CN108395464B

CN108395464B - 一种从积雪草出发制备积雪草苷、羟基积雪草苷和积雪草苷b的方法

Info

Publication number: CN108395464B
Application number: CN201710068645.2A
Authority: CN
Inventors: 邹节明; 吴敏菊
Original assignee: Guilin Sanjin Pharmaceuticals Co Ltd
Current assignee: Guilin Sanjin Pharmaceuticals Co Ltd
Priority date: 2017-02-08
Filing date: 2017-02-08
Publication date: 2019-12-31
Anticipated expiration: 2037-02-08
Also published as: CN108395464A

Abstract

本发明涉及一种从积雪草出发制备积雪草苷、羟基积雪草苷和积雪草苷B的方法。包括：1)取积雪草，用水提取，滤过离心，上大孔树脂，碱溶液洗涤，水洗至中性，洗脱，浓缩，喷雾干燥；2)用甲醇溶解喷雾粉，滤过，析出结晶物，滤过，反复析晶，得到结晶物，干燥得积雪草苷；3)析晶的母液回收溶剂和水液合并滤过，上柱，水洗至流出液颜色变淡，再依次用30％、60％甲醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，溶解，滤过，析晶，重复析晶，溶解，柱层析，洗脱，得羟基积雪草苷；4)30％甲醇洗脱液的母液回收溶剂，反复溶解、滤过、析晶，柱层析，洗脱，得积雪草苷B。本发明从积雪草药材出发，不涉及毒性大的溶剂，具有环保、对仪器设备要求不高等优点。

Description

一种从积雪草出发制备积雪草苷、羟基积雪草苷和积雪草苷B 的方法

技术领域

本发明属于中药制备分离技术领域，具体地说，涉及一种从积雪草出发制备积雪草苷、羟基积雪草苷和积雪草苷B的方法。

背景技术

积雪草Centella asiatica(L.)Urban，又名胡薄荷、地钱草等，为伞形科积雪草属植物，广泛分布在南非、印度以及我国长江流域以南各地，是一种传统中草药。据研究报道，积雪草具有消炎、增强记忆力、促进胶原蛋白合成、抗抑郁和抗癌等多种生理活性。

积雪草的化学成分复杂，主要有三萜类、黄酮类、挥发油类、多炔烯类等。目前认为，积雪草的主要活性成分为积雪草总苷，积雪草总苷是一种混合物，主要由三萜烷酸形成的糖苷组成，包括积雪草苷-B、羟基积雪草苷和积雪草苷，它们都具有五环三萜结构和糖苷支链，仅在三萜环上的羟基数目和位置存在着差异。虽然它们的结构及其相似，但生物活性却不尽相同，其中羟基积雪草苷具有消炎和治疗风湿性关节炎等活性；积雪草苷能够促进伤口的愈合，对烧伤性瘢痕有明显的治愈作用，常作为评价积雪草药理活性的标识性成分；由于积雪草苷-B纯品难以获得，关于它的药理活性还未见报道。

积雪草是三金片的主要药味，其皂苷类成分是主要活性物质，其中的积雪草苷、羟基积雪草苷和积雪草苷B三个成分占到总皂苷的70％左右，对其进行含量测定对产品的质量控制有积极意义。羟基积雪草苷和积雪草苷B为五环三萜皂苷类化合物，二者互为同分异构体，极性相似，分离和纯化难度大，目前市面没有积雪草苷B的对照品供应。

CN101724006A公开了一种分离积雪草苷-B、羟基积雪草苷和积雪草苷的方法，包括：将原料溶于甲醇水溶液后通入模拟移动床色谱系统，用甲醇水溶液洗脱得到积雪草苷，提余液蒸除溶剂后得到一次固体料；将一次固体料溶于含乙腈和甲基叔丁基醚的水溶液或通入模拟移动床色谱系统，用含乙腈和甲基叔丁基醚的水溶液洗脱得到羟基积雪草苷，提余液蒸除溶剂后得到二次固体料；将二次固体料溶于甲醇水溶液后通入模拟移动床色谱系统，用甲醇水溶液洗脱得到积雪草苷-B。然而，该方法从含积雪草总苷的原料出发，采用模拟移动床色谱系统，其操作复杂，对设备要求高，且使用甲基叔丁基醚，具有一定的毒性和危险性，在储存和使用过程中都需要充分重视。

