CN111377933B - 诸葛菜种子提取的生物碱类化合物及其提取方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种诸葛菜种子提取的生物碱类化合物及其提取方法与应用。该生物碱类化合物是从诸葛菜的种子中提取得到，化学结构式如式(1)所示：

Description

诸葛菜种子提取的生物碱类化合物及其提取方法与应用

技术领域

本发明涉及天然药物化学技术领域，特别是涉及一种从诸葛菜种子中提取出的生物碱类化合物及其提取方法与应用。

背景技术

诸葛菜(Orychophragmus violaceus(L.)O.E.Schulz)是十字花科(Brassicaceae)诸葛菜属植物，一年生或越年生草本植物，主要分布在亚洲中部及东部，在我国分布广泛，别名二月兰。诸葛菜作为一种历史悠久的民间用药，具有抑制肿瘤、抗菌消炎、保护肝脏等生理活性。祖国医学对其药性疗效自古就有记载：“性温、味辛、苦、甘，入胃经”。《药性论》中论述到该植物具有温脾开胃、消食、下气及利小便等功效。

现代临床试验证实，诸葛菜可治疗黄疸、乳痈、热毒风肿、疱痈疥肿等病症，且效果甚佳，此外，诸葛菜还有抑菌作用，对多种病菌，如细菌、真菌及寄生虫等均具有抑制作用。国内外对诸葛菜已有的研究报道表明，诸葛菜种子中含有多种生物活性成分，包括生物碱类、黄酮类、酚酸类、三萜皂苷、挥发油、多糖、氨基酸等，具有多种药理活性，包括抗氧化、抗肿瘤、抗急性肝损伤以及细胞保护作用等。其中生物碱类是诸葛菜种子中一大类活性成分，目前已报道的已经确定化学结构的生物碱类成分有Orychophragines A-C(见式Ⅰ中的化合物A、B、C)，Orychophragmuspine A-I(见式Ⅰ中的化合物1-9)。

目前从诸葛菜种子中分离出来的化合物大多数是已知的，且结构系统性较低(结构系统性是指一种植物中每一类化合物都不仅仅只有几个，而是应该呈现系统性，数目多，系统性低是指每一类成分都只有几个，不成系统)。说明该植物中大量的化合物还未得到分离和鉴定，反映出该植物还未得到充分的开发和利用，因此对诸葛菜中新化合物的分离和开发是亟需的。

目前有从诸葛菜中提取生物碱的报道，如公开号为CN 108261435A的发明专利申请公开了一种诸葛菜生物碱类提取物及其在制备保肝制品中的应用，提取对象为诸葛菜全草，分离得到的生物碱类骨架类型为环肽类生物碱，提取工艺为先用0-60％乙醇回流提取，然后通过大孔吸附树脂进行粗分离，即得到所述生物碱类成分，是混合物，不是纯净的化合物。

发明内容

本发明的目的，第一方面，是提供一种从诸葛菜种子中提取出的生物碱类化合物，是从诸葛菜的种子中提取得到，分子式为C₁₆H₁₈O₄N₆，命名为诸葛菜碱D，化学结构式如式(1)所示：

进一步，还包括式(1)所示生物碱类化合物其衍生物和其药学上可接受的盐。

其提取过程包括依次进行的乙醇水回流提取、正丁醇萃取、层析和半制备高效液相色谱等；优选的，所述层析为依次进行的硅胶柱层析、ODS柱层析和Sephadex LH-20层析。

所述Sephadex LH-20层析中使用三氯甲烷、乙酸乙酯和甲醇的溶剂系统进行洗脱；进一步的，三氯甲烷：乙酸乙酯：甲醇的体积比为(1-5)：(1-5)：(1-5)，优选(1-3)：(1-3)：(1-3)，更优选(1-2)：(1-2)：(1-2)，更优选1︰1︰1。

所述乙醇水回流提取具体为：取干燥的诸葛菜种子(含水量1-10％，优选3-8％，更优选4-6％，最优选5％)，采用乙醇水混合溶剂(其中乙醇和水的体积比为(1-10)：(1-10)，优选(3-9)：(1-7)，更优选(5-8)：(2-5)，最优选70︰30)在65-90℃(优选70-85℃，更优选75-80℃，最优选78℃)下回流提取0.5-5h(优选1-4h，更优选1.5-3h，最优选2h)，减压浓缩至无乙醇，放至室温，得回流提取液备用；种子与混合溶剂的加入质量比为(1-6)：(1-6)，优选(1-4)：(2-6)，更优选(1-2)：(4-6)，最优选1︰6)。

