丹参酮IIA(Tanshinone IIA)是从植物丹参(Salvia miltiorrhizaBunge.)中分离得到的二萜醌类化合物，其化学式如下面的式1所示。将丹参酮IIA磺化后制成的水溶性丹参酮IIA磺酸钠，临床用于心血管疾病，尤其是冠心病的治疗，具有很好的疗效(张玉方等，丹参酮IIA及其钠盐的药理研究进展，药学专论，2008，17(1)：1-2；张玉静等，丹参酮IIA对心血管影响研究的进展，临床荟萃，2009，24(18)：1653-1654)。根据文献报道，除心血管药理作用外，丹参酮IIA还具有抗炎、抗感染、抗肿瘤、保护肝肺损伤等多方面的药理活性(Ren ZHet al.Tanshinone IIA attenuates inflammatory responses of rats withmyocardial infarction by reducing MCP-1 expression.Phytomedicine，2009，Article in press；Park EJ et al.Preventive effects of a purifiedextract isolated from Salvia miltiorrhiza enriched with tanshinone I，tanshinone IIA and cryptotanshinone on hepatocyte injury in vitroand in vivo.Food Chem Toxicol，2009，47(11)：2742-2748；Xu M et al.Corrigendum to“Tanshinone IIA reduces lethality and acute lunginjury in LPS-treated mice by inhibition of PLA2 activity”.Eur JPharmacol，2009，607(1-3)：194-200；Fan GW et al.Theanti-inflammatory activities of Tanshinone IIA，an active componentof TCM，are mediated by estrogen receptor activation and inhibitionof iNOS.J Steroid Biochem Mol Biol，2009，113(3-5)：275-280；Tang Cet al.Tanshinone IIA inhibits constitutive STAT3 activation，suppresses proliferation，and induces apoptosis in rat C6 glioma cells.Neurosci Lett，2010，Article in press；朱嘉蓉，罗厚蔚.丹参酮II A的抑菌活性研究.中国药科大学学报，2004，35(4)：368-370；李琦等，丹参酮II A及其纳米粒诱导肝癌细胞凋亡及对p38MAPK、TGFβ1信号蛋白表达的影响，肿瘤，2008，28(1)：8-12)，因此是一个极具开发价值的活性单体。

根据文献调研结果，除大黄素甲醚外(朱欣婷等，黑骨藤化合物的分离鉴定，山地农业生物学报，2008，27(2)：186-188)，目前尚无黑骨藤中其它醌类化学成分的研究报道，更未见其中含有丹参酮IIA的研究报道。

目前，尽管制备丹参酮IIA的方法有很多，包括，例如有机溶剂提取法(包括采用冷浸、加热回流、超声和组织破碎等手段)，微乳提取法(包括采用加热回流、微波和超声等手段)和超临界二氧化碳萃取法等(毕跃峰等，不同提取方法对丹参中丹参酮IIA和丹参酚酸B含量测定的影响，药物分析杂志，2009，29(7)：1209-1212；孙妍等，丹参药材中丹参酮IIA提取工艺优选及HPLC法含量测定，中医药学报，2008，36(5)：37-39；杨华等，O/W型微乳用于提取中药丹参的实验研究，中国中药杂志，2008，33(22)：2617-2622；王承学等，超临界CO₂萃取丹参酮IIA提取工艺，长春工业大学学报，2007，28(4)：457-460；王利彦等，甘西鼠尾草中丹参酮IIA的含量测定，青海医学院学报，2006，27(4)：262-264)等，但都是从丹参及同科属植物中制得。本发明人首次从植物黑骨藤中制备得到丹参酮IIA，也是首次从萝藦科杠柳属植物中得到二萜醌类化合物。

