CN103497229B - 从地乌药材中同时制备地乌皂苷w1和w3的方法 - Google Patents
从地乌药材中同时制备地乌皂苷w1和w3的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种终产物收率较高，制备过程中不涉及毒性和易燃易爆溶剂的从地乌药材中同时制备地乌皂苷W1和W3的方法，包括：1)将地乌药材加入到加热器皿中；2）向加热器皿中加入水，煎煮后过滤，保留残渣；3）重复步骤2）操作1至2次，合并过滤的煎煮液；4）将合并后的煎煮液上D-101型大孔树脂柱，依次用水、10%、50%和95%乙醇溶液进行梯度洗脱，收集50%乙醇洗脱处理后的洗脱液并减压浓缩干燥处理；5）将得到的地乌总皂苷提取物用水溶解，再将溶解液上样于反相ODS柱，依次用30%、65%和100%乙醇溶液进行洗脱处理，利用TLC检测，收集富含地乌皂苷W1和W3的对应浓度的乙醇洗脱液，减压干燥处理；6）采用制备型高效液相色谱法分离得到地乌皂苷W1和W3纯品。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备地乌皂苷W1和W3的方法，具体来说，涉及一种终产物收率较高，制备过程中不涉及毒性和易燃易爆溶剂的从地乌药材中同时制备地乌皂苷W1和W3的方法。
背景技术
类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是以关节滑膜慢性炎症为主的自身免疫性疾病，机体免疫应答过程中T淋巴细胞的过度激活、增殖和浸润会加重关节炎症反应和骨膜组织增生，可引起关节肿痛，关节软骨破坏，关节间隙变窄，晚期关节畸形，最终出现不同程度的残疾。根据统计表明，RA在全世界均有发病，平均发病率为1%，而我国患病率为0.3%～0.4%，若未及时诊治，70%患者2年后可致残，平均寿命缩短10～15年。西药中RA的治疗药物以阿司匹林等非甾体类抗炎药或糖皮质激素为主，由于RA的病因与发病机制复杂，上述药物不能有效地阻断病变的发展，并且存在诸多的不良反应。中药雷公藤多苷制剂作为RA的治疗药物，疗效已被普遍认可，体现出中药对治疗RA具有的独特优势。但是，由于其严重的毒副作用，使雷公藤多苷制剂的临床应用受到一定限制。
中药地乌为毛茛科银莲花属植物林荫银莲花(Anemone flaccida Fr. Schmidt)的干燥根茎，又名黑地雷、金串珠、蜈蚣三七等，气微，味辛、苦，主产于四川、贵州、湖南、湖北、浙江等省区(中药大辞典[M].上海:上海科技出版社,2005,1115)，具解毒、祛风湿之功效，临床用于治疗风湿痹痛、跌打损伤等症，在民间广泛用于RA的治疗。现代药理学研究表明地乌提取物具有抗组织胺、抗炎、抗过敏等作用，对小鼠II型胶原诱导性关节炎具有显著疗效。临床研究表明地乌提取物对RA治疗效果好并且毒性较小，因此，地乌在开发高效、低毒的RA治疗药物方面前景广阔。以地乌总皂苷部位制成的抗RA中药5类新药——地乌风湿安胶囊，目前已进入Ⅲ期临床研究阶段。
地乌皂苷W1和W3在地乌中含量较高，文献报道地乌皂苷W1和W3对小鼠体外脾淋巴细胞增殖有显著的抑制作用，具较强的免疫抑制活性(邴飞鸿,等.中国药科大学报,2008,39(6):496-499)，这与地乌药材用于调节机体免疫机能、治疗RA的临床用途相吻合，表明地乌皂苷W1和W3是地乌中重要的活性成分。因此，制备一定量的地乌皂苷W1和W3标准品，有利于建立地乌药材及其制剂的质量标准，从而保证地乌药材及其制剂用药的安全性、有效性及可控性。