所述正丁醇萃取具体为：将乙醇水回流提取得到的回流提取液用正丁醇反复萃取(回流提取液与正丁醇的混合比例为(1-5)：(1-5)，优选(1-3)：(1-3)，更优选(1-2)：(1-2)，最优选1︰1，一般萃取5-8次)，减压回收正丁醇至压力为-0.1MPa、50℃下没有正丁醇产出，得到正丁醇萃取物。

所述硅胶柱层析具体为：将正丁醇萃取得到的正丁醇萃取物经硅胶柱层析，依次用三氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到若干洗脱部位，经薄层色谱检测，乙醇-浓硫酸加热显色，合并薄层色谱中显色比移值相同的洗脱部位，将合并后的洗脱部位经减压浓缩，得到一次柱层析分离物。

所述ODS柱层析具体为：将硅胶柱层析得到的一次柱层析分离物经ODS(十八烷基硅烷键合硅胶)柱层析分离，采用甲醇-水梯度洗脱，得到若干洗脱部位，经薄层色谱检测，乙醇-浓硫酸加热显色，合并薄层色谱中显色比移值相同的洗脱部位，将合并后的洗脱部位经减压浓缩，得到二次柱层析分离物。

所述Sephadex LH-20层析具体为：将ODS柱层析得到的二次柱层析分离物经Sephadex LH-20(羟丙基葡聚糖凝胶)层析，采用三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇(体积比为(1-5)：(1-5)：(1-5)，优选(1-3)：(1-3)：(1-3)，更优选(1-2)：(1-2)：(1-2)，更优选1︰1︰1)溶剂系统洗脱，得到若干洗脱部位，经薄层色谱检测，乙醇-浓硫酸加热显色，合并薄层色谱中显色比移值相同的洗脱部位，将合并后的洗脱部位经减压浓缩，得到三次柱层析分离物。

所述半制备高效液相色谱具体为：将Sephadex LH-20层析得到的三次柱层析分离物进行半制备高效液相色谱分离，以甲醇-水作为流动相进行洗脱，收集电脑显示器显示出峰时的洗脱液，经减压浓缩，得到所述生物类碱化合物，所述生物碱类化合物为黄色粉末。

第二方面，提供一种上述生物碱类化合物的提取方法，包括依次进行的乙醇水回流提取、正丁醇萃取、层析和半制备高效液相色谱等；优选的，所述层析为依次进行的硅胶柱层析、ODS柱层析和Sephadex LH-20层析；更优选的，所述Sephadex LH-20层析中使用三氯甲烷、乙酸乙酯和甲醇的溶剂系统进行洗脱；

其中，三氯甲烷：乙酸乙酯：甲醇的体积比为(1-5)：(1-5)：(1-5)，优选(1-3)：(1-3)：(1-3)，更优选(1-2)：(1-2)：(1-2)，更优选1︰1︰1。

所述乙醇水回流提取具体为：取干燥的诸葛菜种子(含水量1-10％，优选3-8％，更优选4-6％，最优选5％)，采用乙醇水混合溶剂(其中乙醇和水的体积比为(1-10)：(1-10)，优选(3-9)：(1-7)，更优选(5-8)：(2-5)，最优选70︰30)在65-90℃(优选70-85℃，更优选75-80℃，最优选78℃)下回流提取0.5-5h(优选1-4h，更优选1.5-3h，最优选2h)，减压浓缩至无乙醇，放至室温，得回流提取液备用；种子与混合溶剂的加入质量比为(1-6)：(1-6)，优选(1-4)：(2-6)，更优选(1-2)：(4-6)，最优选1︰6)。

所述正丁醇萃取具体为：将乙醇水回流提取得到的回流提取液用正丁醇反复萃取(回流提取液与正丁醇的混合比例为(1-5)：(1-5)，优选(1-3)：(1-3)，更优选(1-2)：(1-2)，最优选1︰1，一般萃取5-8次)，减压回收正丁醇至压力为-0.1MPa、50℃下没有正丁醇产出，得到正丁醇萃取物。