发明内容

本发明的目的是提供丹参酮IIA的制备方法，包括粗提、柱色谱分离、重结晶等步骤，其特征在于选用黑骨藤作为制备原料，并且优选地，包括如下步骤：

1)将黑骨藤进行一次或多次粗提，并除去固体杂质，得到粗提物；

2)将粗提物进行柱色谱分离，并用与该柱色谱相适宜的洗脱剂进行梯度洗脱；

3)通过薄层色谱法检查得到的洗脱流份，然后合并含有丹参酮IIA的洗脱流份，浓缩后放置，得到沉淀或红色片状晶体；

4)收集沉淀或红色片状晶体，进行重结晶，得到桔红色针状结晶，即为丹参酮IIA。

在本发明中，所述选用黑骨藤作为制备原料，是指从黑骨藤中制备丹参酮IIA。

在本发明的一个实施方案中，所述方法的特征在于选用黑骨藤作为制备原料，包括粗提、萃取、柱色谱分离、重结晶等步骤(图9)，并且优选地，包括如下步骤：

2)将粗提物浓缩至干，然后用有机溶剂进行一次或多次萃取，挥干或浓缩萃取液得到萃取物，优选地，所述有机溶剂为乙酸乙酯；

3)将萃取物重新溶解，搅拌后进行柱色谱分离，并用与该柱色谱相适宜的洗脱剂进行梯度洗脱；

4)通过薄层色谱法检查得到的洗脱流份，然后合并含有丹参酮IIA的洗脱流份，浓缩后放置，得到沉淀或红色片状晶体；

5)收集沉淀或红色片状晶体，进行重结晶，得到桔红色针状结晶，即为丹参酮IIA。在本发明的一个实施方案中，所述方法还包括在所述重结晶之前，将红色片状晶体进行洗涤的步骤。

在上述的方法中，步骤1)中的所述“粗提”可以采用有机溶剂提取法、水提取法、微乳提取法、超临界流体萃取法或水蒸气蒸馏法进行，其中优选的是有机溶剂提取法或超临界流体萃取法。所用有机溶剂可以选自：石油醚、正己烷、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚、甲醇、乙醇或乙醇溶液等，以及上述有机溶剂的任意比例混和组成的复合溶剂，其中优选的是氯仿、二氯甲烷或乙酸乙酯。

在上述的方法中，所述有机溶剂提取法或水提取法包括如下方法中的至少一种：加热回流、超声、微波、浸渍、渗漉、酶解、超微粉碎或组织破碎，其中优选的是加热回流或渗漉。所述超临界流体萃取法的溶剂选自如下物质：二氧化碳、烷烃、烯烃、甲苯、甲醇、氨、水、或丙酮，其中优选的是二氧化碳。所述柱色谱的填料选自如下物质：硅胶、氧化铝、硅藻土、大孔树脂、微孔树脂、活性炭、C₁₈或聚酰胺，其中优选的是硅胶或氧化铝。所述固体杂质可以通过过滤、离心或自然沉淀除去。

上述提取制备方法中，所用粗提的方法、柱色谱填料、溶剂及其浓度的选择等完全在本领域技术人员的知识范围内。

通过熔点测定、质谱测定、核磁共振波谱测定，证明本制备方法制得的样品为丹参酮IIA。

附图说明

图1：实施例1制备的丹参酮IIA样品1的一级质谱图。

图2：实施例1制备的丹参酮IIA样品1的二级质谱图。

图3：实施例1制备的丹参酮IIA样品1的¹H-NMR图。

图4：实施例1制备的丹参酮IIA样品1的¹³C-NMR图。

图5：实施例1制备的丹参酮IIA样品1的HMBC图。

图6：实施例1制备的丹参酮IIA样品1的HMQC图。

图7：实施例2制备的丹参酮IIA样品2的一级质谱图。

图8：实施例2制备的丹参酮IIA样品2的二级质谱图。

图9：本发明的丹参酮IIA提取流程示意图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。其中，洗脱所用有机溶剂的比均为体积比。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：丹参酮IIA样品1的制备