地乌皂苷W1和W3互为差向异构体，两个化合物的结构差别仅为苷元3位相连的5碳糖上4-OH的α与β的构型区别(图Ⅰ)，故两者的理化性质十分接近，分离难度较大。文献报道的制备地乌皂苷W1和W3方法为：地乌药材用乙醇回流提取，提取液浓缩后，用乙酸乙酯、正丁醇萃取，正丁醇萃取物经反复硅胶柱层析得到地乌皂苷粗品，再经制备型高效液相色谱纯化得到单体化合物(Zhao L,et al.Planta Med,1991,57(6):572-574;张兰天,等.中国中药杂志,2008,14(33):1696-1699;邴飞虹, 等.从林荫银莲花提取的地乌皂苷W3标准品及制备工艺.中国专利:CN200510018363.9,2005-10-19)。地乌皂苷W1和W3的结构式如图1所示。上述文献中所报道的制备方法，工序复杂，且因反复使用硅胶柱层析导致终产物收率较低。同时，因制备过程中使用了氯仿(一类溶剂)、乙腈(二类溶剂)和乙酸乙酯(易燃易爆溶剂)等有机溶剂，属一类和二类溶剂的毒性大(致癌性强)，对环境污染严重，且上述这些易燃易爆溶剂不利于生产过程中的安全管理，故不适合工业化生产。
发明内容
针对以上的不足，本发明提供了一种从地乌药材中同时制备地乌皂苷W1和W3的方法，利用本发明工艺得到的单体化合物（乌皂苷W1和W3）的纯度均大于98%，可作为标准品用于地乌药材、地乌总皂苷提取物及地乌风湿安胶囊的质量控制，而且本发明的终产物收率较高，制备过程中不涉及毒性和易燃易爆溶剂。
本发明的从地乌药材中同时制备地乌皂苷W1和W3的方法，它包括如下步骤：
1）将地乌药材原材料加入到加热器皿中；
2）向加热器皿中加入水，加热煎煮，过滤得到煎煮液；
3）将煎煮液经过大孔树脂柱，利用50～80%乙醇溶液进行洗脱，收集50～80%乙醇洗脱后的洗脱液，将收集的洗脱液减压浓缩干燥，得到地乌总皂苷；
4）将得到的地乌总皂苷经反相ODS柱层析分离富集得到含地乌皂苷W1和W3的粗品；
5）采用制备型高效液相色谱法分离得到地乌皂苷W1和W3纯品。
本发明的从地乌药材中同时制备地乌皂苷W1和W3的方法，它包括如下步骤：
1）将地乌药材原材料加入到加热器皿中；
2）向加热器皿中加入水，加热煎煮，过滤得到煎煮液，残渣保留在加热器皿中；
3）重复步骤2）的操作1到2次，合并所有的滤液；
4）将合并后煎煮液经过大孔树脂柱，利用50～80%乙醇溶液进行洗脱，收集50～80%乙醇洗脱后的洗脱液，将收集的洗脱液减压浓缩干燥，得到地乌总皂苷；
5）将得到的地乌总皂苷经反相ODS柱层析分离富集得到含地乌皂苷W1和W3的粗品；
6）采用制备型高效液相色谱法分离得到地乌皂苷W1和W3纯品。
为了进一步实现本发明，每次加入的水与所述地乌药材原材料的质量比为1：（3～10）。
为了进一步实现本发明，每次加热煎煮的时间为1～3小时。
为了进一步实现本发明，在利用50～80%乙醇溶液进行洗脱处理之前，首先依次利用水和10～30%乙醇的溶液进行洗脱除杂处理。
为了进一步实现本发明，所述地乌总皂苷经反相ODS柱层析分离富集处理具体包括：
a1）将得到的地乌总皂苷用水溶解；
a2）将溶解液上样于反相ODS柱；
a3）依次用30%乙醇、65%乙醇和100%乙醇溶液进行洗脱；
a4）利用TLC检测，收集富含地乌皂苷W1和W3的对应浓度的乙醇洗脱液，
a5）对收集的洗脱液进行减压干燥，得到地乌皂苷W1和W3的粗品混合物。
为了进一步实现本发明，所述制备型高效液相色谱法分离处理的制备色谱条件为：固定相为C18反相键合硅胶，流动相为20%～80%乙醇-水系统，检测波长为201～230nm，流速为1～20mL·min-1。
为了进一步实现本发明，所述大孔树脂柱的大孔树脂为非极性或弱极性大孔树脂。
本发明的有益效果：本发明的地乌皂苷W1和W3的制备工艺中所使用的树脂材料和反相ODS材料均可反复使用，所使用的洗脱系统仅含有乙醇和水，溶剂回收后，可重复使用，大大降低了生产成本；另外，相比文献报道的方法，上述制备方法未使用到毒性特别大的氯仿、乙腈等有机溶剂，不仅降低了对操作者的健康威胁，也降低了对环境的污染；再有，利用本发明工艺得到的乌皂苷W1和W3的纯度均大于98%，可作为标准品用于地乌药材、地乌总皂苷提取物及地乌风湿安胶囊的质量控制。