所述硅胶柱层析具体为：将正丁醇萃取得到的正丁醇萃取物经硅胶柱层析，依次用三氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到若干洗脱部位，经薄层色谱检测，乙醇-浓硫酸加热显色，合并薄层色谱中显色比移值相同的洗脱部位，将合并后的洗脱部位经减压浓缩，得到一次柱层析分离物。

所述ODS柱层析具体为：将硅胶柱层析得到的一次柱层析分离物经ODS(十八烷基硅烷键合硅胶)柱层析分离，采用甲醇-水梯度洗脱，得到若干洗脱部位，经薄层色谱检测，乙醇-浓硫酸加热显色，合并薄层色谱中显色比移值相同的洗脱部位，将合并后的洗脱部位经减压浓缩，得到二次柱层析分离物。

所述Sephadex LH-20层析具体为：将ODS柱层析得到的二次柱层析分离物经Sephadex LH-20(羟丙基葡聚糖凝胶)层析，采用三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇(体积比为(1-5)：(1-5)：(1-5)，优选(1-3)：(1-3)：(1-3)，更优选(1-2)：(1-2)：(1-2)，更优选1︰1︰1)溶剂系统洗脱，得到若干洗脱部位，经薄层色谱检测，乙醇-浓硫酸加热显色，合并薄层色谱中显色比移值相同的洗脱部位，将合并后的洗脱部位经减压浓缩，得到三次柱层析分离物。

所述半制备高效液相色谱具体为：将Sephadex LH-20层析得到的三次柱层析分离物进行半制备高效液相色谱分离，以甲醇-水作为流动相进行洗脱，收集电脑显示器显示出峰时的洗脱液，经减压浓缩，得到所述生物类碱化合物，所述生物碱类化合物为黄色粉末。

第三方面，提供上述生物碱类化合物或上述提取方法得到的生物类碱化合物在制备保肝护肝药物中的应用。

所述保肝护肝具体为治疗化学性肝损伤，尤其是药物性肝损伤。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供了来源于诸葛菜种子中的一种新的生物碱类化合物，并针对该新化合物提供了提取方法，本发明的提取方法中依次采用乙醇水回流提取、正丁醇萃取、硅胶柱层析、ODS柱层析、Sephadex LH-20层析及半制备高效液相色谱等方法进行提取与分离纯化，成功提取分离出一种新的生物碱类化合物，该方法操作步骤仅为六步，操作方法简便及快速，提取分离过程主要采用乙醇水提取及正丁醇萃取，工艺方法环保，且经该方法分离得到的化合物纯度大于98％。此外经研究表明该化合物具有良好的保肝护肝作用，因此本发明提供一种生物碱类化合物及其盐和衍生物可以作为其他化合物合成先导物，以及新药开发和药理活性研究的原料，亦可用于制备保肝护肝的药物。

附图说明

图1为本发明生物碱类化合物诸葛菜碱D的¹H-NMR光谱图；

图2为本发明生物碱类化合物诸葛菜碱D的¹³C-NMR光谱图；

图3为本发明生物碱类化合物诸葛菜碱D的核磁共振¹H-¹HCOSY光谱图；

图4为本发明生物碱类化合物诸葛菜碱D的核磁共振HSQC光谱图；

图5为本发明生物碱类化合物诸葛菜碱D的核磁共振HMBC光谱图；

图6为本发明生物碱类化合物诸葛菜碱D的核磁共振NOESY光谱图；

图7为本发明生物碱类化合物诸葛菜碱D的红外光谱图；

图8为本发明生物碱类化合物诸葛菜碱D的高分辨质谱图；

图9为本发明生物碱类化合物诸葛菜碱D的X射线-单晶衍射ORTEP图。

具体实施方式

本发明提供诸葛菜种子中提取出的一种生物碱类化合物，及其提取方法与应用。该生物碱类化合物的提取方法和药理活性研究未见有论文期刊报道。

虽然公开号为CN 108261435A的发明专利申请公开了一种诸葛菜生物碱类提取物及其在制备保肝制品中的应用，但是该生物碱类提取物为环肽类生物碱，与本发明的化合物相似度较低，此外，本发明的提取对象为诸葛菜干燥种子，提取工艺为醇和水提取，然后通过硅胶柱色谱等方法进行分离，得到的生物碱为纯净的化合物。两者所使用的溶剂极性相差较大，提取出来的化合物种类也就不尽相同，本发明的化合物水溶性不好(培养单晶时用体积比为甲醇丙酮水4︰1︰1作溶剂，最终该化合物在水中析出晶体)，因此公开号为CN108261435A的发明专利申请中所提取到的生物碱中应该不包含本发明化合物。