CN102477063公开了制备型高效液相色谱仪分离积雪草提取物中的积雪草苷B与羟基积雪草苷的方法，在流动相内添加环糊精，再用有机溶剂萃取去除溶剂中的环糊精得到纯品，该方法操作复杂，添加β-环糊精的溶剂容易造成色谱柱堵塞，降低色谱柱的使用寿命，成本高，不易工业化生产。CN102532244A公开了制备高纯度积雪草苷的方法，通过萃取、脱色、重结晶的方法得到积雪草苷纯品，但工艺中采用多种有机溶剂对积雪草提取物浸膏进行萃取，有机溶剂用量多，容易造成二次污染。CN101948501A公开了一种羟基积雪草苷的制备方法，提取液经大孔树脂柱层、活性炭脱色、析晶、大孔树脂再层析，最后得到98％以上纯度羟基积雪草苷，该工艺周期长，工艺复杂，成本高。

综上，由于积雪草中各成分性质的复杂性和特殊性，尤其是积雪草总苷中积雪草苷、羟基积雪草苷和积雪草苷B的结构及理化性质都较为接近，其中羟基积雪草苷和积雪草苷B是一对同分异构体，它们和积雪草苷相比只多了一个羟基，而强极性糖元的连接又大大地弱化了这种微小极性的差异，使得很难用常规的分离方法将这三种物质完全分离。现有技术要么多数是从积雪草总苷出发制备上述三种化合物，要么是从积雪草出发制备分离其中的一种或两种化合物，目前尚未见到从积雪草出发同时制备积雪草苷、羟基积雪草苷和积雪草苷B的报道。

有鉴于此特提出本发明。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种从积雪草出发、操作简单、对仪器设备要求不高，且不涉及毒性较大的溶剂的制备积雪草苷、羟基积雪草苷和积雪草苷 B的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种从积雪草出发制备积雪草苷、羟基积雪草苷和积雪草苷B的方法，其中，所述的方法包括如下步骤：

1)取积雪草，用水提取，滤过后离心，上大孔树脂，用碱溶液洗涤，再加水洗至流出液呈中性，用乙醇进行洗脱，收集醇洗脱液，回收乙醇，浓缩，喷雾干燥，得到喷雾粉；

2)用甲醇将喷雾粉溶解，滤过，滤液静置，析出白色结晶物，滤过，母液挥去部分甲醇再重复静置析晶，析出物用乙酸乙酯洗涤，重复析晶，析出物用甲醇温热溶解，滤过，滤液水浴挥去甲醇，收集液面析出的白色物料，水液备用；析出物用甲醇反复析晶，最后得到结晶物，干燥得到白色不定型固体A，经结构鉴定为积雪草苷；

3)析晶的母液回收溶剂和步骤2)备用的水液合并滤过，滤液上MCI树脂柱，用水洗至流出液颜色变淡，再依次用30％、60％的甲醇溶液适量进行洗脱，分段收集醇洗脱液，蒸干，浓缩，用甲醇溶解，滤过，滤液静置析晶，重复多次析晶，结晶物用流动相溶解，上反相中压柱层析，用乙腈-水或乙醇-水或甲醇-水进行反复洗脱，得到白色不定型固体B，经结构鉴定为羟基积雪草苷；

4)步骤3)中MCI树脂柱30％甲醇洗脱液的母液回收溶剂，蒸干，残渣用甲醇溶解，滤过，静置析晶，析出物用甲醇溶解，滤过，重复多次析晶，直到析出物为白色针晶状物质，滤过，结晶物用混合溶液溶解，上反相中压柱层析，用乙腈-水或乙醇-水进行反复洗脱，得白色不定型固体C，经结构鉴定为积雪草苷B。