附图说明
图1为地乌皂苷W1和W3的化学分子式。
图2地乌皂苷W1的HR-ESI-MS谱图。
图3地乌皂苷W1的核磁共振氢谱图。
图4地乌皂苷W1的核磁共振碳谱图。
图5地乌皂苷W3的HR-ESI-MS谱图。
图6地乌皂苷W3的核磁共振氢谱图。
图7地乌皂苷W3的核磁共振碳谱图。
具体实施方式
实施例1
1）取干燥的地乌药材原材料1kg加入到加热器皿中，地乌药材原材料一般为粉末状。
2）向加热器皿中倒入10L（10kg）水，加热煎煮1小时，过滤出煎煮液，保留残渣在加热器皿中。
3）重复步骤2）操作1次，合并每次过滤出的煎煮液。
4）首先，将合并后的煎煮液上D-101型大孔树脂柱；
然后，依次用水、10%乙醇、50%乙醇和95%乙醇溶液进行梯度洗脱，通过水、10%乙醇和95%乙醇溶液的洗脱处理达到除去杂质和清洗的目的，收集50%乙醇洗脱处理后的洗脱液，
最后，对收集的洗脱液进行减压浓缩干燥处理，从而得到地乌总皂苷提取物62g。
5）首先，将得到的地乌总皂苷提取物用水溶解；
然后，将地乌总皂苷提取物的溶解液上样于反相ODS柱；
接着，依次用30%乙醇、65%乙醇和100%乙醇溶液进行洗脱处理；
然后，利用TLC检测，收集富含地乌皂苷W1和W3的对应浓度 的乙醇洗脱液，
最后，对收集的洗脱液进行减压干燥处理，得到含地乌皂苷W1和W3粗品的混合物9.4g。
6）采用制备型高效液相色谱法分离得到地乌皂苷W1和W3纯品：
首先，将地乌皂苷W1和地乌皂苷W3的粗品混合物用50%乙醇-水溶液溶解；
接着，利用0.22μm微孔滤膜进行过滤；
然后，经制备型高效液相色谱，色谱柱的固定相为C18反相键合硅胶，流动相为50%乙醇-水系统，流速8mL·min-1，以201nm为检测波长，分别收集地乌皂苷W1和W3的色谱峰，样品溶液冷冻干燥，得到地乌皂苷W11.82g，地乌皂苷W32.35g。
实施例2
1）取干燥的地乌药材原材料1kg加入到加热器皿中，地乌药材原材料一般为粉末状。
2）向加热器皿中倒入8L（8kg）水，加热煎煮3小时，过滤出煎煮液，保留残渣在加热器皿中。
3）重复步骤2）操作2次，合并每次过滤出的煎煮液。
4）首先，将合并后的煎煮液上AB-8型大孔树脂柱；
然后，依次用水、25%乙醇、80%乙醇和95%乙醇溶液进行梯度洗脱，通过水、25%乙醇和95%乙醇溶液的洗脱处理达到除去杂质和清洗的目的，收集80%乙醇洗脱处理后的洗脱液，
最后，对收集的洗脱液进行减压浓缩干燥处理，从而得到地乌总皂苷提取物58g。
5）首先，将得到的地乌总皂苷提取物用水溶解；
然后，将地乌总皂苷提取物的溶解液上样于反相ODS柱；
接着，依次用30%乙醇、65%乙醇和100%乙醇溶液进行洗脱处理；
然后，利用TLC检测，收集富含地乌皂苷W1和W3的对应浓度的乙醇洗脱液，
最后，对收集的洗脱液进行减压干燥处理，得到含地乌皂苷W1和W3粗品的混合物8.8g。
6）采用制备型高效液相色谱法分离得到地乌皂苷W1和W3纯品：
首先，将地乌皂苷W1和地乌皂苷W3的粗品混合物用50%乙醇-水溶液溶解；
接着，利用0.22μm微孔滤膜进行过滤；
然后，经制备型高效液相色谱，色谱柱的固定相为C18反相键合硅胶，流动相为50%乙醇-水系统，流速10mL·min-1，以230nm为检测波长，分别收集地乌皂苷W1和W3的色谱峰，样品溶液冷冻干燥，得到地乌皂苷W11.79g，地乌皂苷W32.23g。
实施例3
1）取干燥的地乌药材原材料1kg加入到加热器皿中，地乌药材原材料一般为粉末状。
2）向加热器皿中倒入5L（5kg）水，加热煎煮2小时，过滤出煎煮液，保留残渣在加热器皿中。
3）重复步骤2）操作2次，合并每次过滤出的煎煮液。
4）首先，将合并后的煎煮液上AB-8型大孔树脂柱；