将黑骨藤(购自云南省大理州巍山县医药有限责任公司)晾干，破碎。取黑骨藤破碎物6kg，加8倍量(体积/重量，l/kg)的95％(V/V)的乙醇回流提取2h，过滤，得到的滤渣用同法再提取一次，合并滤液并减压浓缩至干，得到360g提取物。向该提取物中加入三倍体积的乙酸乙酯进行固液萃取，反复萃取十次后合并萃取液，减压浓缩至干，得乙酸乙酯浸膏102g。将乙酸乙酯浸膏重新用乙酸乙酯溶解，加入1～1.5倍100～200目硅胶并搅拌均匀，挥干溶剂后进行硅胶柱层析(100～200目，7.5cm×100cm)，用石油醚、石油醚-乙酸乙酯(100∶1)、石油醚-乙酸乙酯(80∶1)、石油醚-乙酸乙酯(50∶1)、石油醚-乙酸乙酯(30∶1)、石油醚-乙酸乙酯(15∶1)、石油醚-乙酸乙酯(8∶1)进行梯度洗脱，得到石油醚-乙酸乙酯(8∶1)洗脱流份，其中有红色片状晶体析出，收集该红色晶体并用石油醚-乙酸乙酯(5∶1)充分洗涤，经甲醇重结晶后，得桔红色针状结晶2g，即丹参酮IIA样品1。

实施例2：丹参酮IIA样品2的制备

将黑骨藤(购自云南省大理州巍山县医药有限责任公司)晾干，破碎。该黑骨藤破碎物3kg，加8倍量(体积/重量，l/kg)的二氯甲烷-甲醇(2∶8，V∶V)超声提取2h，过滤后减压浓缩至干，得到45g提取物。将该提取物用氯仿溶解，加入1～1.5倍200～300目硅胶并搅拌均匀，挥干溶剂后进行硅胶柱层析(200～300目，3.5cm×100cm)，用石油醚-乙酸乙酯(20∶1)充分洗脱后，再以石油醚-乙酸乙酯(8∶1)洗脱，该洗脱流份有红色片状晶体析出，收集该红色结晶并用石油醚-乙酸乙酯(5∶1)充分洗涤，经甲醇重结晶后，得到桔红色针状结晶1.1g，即丹参酮IIA样品2。

实施例3：丹参酮IIA样品1和样品2的熔点测定

仪器与试剂：X-4型精密显微熔点测定仪(北京天地宇科技有限责任公司)，丹参酮IIA对照品购自中国药品生物制品检定所。

取丹参酮IIA样品1适量，按《中华人民共和国药典》(2005年版)二部附录VIC第一法测定熔点3次，取其均值，测得熔点为208.9℃～210.6℃，该样品与丹参酮IIA对照品混合后，熔点未见改变，证明该样品为丹参酮IIA。

以同样的方法，测得样品2的熔点为208.6℃～210.2℃，该样品与丹参酮IIA对照品混合后，熔点未见改变，证明该样品为丹参酮IIA。

实施例4：丹参酮IIA样品1和样品2的质谱测定

仪器与试剂：API 3000型三重串联四级杆质谱仪(美国AB公司)，甲醇为色谱纯。

取丹参酮IIA样品1适量，以甲醇溶解，直接进样分析。

质谱条件：喷雾电压4000eV，碰撞电压30eV，离子源温度200℃。

其一级质谱图中(见图1)主要为质量数为295的[M+H]⁺峰，进一步测定其二级质谱图(见图2)，图中包含质量数为277、262、253、249、221和206的碎片离子峰，与文献数据一致(实验条件与文献中相同)(Yang M et al.Characterization of tanshinones in theroots of Salvia miltiorrhiza(Dan-shen)by high-performance liquidchromatography with electrospray ionization tandem massspectrometry.Rapid Commun Mass Spectrom，2006，20(8)：1266-1280)，证明该样品为丹参酮IIA。