本发明方法从积雪草药材出发，主要采用大孔树脂和MCI柱，乙醇、甲醇、乙腈、水等常用试验试剂，不涉及毒性较大的溶剂，具有环保等优势；同时本发明方法根据化合物的理化性质不同，选用不同的方法和条件；并且本发明方法采用了提取、离心分离、洗脱、喷雾干燥、过滤、重结晶等步骤，具有操作简单、对仪器设备要求不高等优点。

采用HPLC-UV和HPLC-ELSD联用方法对样品进行检测，结果表明采用本发明方法得到的 A样(积雪草苷)的纯度为91.9％，B样(羟基积雪草苷)的纯度为99.1％，C样(积雪草苷B) 的纯度为99.6％。可见，采用本发明方法得到的积雪草苷、羟基积雪草苷和积雪草苷B的纯度较高，为进一步研究积雪草苷、羟基积雪草苷和积雪草苷B的药理作用、新药的开发提供基础。

进一步的，步骤1)中，所述的碱溶液为pH值为9～12的碱溶液。

所述的碱溶液的用量为1～8倍量柱体积，优选1～3倍量柱体积，更优选1.5倍量柱体积。

所述的大孔树脂为D-101型大孔树脂、AB-8型大孔树脂或HPD-100型大孔树脂。

步骤4)中，所述的静置析晶为置于温度10℃以下的环境中静置析晶，优选置于温度-10～ 10℃的环境中静置析晶，更优选-5～5℃。

步骤1)中，所述的用乙醇洗脱为用40％～70％的乙醇1～8倍柱体积进行洗脱。

步骤2)中，用于温热溶解的甲醇为60～80％甲醇，用于反复析晶的甲醇为80％甲醇。

步骤3)中，所述的流动相为乙腈-水或乙醇-水或甲醇-水；优选体积比20:80的乙腈- 水、体积比40:60的乙醇-水或体积比40:60的甲醇-水。

步骤3)中，所述的反复洗脱用的乙腈-水、乙醇-水或甲醇-水为体积比20:80的乙腈- 水、体积比40:60的乙醇-水或体积比40:60的甲醇-水。

步骤4)中，所述的混合溶液为乙腈-水、乙醇-水或甲醇-水的混合溶液；优选，体积比 20：80的乙腈-水、体积比40：60的乙醇-水或体积比50：50的甲醇-水的混合溶液。

步骤4)中，反复洗脱用的乙腈-水或乙醇-水为体积比20:80的乙腈-水或体积比为40:60 的乙醇-水。

采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

(1)本发明的方法是从积雪草出发同时制备并得到高纯度的积雪草苷、羟基积雪草苷和积雪草苷B样品；

(2)本发明的方法采用了提取、离心分离、洗脱、喷雾干燥、过滤、重结晶等步骤，具有操作简单、对仪器设备要求不高等优点；

(3)本发明的方法采用乙醇、甲醇、乙腈和水等常用试验试剂，不涉及毒性较大的溶剂，具有环保等优势。

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。

附图说明

图1是A组分的红外光谱图；

图2为B组分的紫外光谱图；

图3为B组分的红外光谱图；

图4为C组分的紫外光谱图；

图5为C成分的红外光谱图。

需要说明的是，这些附图和文字描述并不旨在以任何方式限制本发明的构思范围，而是通过参考特定实施例为本领域技术人员说明本发明的概念。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

1)取积雪草30Kg，用水提取2次，滤过后离心，上大孔树脂，用pH值为10.5的碱溶液1.5倍量柱体积进行洗涤，再加水洗至流出液呈中性，用65％的乙醇1.5倍柱体积进行洗脱，收集醇洗脱液，回收乙醇，浓缩，喷雾干燥，得到喷雾粉。