然后，依次用水、35%乙醇、75%乙醇和95%乙醇溶液进行梯度洗脱，通过水、35%乙醇和95%乙醇溶液的洗脱处理达到除去杂质和清洗的目的，收集75%乙醇洗脱处理后的洗脱液，
最后，对收集的洗脱液进行减压浓缩干燥处理，从而得到地乌总皂苷提取物60g。
5）首先，将得到的地乌总皂苷提取物用水溶解；
然后，将地乌总皂苷提取物的溶解液上样于反相ODS柱；
接着，依次用30%乙醇、65%乙醇和100%乙醇溶液进行洗脱处理；
然后，利用TLC检测，收集富含地乌皂苷W1和W3的对应浓度的乙醇洗脱液，
最后，对收集的洗脱液进行减压干燥处理，得到含地乌皂苷W1和W3粗品的混合物9.1g。
6）采用制备型高效液相色谱法分离得到地乌皂苷W1和W3纯品：
首先，将地乌皂苷W1和地乌皂苷W3的粗品混合物用50%乙醇-水溶液溶解；
接着，利用0.22μm微孔滤膜进行过滤；
然后，经制备型高效液相色谱，色谱柱的固定相为C18反相键合硅胶，流动相为50%乙醇-水系统，流速20mL·min-1，以230nm为检测波长，分别收集地乌皂苷W1和W3的色谱峰，样品溶液冷冻干燥，得到地乌皂苷W11.77g，地乌皂苷W32.31g。
实施例4：
1）取干燥的地乌药材原材料1kg加入到加热器皿中，地乌药材原材 料一般为粉末状。
2）向加热器皿中倒入8L（8kg）水，加热煎煮1.5小时，过滤得到煎煮液。
3）首先，将煎煮液上HP-100型大孔树脂柱；
然后，依次用水、15%乙醇、65%乙醇和95%乙醇溶液进行梯度洗脱，通过水、15%乙醇和95%乙醇溶液的洗脱处理达到除去杂质和清洗的目的，收集65%乙醇洗脱处理后的洗脱液，
最后，对收集的洗脱液进行减压浓缩干燥处理，从而得到地乌总皂苷提取物57g。
4）首先，将得到的地乌总皂苷提取物用水溶解；
然后，将地乌总皂苷提取物的溶解液上样于反相ODS柱；
接着，依次用30%乙醇、65%乙醇和100%乙醇溶液进行洗脱处理；
然后，利用TLC检测，收集富含地乌皂苷W1和W3的对应浓度的乙醇洗脱液，
最后，对收集的洗脱液进行减压干燥处理，得到含地乌皂苷W1和W3粗品的混合物8.7g。
5）采用制备型高效液相色谱法分离得到地乌皂苷W1和W3纯品：
首先，将地乌皂苷W1和地乌皂苷W3的粗品混合物用50%乙醇-水溶液溶解；
接着，利用0.22μm微孔滤膜进行过滤；
然后，经制备型高效液相色谱，色谱柱的固定相为C18反相键合硅胶，流动相为50%乙醇-水系统，流速5mL·min-1，以201nm为检测波 长，分别收集地乌皂苷W1和W3的色谱峰，样品溶液冷冻干燥，得到地乌皂苷W11.71g，地乌皂苷W32.08g。
地乌皂苷W1和W3的结构鉴定：
本发明制备的地乌皂苷W1的化学名称为3-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖-齐墩果酸28-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖(1→6)-β-D-葡萄糖苷；地乌皂苷W3的的化学名称为3-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃木糖-齐墩果酸28-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖(1→6)-β-D-葡萄糖苷。
地乌皂苷W1：无定形粉末，mp210～220℃，(c0.5，MeOH)，香草醛-浓硫酸显紫红色(TLC)，Liebermann-Burchard及Molish反应均呈阳性，提示该化合物为三萜皂苷类化合物。化合物的IR谱中可以观察到羟基(3421cm-1)和羰基(1742cm-1)的特征吸收峰。HR-ESI-MS（见图2）谱显示m/z:1203.6189[M-H]-，结合1H、13C NMR（见图3和图4）及DEPT-135谱，推断该化合物的分子式为C59H96O25。