取丹参酮IIA样品2适量，以甲醇溶解，进行HPLC-MS分析。

色谱条件：流动相75％腈(含0.05％甲酸)，色谱柱迪马Diamond C₁₈柱，流速1.0mL/min，柱后分流。

质谱条件：喷雾电压4000eV，碰撞电压32eV，离子源温度400℃。

其一级质谱图中(见图7)除质量数为295的[M+H]⁺峰外，还有质量数为317的[M+Na]⁺峰，二级质谱图见图8，与文献数据一致(Yang M et al.Characterization of tanshinones in the roots of Salviamiltiorrhiza(Dan-shen)by high-performance liquid chromatographywith electrospray ionization tandem mass spectrometry.RapidCommun Mass Spectrom，2006，20(8)：1266-1280)。

实施例5：丹参酮IIA样品1的核磁共振波谱测定

仪器与试剂：JMN-ECA-400型超导NMR仪(日本电子)，氘代氯仿。

取丹参酮IIA样品1适量，以氘代氯仿溶解，测定其¹H-NMR、 ¹³C-NMR、HMBC和HMQC图谱，结果见图3～图6。¹H-NMR(CDCl₃，400MHz)δ：7.63(1H，d，J＝8.0Hz，H-6)，7.55(1H，d，J＝8.0Hz，H-7)，7.23(H，d，J＝1.6Hz，H-15)，3.18(2H，t，J＝6.4Hz，H-1)，2.27(3H，t，J＝1.6Hz，H-17)，1.79(2H，m，H-2)，1.66(2H，m，H-3)，1.31(6H，d，H-18，19)。¹³C-NMR(CDCl₃，100MHz)δ：29.89(C-1)，19.09(C-2)，37.78(C-3)，34.63(C-4)，150.09(C-5)，133.48(C-6)，119.85(C-7)，127.42(C-8)，126.43(C-9)，144.49(C-10)，183.62(C-11)，175.76(C-12)，121.11(C-13)，161.71(C-14)，141.26(C-15)，120.23(C-16)，8.83(C-17)，31.83(C-18)，31.83(C-19)。以上数据均与文献数据一致(实验条件与文献中相同)(Lee SY et al.Inhibition of Osteoclast Differentiation byTanshinones from the Root of Salvia miltiorrhiza Bunge.Arch PharmRes，2005，28(8)：909-913)，证明该样品为丹参酮IIA。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims

1.黑骨藤在制备丹参酮IIA中的用途。

2.一种丹参酮IIA的制备方法，包括如下步骤：

4)收集沉淀或红色片状晶体，进行重结晶，得到桔红色针状结晶，即为丹参酮IIA；

其中，

步骤1)中的所述粗提采用有机溶剂提取法、水提取法、微乳提取法、或超临界流体萃取法进行。

3.一种丹参酮IIA的制备方法，包括如下步骤：

2)将粗提物浓缩至干，然后用有机溶剂进行一次或多次萃取，挥干或浓缩萃取液得到萃取物；

5)收集沉淀或红色片状晶体，进行重结晶，得到桔红色针状结晶，即为丹参酮IIA；

其中，

步骤1)中的所述粗提采用有机溶剂提取法、水提取法、微乳提取法、或超临界流体萃取法进行；

步骤2)中的有机溶剂选自石油醚、正己烷、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚、甲醇、乙醇或乙醇溶液，以及上述有机溶剂的任意比例混和组成的复合溶剂。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其中，所述粗提为有机溶剂提取法或超临界流体萃取法。

5.根据权利要求2或3所述的方法，其中，所述有机溶剂提取法或水提取法包括如下方法中的至少一种：

加热回流、超声、微波、浸渍、渗漉、酶解、超微粉碎或组织破碎。

6.根据权利要求2或3所述的方法，其中，所述超临界流体萃取法的溶剂选自如下物质：

二氧化碳、烷烃、烯烃、甲苯、甲醇、氨、水、或丙酮。

7.根据权利要求3所述的方法，所述步骤2)中所述有机溶剂为乙酸乙酯。

8.根据权利要求2或3所述的方法，其中，所述柱色谱的填料选自如下物质：

硅胶、氧化铝、硅藻土、大孔树脂、微孔树脂、活性炭、C₁₈或聚酰胺。

9.根据权利要求2或3所述的方法，其中，还包括在所述重结晶之前，将红色片状晶体进行洗涤的步骤。