本发明提供一种生物碱类化合物，分子式为C₁₆H₁₈O₄N₆，命名为诸葛菜碱D，化学结构式见式(1)，¹H-NMR与¹³C-NMR核磁数据见表1：

表1本发明生物碱类化合物诸葛菜碱D的¹H-NMR与¹³C-NMR核磁数据(DMSO-d₆)

本发明还提供一种上述生物碱类化合物的提取方法，具体包括以下步骤：

步骤1、取干燥的诸葛菜种子(含水量1-10％，优选3-8％，更优选4-6％，最优选5％)，采用乙醇水混合溶剂(乙醇和水的体积为(1-10)：(1-10)，优选(3-9)：(1-7)，更优选(5-8)：(2-5)，最优选7︰3)在65-90℃(优选70-85℃，更优选75-80℃，最优选78℃)下回流提取0.5-5h(优选1-4h，更优选1.5-3h，最优选2h)，减压浓缩(压力-0.1MPa，浓缩至无乙醇味)，放至室温，得回流提取液备用；种子与混合溶剂的加入比例是质量比(1-6)：(1-6)，优选(1-4)：(2-6)，更优选(1-2)：(4-6)，最优选1︰6)；

步骤2、将乙醇水回流提取得到的回流提取液用正丁醇反复萃取(回流提取液与正丁醇的混合比例为(1-5)：(1-5)，优选(1-3)：(1-3)，更优选(1-2)：(1-2)，最优选1︰1，一般萃取5-8次)，减压回收正丁醇至压力为-0.1MPa、50℃下没有正丁醇馏分产出，得到正丁醇萃取物；

步骤3、将步骤2得到的正丁醇萃取物经硅胶柱层析，依次用三氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到若干洗脱部位，经薄层色谱检测，乙醇-浓硫酸加热显色，合并薄层色谱中显色比移值相同的洗脱部位，将合并后的洗脱部位经减压浓缩，得到一次柱层析分离物备用；

步骤4、将步骤3中所得的一次柱层析分离物经ODS(十八烷基硅烷键合硅胶)柱层析分离，采用甲醇-水梯度洗脱，得到若干洗脱部位，经薄层色谱检测，乙醇-浓硫酸加热显色，合并薄层色谱中显色比移值相同的洗脱部位，将合并后的洗脱部位经减压浓缩，得到二次柱层析分离物备用；

步骤5、将步骤4中所得的二次柱层析分离物经Sephadex LH-20(羟丙基葡聚糖凝胶)层析分离，采用三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇(体积比为(1-5)：(1-5)：(1-5)，优选(1-3)：(1-3)：(1-3)，更优选(1-2)：(1-2)：(1-2)，更优选1︰1︰1)溶剂系统洗脱，得到若干洗脱部位，经薄层色谱检测，乙醇-浓硫酸加热显色，合并薄层色谱中显色比移值相同的洗脱部位，将合并后的洗脱部位经减压浓缩，得到三次柱层析分离物

步骤6、将步骤5中所得的三次柱层析分离物进行半制备高效液相色谱分离，以甲醇-水作为流动相进行洗脱，收集电脑显示器显示出峰时的洗脱液，经减压浓缩，得到本发明生物类碱化合物，所述生物碱类化合物为黄色粉末。