2)用甲醇1800ml将喷雾粉溶解，滤过，滤液静置，析出白色结晶物，滤过，母液挥去部分甲醇再重复静置析晶三次，析出物用乙酸乙酯洗涤，重复析晶三次，析出物用80％甲醇温热溶解，滤过，滤液水浴慢慢挥去甲醇，收集液面析出的白色物料，水液备用。析出物用80％甲醇反复析晶，最后得到针晶样的结晶物，干燥得到约20g的白色不定型固体A，经结构鉴定为积雪草苷。经HPLC-UV和HPLC-ELSD进行检查，其所获得的积雪草苷的纯度为99.3％。

3)析晶的母液回收溶剂和步骤2)的备用水液合并滤过，滤液上MCI树脂柱，用水洗至流出液颜色变淡，再依次用30％、60％的甲醇溶液适量进行洗脱，分段收集醇洗脱液，浓缩，干燥，用甲醇溶解，滤过，滤液静置析晶，重复多次析晶，结晶物用流动相(乙醇-水)溶解，上反相(RP-C18)中压柱层析，用乙腈-水(20：80)进行反复洗脱，得到约10g白色不定型固体B。经结构鉴定为羟基积雪草苷，经HPLC-ELSD和HPLC-UV进行检查，其所获得的羟基积雪草苷的纯度为99.1％。

4)步骤3)中MCI柱30％甲醇洗脱液的母液回收溶剂，蒸干，残渣用甲醇溶解，滤过，置于10℃以下的环境中静置析晶，析出物用甲醇溶解，滤过，重复多次析晶，直到析出物为白色针晶状物质，滤过，结晶物用乙腈-水(20：80)的混合溶液溶解，上反相(RP-C18)中压柱层析，用乙腈-水(20：80)或乙醇-水(40：60)进行反复洗脱，得1.5g白色不定型固体C。经结构鉴定为积雪草苷B。经HPLC-ELSD和HPLC-UV进行检查，其所获得的积雪草苷B 的纯度为99.6％。

实施例2

1)取积雪草30Kg，用水提取2次，滤过后离心，上大孔树脂，用pH值为9的碱溶液1倍量柱体积进行洗涤，再加水洗至流出液呈中性，用40％的乙醇1倍柱体积进行洗脱，收集醇洗脱液，回收乙醇，浓缩，喷雾干燥，得到喷雾粉。

2)用甲醇1500ml将喷雾粉溶解，滤过，滤液静置，析出白色结晶物，滤过，母液挥去部分甲醇再重复静置析晶三次，析出物用乙酸乙酯洗涤，重复析晶三次，析出物用80％甲醇温热溶解，滤过，滤液水浴慢慢挥去甲醇，收集液面析出的白色物料，水液备用。析出物用80％甲醇反复析晶，最后得到针晶样的结晶物，干燥得到约20g的白色不定型固体A，经结构鉴定为积雪草苷。经HPLC-UV和HPLC-ELSD进行检查，其所获得的积雪草苷的纯度为98.9％。

3)析晶的母液回收溶剂和步骤2)的备用水液合并滤过，滤液上MCI树脂柱，用水洗至流出液颜色变淡，再依次用30％、60％的甲醇溶液适量进行洗脱，分段收集醇洗脱液，浓缩，干燥，用甲醇溶解，滤过，滤液静置析晶，重复多次析晶，结晶物用流动相(乙腈-水)溶解，上反相(RP-C18)中压柱层析，用乙腈-水(20：80)进行反复洗脱，得到约10g白色不定型固体B。经结构鉴定为羟基积雪草苷，经HPLC-ELSD和HPLC-UV进行检查，其所获得的羟基积雪草苷的纯度为99.1％。

4)步骤3)中MCI柱30％甲醇洗脱液的母液回收溶剂，蒸干，残渣用甲醇溶解，滤过，置于5℃的环境中静置析晶，析出物用甲醇溶解，滤过，重复多次析晶，直到析出物为白色针晶状物质，滤过，结晶物用乙腈-水(20：80)的混合溶液溶解，上反相(RP-C18)中压柱层析，用乙腈-水(20：80)进行反复洗脱，得1.5g白色不定型固体C。经结构鉴定为积雪草苷B。经HPLC-ELSD和HPLC-UV进行检查，其所获得的积雪草苷B的纯度为99.6％。