在化合物的1H NMR谱中显示出7个角甲基的质子信号[δH0.91,0.91,0.91,1.08,1.11,1.18,1.26(各3H,s)]、1个连氧的次甲基氢信号[δH3.25(1H,dd,J=11.7,3.8Hz)]和1个稀氢信号[δH5.42(1H,br s)]。
在化合物的13C NMR谱中共出现了59个碳信号，结合DEPT-135谱可知其中包括7个甲基碳信号(δC15.7,17.0,17.5,23.7,26.1,28.1和33.1)、1个连氧碳信号(δC88.8)、1对烯碳信号(δC123.0和144.1)及1个酯羰基信号(δC176.5)。以上波谱数据结合分子式信息，提示该化合物为C-3和C-28位有糖链取代的齐墩果酸型三萜皂苷类化合物。
此外，该化合物的1H和13C NMR谱中还显示出5个糖残基的端基质子信号[δH6.25(1H,d,J=8.0Hz),6.12(1H,br s),5.86(1H,br s),5.00(1H,d,J=7.9Hz)和4.92(1H,d,J=5.1Hz)]和相应的5个端基碳信号(δC104.9,104.8,102.8,101.8和95.7)。
化合物以上波谱数据与文献(张兰天,高石喜久,张彦文等.地乌中三萜皂苷类成分.中国中药杂志,2008,14(33):1696-1699)所报道的3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖齐墩果酸28-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖酯苷一致，故鉴定该化合物的结构为3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖齐墩果酸28-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖酯苷，即hederasaponin B。
地乌皂苷W3：无定形粉末，mp277～279℃，(c0.5,MeOH)，香草醛-浓硫酸显紫红色(TLC)，Liebermann-Burchard反应及Molish反应均呈阳性，提示该化合物为三萜皂苷类化合物。化合物的IR谱中可以观察到羟基(3421cm-1)和羰基(1738cm-1)的特征吸收峰。HR-ESI-MS（见图5）谱显示m/z:1203.6165[M-H]-，结合1H、13C NMR（见图6和图7）及DEPT-135谱，推断该化合物的分子式为C59H96O25。
化合物的1H NMR谱中显示出7个角甲基的质子信号[δH0.88,0.88,0.88,1.08,1.18,1.23,1.24(各3H,s)]、1个连氧的次甲基氢信号[δH3.30(1H,dd,J=11.5,3.9Hz)]和1个稀氢信号[δH5.39(1H,br s)]。
化合物的13C NMR谱中共出现了59个碳信号，结合DEPT-135谱可知其中包括7个甲基碳信号(δC15.6,17.1,17.5,23.6,26.0,28.0和33.1)、1个连氧碳信号(δC88.4)、1对烯碳信号(δC122.8和144.1)及1个酯羰基信 号(δC176.5)。以上波谱数据结合分子式信息，提示该化合物为C-3和C-28位有糖链取代的齐墩果酸型三萜皂苷类化合物。
此外，该化合物的1H和13C NMR谱中还显示出5个糖残基的端基质子信号[δH6.53(1H,br s),6.24(1H,d,J=8.0Hz),5.85(1H,br s),4.99(1H,d,J=7.9Hz)和4.82(1H,d,J=7.1Hz)]和相应的5个端基碳信号(δC106.0,104.8,102.6,101.9和95.6)。