实施例3

1)取积雪草30Kg，用水提取2次，滤过后离心，上大孔树脂，用pH值为12的碱溶液8倍量柱体积进行洗涤，再加水洗至流出液呈中性，用70％的乙醇8倍柱体积进行洗脱，收集醇洗脱液，回收乙醇，浓缩，喷雾干燥，得到喷雾粉。

2)用甲醇3000ml将喷雾粉溶解，滤过，滤液静置，析出白色结晶物，滤过，母液挥去部分甲醇再重复静置析晶四次，析出物用乙酸乙酯洗涤，重复析晶三次，析出物用80％甲醇温热溶解，滤过，滤液水浴慢慢挥去乙醇，收集液面析出的白色物料，水液备用。析出物用80％甲醇反复析晶，最后得到针晶样的结晶物，干燥得到约20g的白色不定型固体A，经结构鉴定为积雪草苷。经HPLC-UV和HPLC-ELSD进行检查，其所获得的积雪草苷的纯度为99.4％。

3)析晶的母液回收溶剂和步骤2)的备用水液合并滤过，滤液上MCI树脂柱，用水洗至流出液颜色变淡，再依次用30％、60％的甲醇溶液适量进行洗脱，分段收集醇洗脱液，浓缩，干燥，用甲醇溶解，滤过，滤液静置析晶，重复多次析晶，结晶物用流动相(乙醇-水)溶解，上反相(RP-C18)中压柱层析，用乙醇-水(40：60)进行反复洗脱，得到约10g白色不定型固体B。经结构鉴定为羟基积雪草苷，经HPLC-ELSD和HPLC-UV进行检查，其所获得的羟基积雪草苷的纯度为99.1％。

4)步骤3)中MCI柱30％甲醇洗脱液的母液回收溶剂，蒸干，残渣用甲醇溶解，滤过，置于-10℃的环境中静置析晶，析出物用甲醇溶解，滤过，重复多次析晶，直到析出物为白色针晶状物质，滤过，结晶物用乙醇-水(40：60)的混合溶液溶解，上反相(RP-C18)中压柱层析，用乙醇-水(40：60)进行反复洗脱，得1.5g白色不定型固体C。经结构鉴定为积雪草苷B。经HPLC-ELSD和HPLC-UV进行检查，其所获得的积雪草苷B的纯度为99.6％。

实施例4

1)取积雪草30Kg，用水提取2次，滤过后离心，上大孔树脂，用pH值为10的碱溶液3倍量柱体积进行洗涤，再加水洗至流出液呈中性，用60％的乙醇5倍柱体积进行洗脱，收集醇洗脱液，回收乙醇，浓缩，喷雾干燥，得到喷雾粉。

2)用甲醇2000ml将喷雾粉溶解，滤过，滤液静置，析出白色结晶物，滤过，母液挥去部分甲醇再重复静置析晶四次，析出物用乙酸乙酯洗涤，重复析晶三次，析出物用60％甲醇温热溶解，滤过，滤液水浴慢慢挥去甲醇，收集液面析出的白色物料，水液备用。析出物用80％甲醇反复析晶，最后得到针晶样的结晶物，干燥得到约20g的白色不定型固体A，经结构鉴定为积雪草苷。经HPLC-UV和HPLC-ELSD进行检查，其所获得的积雪草苷的纯度为99.1％。

3)析晶的母液回收溶剂和步骤2)的备用水液合并滤过，滤液上MCI树脂柱，用水洗至流出液颜色变淡，再依次用30％、60％的甲醇溶液适量进行洗脱，分段收集醇洗脱液，浓缩，干燥，用甲醇溶解，滤过，滤液静置析晶，重复多次析晶，结晶物用流动相(甲醇-水)溶解，上反相(RP-C18)中压柱层析，用甲醇-水(40:60)进行反复洗脱，得到约10g白色不定型固体B。经结构鉴定为羟基积雪草苷，经HPLC-ELSD和HPLC-UV进行检查，其所获得的羟基积雪草苷的纯度为99.1％。

4)步骤3)中MCI柱30％甲醇洗脱液的母液回收溶剂，蒸干，残渣用甲醇溶解，滤过，置于10℃的环境中静置析晶，析出物用甲醇溶解，滤过，重复多次析晶，直到析出物为白色针晶状物质，滤过，结晶物用甲醇-水(50：50)的混合溶液溶解，上反相(RP-C18)中压柱层析，用乙腈-水(20：80)进行反复洗脱，得1.5g白色不定型固体C。经结构鉴定为积雪草苷B。经HPLC-ELSD和HPLC-UV进行检查，其所获得的积雪草苷B的纯度为99.6％。

实施例5

1)取积雪草30Kg，用水提取2次，滤过后离心，上大孔树脂，用pH值为11的碱溶液6倍量柱体积进行洗涤，再加水洗至流出液呈中性，用50％％的乙醇6倍柱体积进行洗脱，收集醇洗脱液，回收乙醇，浓缩，喷雾干燥，得到喷雾粉。

2)用甲醇2500ml将喷雾粉溶解，滤过，滤液静置，析出白色结晶物，滤过，母液挥去部分甲醇再重复静置析晶三次，析出物用乙酸乙酯洗涤，重复析晶三次，析出物用80％甲醇醇温热溶解，滤过，滤液水浴慢慢挥去甲醇醇，收集液面析出的白色物料，水液备用。析出物用80％甲醇反复析晶，最后得到针晶样的结晶物，干燥得到约20g的白色不定型固体A，经结构鉴定为积雪草苷。经HPLC-UV和HPLC-ELSD进行检查，其所获得的积雪草苷的纯度为98.7％。

3)析晶的母液回收溶剂和步骤2)的备用水液合并滤过，滤液上MCI树脂柱，用水洗至流出液颜色变淡，再依次用30％、60％的甲醇溶液适量进行洗脱，分段收集醇洗脱液，浓缩，干燥，用甲醇溶解，滤过，滤液静置析晶，重复多次析晶，结晶物用流动相(20:80甲醇-水) 溶解，上反相(RP-C18)中压柱层析，用乙醇-水(40：60)进行反复洗脱，得到约10g白色不定型固体B。经结构鉴定为羟基积雪草苷，经HPLC-ELSD和HPLC-UV进行检查，其所获得的羟基积雪草苷的纯度为99.1％。

4)步骤3)中MCI柱30％甲醇洗脱液的母液回收溶剂，蒸干，残渣用甲醇溶解，滤过，置于-5℃的环境中静置析晶，析出物用甲醇溶解，滤过，重复多次析晶，直到析出物为白色针晶状物质，滤过，结晶物用甲醇-水(50：50)的混合溶液溶解，上反相(RP-C18)中压柱层析，用乙腈-水(20：80)进行反复洗脱，得1.5g白色不定型固体C。经结构鉴定为积雪草苷B。经HPLC-ELSD和HPLC-UV进行检查，其所获得的积雪草苷B的纯度为99.6％。

试验例、成分结构鉴定

对实施例1制得的白色不定型固体A、白色不定型固体B和白色不定型固体C进行如下结构鉴定。

(一)A组分的鉴别

①红外光谱检测

供试品的制备取实施例1制备的约1mg的供试品，加入适量的KBr，压成薄片。

测定法将供试品放入红外光谱仪，在400～4000cm^-1测定。

结果与文献报道一致，见图1。

②将实施例1分离得到的A组分与中检所提供的对照品采用TLC和HPLC法进行对比

TLC法：取本品粉末，加甲醇制成每ml含10mg的溶液。取积雪草对照品加甲醇制成每 ml含1mg。照薄层色谱法试验，分别吸取供试品和对照品10ul点于同一块硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水(7：3：0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃烘至斑点显色清晰。结果供试品色谱中，与对照品相应位置处显相同颜色的斑点。