化合物以上波谱数据与文献(Zhao L,Chen W,Fang Q.Two new oleanane saponins from Anemone flaccida.Planta Med,1991,57(6):572-574)所报道的3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-β-D-木糖齐墩果酸28-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖酯苷一致，故鉴定该化合物的结构为3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-β-D-木糖齐墩果酸28-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖酯苷，即flaccidoside II。
表1地乌皂苷W1和W3苷元部分的13C-NMR(Pyridine-d5,δ)数据
| C | W1 | W3 | C | W1 | W3 |
| 1 | 39.0 | 39.2 | 16 | 23.9 | 24.1 |
| 2 | 28.1 | 28.6 | 17 | 46.3 | 46.5 |
| 3 | 88.8 | 89.1 | 18 | 39.6 | 42.0 |
| 4 | 40.0 | 39.8 | 19 | 47.1 | 47.3 |
| 5 | 60.0 | 56.2 | 20 | 30.8 | 31.0 |
| 6 | 18.6 | 18.8 | 21 | 34.0 | 34.3 |
| 7 | 33.2 | 33.4 | 22 | 32.6 | 32.8 |
| 8 | 41.8 | 40.2 | 23 | 28.4 | 28.4 |
| 9 | 48.1 | 48.3 | 24 | 17.6 | 17.8 |
| 10 | 37.1 | 37.3 | 25 | 15.6 | 15.9 |
| 11 | 23.8 | 24.0 | 26 | 17.0 | 17.3 |
| 12 | 123.2 | 123.2 | 27 | 26.1 | 26.3 |
| 13 | 144.1 | 144.4 | 28 | 176.6 | 176.8 |
| 14 | 42.2 | 42.4 | 29 | 33.1 | 33.1 |
| 15 | 26.5 | 26.8 | 30 | 23.4 | 23.6 |
表2地乌皂苷W1和W3糖残基部分的13C-NMR (Pyridine-d5, δ)数据
| W1 | W3 | W1 | W3 | ||
| C-3 (xyl) | C-28（Rha） | ||||
| 1 | 106.1 | 1 | 102.8 | 102.7 | |
| 2 | 79.5 | 2 | 72.8 | 72.5 | |
| 3 | 77.9 | 3 | 71.0 | 72.7 | |
| 4 | 71.5 | 4 | 73.7 | 73.8 | |
| 5 | 66.9 | 5 | 70.5 | 70.3 | |
| 6 | 18.7 | 18.7 | |||
| ara | glc | ||||
| 1 | 105.0 | 1 | 104.8 | 104.8 | |
| 2 | 76.0 | 2 | 75.4 | 75.3 | |
| 3 | 74.1 | 3 | 76.6 | 76.4 | |
| 4 | 68.6 | 4 | 78.9 | 78.7 | |
| 5 | 64.6 | 5 | 78.4 | 78.2 | |
| 6 | 61.4 | 61.2 | |||
| Rha | glc | ||||
| 1 | 101.8 | 101.9 | 1 | 95.7 | 95.6 |