HPLC法：色谱条件与系统适用性以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(20：80)为流动相；蒸发光散射检测器和紫外检测器联用。

对照品深液的制备取本品粉末5mg，加甲醇制成每ml含1mg，即得。

供试品溶液的制备取本品粉末10mg，加甲醇制成每ml含1mg，即得。

测定法精密吸取供试品10ul，注入液相色谱仪，测定，计算，即得。

结果显示供试品与对照品的主峰保留时间一致，主峰的光谱图也一致。

综合上述试验，分离得到的A组分为积雪草苷。

(二)B组分的结构鉴定

①熔点 mp 219～221℃

②紫外吸收图谱末端吸收

图谱见图2。

③红外光谱图IR(KBr)λcm^-1：3423.6(OH)，2923.7(C-H)，1727.2(COO^-)，1633.3，1454.1，1379.6，1306.9，1271.1，1233.5，1068.9(C-O)，922.9，812.4，581.3cm^-1。

图谱见图3。

④核磁共振

¹³C NMRδ(ppm)值及文献值对照见表1。

表1、羟基积雪草苷的¹³C核磁共振化学位移值与文献值比较

1HNMRδ(ppm)值：

1HNMR(CD₃OD)δppm：0.898(d，J＝6.4Hz，3H，C19-Me)，0.963(d，J＝6.2Hz， 3H，C₂₀-Me)，1.072(s，3H，Me)，1.094(d，J＝3Hz，3H，Rha-Me)，1.260(s，3H， Me)，1.275(s，3H，Me)，1.402(s，3H，Me)，5.309(s，1H，G-1-H)，5.289(s，1H， G-1’-H)，4.851(d，J＝1.65Hz，1H，R-1-H)，4.380(d，J＝7.8Hz,2H)，4.069(dd，J＝11. 9，2Hz，1H)，3.928(ddd，1H)，3.2-4.0(Rha，Glu糖质子)，1.2-2.5(m，J＝7.8Hz，2 H))。

⑤FAB-MS(快原子轰击质谱)：975[M++1，C₄₈H₇₈O₂₀]，974[M+]，665[M+-Rha-Gl u]，504[M+-Rha-Glu-Glu]

根据以上光谱数据分析，结合与文献对照，确定从积雪草中分离纯化得到的B组分为羟基积雪草苷。

(三)C组分的结构鉴定

①熔点 mp 217～220℃

②紫外吸收图谱末端吸收

图谱见图4。

③红外光谱图IR(KBr)λcm^-1：3418.3(OH)，2935.8(C-H)，1732.2(COO^-)，1644.3 (C＝C)，1460.3，1382.4，1262.6，1238.0，1062.9(C-O)，1033.8，812.5，与相关文献报道基本一致，图谱见图5。

④质谱检查

ESI-MS2m/z：1019[M⁺²Na-H]⁺，974[M]，973[M-H]⁺，503[M-Glu-rha-H]⁺。

⑤核磁共振

¹H NMR(400MHz，pyr)δ(ppm)值：6.32(1H，d，J＝8.0Hz，-C＝CH)，5.12(12H， 4-CH₂OH)，0.98(3H，d，J＝8.0Hz)，1.29(3H，S)，1.83，1.93(6H，S)，1.99(3H， S)，2.17(3H，S)。

¹³CNMRδ(ppm)值及文献值对照见表2。

根据以上光谱数据分析，结合与文献对照，确定从积雪草中分离纯化得到的成分为积雪草苷B。

表2、积雪草苷B的¹³C核磁共振化学位移值与文献值比较

三、纯度检查

采用HPLC法进行检查，采用紫外检测器和蒸发光散射检测器联用，以峰面积百分比来定性其纯度

色谱条件与系统适用性以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(20：80)为流动相；蒸发光散射检测器和紫外检测器联用。

供试品溶液的制备取本品粉末20mg，加甲醇溶解2ml使溶解，即得。

测定法精密吸取供试品15ul，注入液相色谱仪，测定，计算，即得。

结果表明A样(积雪草苷)的纯度为99.3％，B样(羟基积雪草苷)纯度为99.07％，C样 (积雪草苷B)纯度为99.6％。

对本发明其它实施例制得的白色不定型固体A、白色不定型固体B和白色不定型固体C 也进行了如上结构鉴定，其结果与上述结果相符。

以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本发明的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许变动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。

Claims

1.一种从积雪草出发制备积雪草苷、羟基积雪草苷和积雪草苷B的方法，其特征在于：所述的方法包括如下步骤：

1)取积雪草，用水提取，过滤后离心，上大孔树脂，用pH值为9～12的碱溶液洗涤，再加水洗至流出液呈中性，用乙醇进行洗脱，收集醇洗脱液，回收乙醇，浓缩，喷雾干燥，得到喷雾粉；

2)用甲醇将喷雾粉溶解，过滤，滤液静置，析出白色结晶物，过滤，母液挥去部分甲醇再重复静置析晶，析出物用乙酸乙酯洗涤，重复析晶，析出物用甲醇温热溶解，过滤，滤液水浴挥去甲醇，收集液面析出的白色物料，水液备用；析出物用甲醇反复析晶，最后得到结晶物，干燥得到白色不定型固体A，经结构鉴定为积雪草苷；

3)析晶的母液回收溶剂和步骤2)备用的水液合并过滤，滤液上MCI树脂柱，用水洗至流出液颜色变淡，再依次用30％、60％的甲醇溶液适量进行洗脱，分段收集醇洗脱液，蒸干，浓缩，用甲醇溶解，过滤，滤液静置析晶，重复多次析晶，结晶物用流动相溶解，上反相中压柱层析，用乙腈-水或乙醇-水或甲醇-水进行反复洗脱，得到白色不定型固体B，经结构鉴定为羟基积雪草苷；

4)步骤3)中MCI树脂柱30％甲醇洗脱液的母液回收溶剂，蒸干，残渣用甲醇溶解，过滤，静置析晶，析出物用甲醇溶解，过滤，重复多次析晶，直到析出物为白色针晶状物质，过滤，结晶物用混合溶液溶解，上反相中压柱层析，用乙腈-水或乙醇-水进行反复洗脱，得白色不定型固体C，经结构鉴定为积雪草苷B。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的碱溶液的用量为1～8倍量柱体积。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的碱溶液的用量为1～3倍量柱体积。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的碱溶液的用量为1.5倍量柱体积。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的大孔树脂为非极性或弱极性大孔树脂。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的非极性或弱极性大孔树脂为D-101型大孔树脂、AB-8型大孔树脂或HPD-100型大孔树脂。

7.根据权利要求1-6任意一项所述的方法，其特征在于，步骤4)中，所述的静置析晶为置于温度10℃以下的环境中静置析晶。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的静置析晶为置于温度-10～10℃的环境中静置析晶。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的静置析晶为置于温度-5～5℃的环境中静置析晶。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述的用乙醇洗脱为用40％～80％的乙醇1～8倍柱体积进行洗脱。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤2)中，用于温热溶解的甲醇为60～80％甲醇，用于反复析晶的甲醇为80％甲醇。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，步骤3)中，

所述的流动相为乙腈-水或乙醇-水或甲醇-水；

所述的反复洗脱用的乙腈-水、乙醇-水或甲醇-水为体积比20:80的乙腈-水、体积比40:60的乙醇-水或体积比40:60的甲醇-水。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，步骤4)中，所述的混合溶液为乙腈-水、乙醇-水或甲醇-水的混合溶液。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述的混合溶液为体积比20：80的乙腈-水、体积比40：60的乙醇-水或体积比50：50的甲醇-水的混合溶液。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，步骤4)中，反复洗脱用的乙腈-水或乙醇-水为体积比20:80的乙腈-水或体积比为40:60的乙醇-水。