| 2 | 72.6 | 72.3 | 2 | 73.9 | 73.4 |
| 3 | 72.4 | 72.5 | 3 | 78.1 | 78.0 |
| 4 | 74.2 | 74.1 | 4 | 70.4 | 70.8 |
| 5 | 70.0 | 69.7 | 5 | 77.2 | 77.1 |
| 6 | 18.6 | 18.5 | 6 | 69.3 | 69.1 |
以上所述仅为本发明的较佳实施方式，本发明并不局限于上述实施方式，在实施过程中可能存在局部微小的结构改动，如果对本发明的各种改动或变型不脱离本发明的精神和范围，且属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型。
Claims (7)
1.一种从地乌药材中同时制备地乌皂苷W1和W3的方法，其特征在于，它包括如下步骤：
1)将地乌药材原材料加入到加热器皿中；
2)向加热器皿中加入水，加热煎煮，过滤得到煎煮液；
3)将煎煮液经过大孔树脂柱，利用50～80％乙醇溶液进行洗脱，收集50～80％乙醇洗脱后的洗脱液，将收集的洗脱液减压浓缩干燥，得到地乌总皂苷；
4)将得到的地乌总皂苷经反相ODS柱层析分离富集得到含地乌皂苷W1和W3的粗品；
5)采用制备型高效液相色谱法分离得到地乌皂苷W1和W3纯品，
所述步骤4)包括：
a1)将得到的地乌总皂苷用水溶解；
a2)将溶解液上样于反相ODS柱；
a3)依次用30％乙醇、65％乙醇和100％乙醇溶液进行洗脱；
a4)利用TLC检测，收集富含地乌皂苷W1和W3的对应浓度的乙醇洗脱液；
a5)对收集的洗脱液进行减压干燥，得到地乌皂苷W1和W3的粗品混合物。
2.一种从地乌药材中同时制备地乌皂苷W1和W3的方法，其特征在于，它包括如下步骤：
1)将地乌药材原材料加入到加热器皿中；
2)向加热器皿中加入水，加热煎煮，过滤得到煎煮液，残渣保留在加热器皿中；
3)重复步骤2)的操作1到2次，合并所有的滤液；
4)将合并后煎煮液经过大孔树脂柱，利用50～80％乙醇溶液进行洗脱，收集50～80％乙醇洗脱后的洗脱液，将收集的洗脱液减压浓缩干燥，得到地乌总皂苷；
5)将得到的地乌总皂苷经反相ODS柱层析分离富集得到含地乌皂苷W1和W3的粗品；
6)采用制备型高效液相色谱法分离得到地乌皂苷W1和W3纯品，
所述步骤5)包括：
a1)将得到的地乌总皂苷用水溶解；
a2)将溶解液上样于反相ODS柱；
a3)依次用30％乙醇、65％乙醇和100％乙醇溶液进行洗脱；
a4)利用TLC检测，收集富含地乌皂苷W1和W3的对应浓度的乙醇洗脱液；
a5)对收集的洗脱液进行减压干燥，得到地乌皂苷W1和W3的粗品混合物。
3.根据权利要求1或2所述的从地乌药材中同时制备地乌皂苷W1和W3的方法，其特征在于，每次加入的水与所述地乌药材原材料的质量比为1：(3～10)。
4.根据权利要求1或2所述的从地乌药材中同时制备地乌皂苷W1和W3的方法，其特征在于，每次加热煎煮的时间为1～3小时。
5.根据权利要求1或2所述的从地乌药材中同时制备地乌皂苷W1和W3的方法，其特征在于，在利用50～80％乙醇溶液进行洗脱处理之前，首先依次利用水和10～30％乙醇的溶液进行洗脱除杂处理。
6.根据权利要求1或2所述的从地乌药材中同时制备地乌皂苷W1和W3的方法，其特征在于，所述制备型高效液相色谱法分离处理的制备色谱条件为：固定相为C18反相键合硅胶，流动相为20％～80％乙醇-水系统，检测波长为201～230nm，流速为1～20mL·min-1。
7.根据权利要求1或2所述的从地乌药材中同时制备地乌皂苷W1和W3的方法，其特征在于，所述大孔树脂柱的大孔树脂为非极性或弱极性大孔树脂。
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