按照上述方法得到的本发明生物碱类化合物诸葛菜碱D的结构鉴定与推导。

黄色无定型粉末，mp296.0～298.0℃，易溶于甲醇、丙酮、二甲亚砜，微溶于乙醇、水，比旋光度[α]D＝-12.0(c＝0.1，MeOH)。薄层硅胶板在紫外254nm下有暗斑，碘显色为棕黄色，乙醇-浓硫酸加热不显色。紫外光谱在295nm处有最大吸收。红外光谱(见图7)显示：3424cm^-1为N-H吸收峰；1696cm^-1为羰基吸收峰；1623cm^-1，1523cm^-1，1283cm^-1，1166cm^-1，779cm^-1。由HR-ESI-MS(高分辨质谱图)，见图8，m/z:393.1071[M+Cl]^-确定分子式为C₁₆H₁₈O₄N₆(C₁₆H₁₈O₄N₆Cl计算值为393.1078)，不饱和度Ω＝11。

¹H-NMR(DMSO-d₆,400MHz)谱(见图1)中δ_H 3.08(3H,s,14-CH₃)，3.74(3H,s,8'-CH₃)为两个甲基氢信号；δ_H 7.78(1H,d,J＝1.7Hz,2a-NH)，7.54(1H,d,J＝1.7Hz,2b-NH)，6.75(1H,t,J＝6.0Hz,12-NH)为三个连在氮原子上的氢信号；δ_H 7.65(2H,d,J＝8.8Hz,H-3′,5′)，6.61(2H,d,J＝8.8Hz,H-2′,6′)为四个典型的AA'BB'类型的芳香氢信号，推测化合物结构中含有一个对位取代的苯环结构。¹³C-NMR(DMSO-d₆,100MHz)谱(见图2)中除了与上述结构片段对应的碳原子外，还有5个低场碳信号：δ_C 166.30(C-7')，165.89(C-4)，155.35(C-9)，154.01(C-10)，153.66(C-2)。¹H–¹H COSY谱(¹H-¹H Correlated Spectrometry，氢氢化学位移相关谱)和NOESY谱(Nuclear Overhauser Effect Correlation Spectrometry，核欧沃豪斯效应谱)中，分别见图3和图6，由H-6、H-7、H-11、H-12依次两两相关，结合HMBC谱(Heteronuclear Multiple Bond Coherence，异核多键相关谱)(见图4)中H-11与C-6、C-7、C-1′远程相关，12-NH与C-2′,6′远程相关，可以推断出结构中C-11与苯环结构通过N-12相连。HMBC谱中，14-CH₃与C-7，C-9远程相关提示C-14连接在N-8位置；13-NH与C-2远程相关，推断13-NH₂连接在C-2位置；H-6与C-10远程相关，H-7与C-9远程相关，结合分子不饱和度，推测剩余结构组成两个环状结构。

由于分子中C-7位为手性碳，为了进一步确定该化合物的绝对构型，对其培养单晶，通过X射线-单晶衍射的方法(107.65K，Cu靶，CCDC序列号：1814448)确定了该化合物的绝对构型为7S[Flack parameter值：0.06(18)]，见图9。综合以上图谱结合HSQC图谱(Heteronuclear Single-Quantum Coherence，异核单量子相关谱)，见图5，将该化合物的碳氢信号进行归属，见表1。经文献检索，未发现有对该化合物的报道，确定化合物为新化合物，命名为诸葛菜碱D。

以下结合具体实施例，更具体地说明本发明的内容，并对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝非对本发明进行限制。

实施例一：

步骤1：称取干燥的诸葛菜种子40kg，含水量5％，采用乙醇水(乙醇：水(体积比)＝7:3)混合溶剂240kg在78℃回流提取，回流提取3次，每次2h，减压回收乙醇，放至室温，得回流提取液备用。

步骤2：向步骤1得到的回流提取液中加入等体积的正丁醇反复萃取7次，减压回收正丁醇至浸膏，得到正丁醇萃取物。

步骤3：将步骤2得到的正丁醇萃取物经柱层析硅胶柱分离，其中硅胶为200-300目，依次采用三氯甲烷-甲醇梯度洗脱(梯度为100︰0，50︰1，20︰1，10︰1，5︰1，1︰1)，每个梯度冲10个柱体积；经薄层色谱检测，乙醇-浓硫酸加热显色，合并色谱行为及显色相同的洗脱部位，将三氯甲烷-甲醇10︰1洗脱部位减压浓缩至干，得到一次柱层析分离物备用。

步骤4：将步骤3中所得的一次柱层析分离物经ODS柱分离，其中十八烷基硅烷键合硅胶填料粒度为20～40μm，常压室温采用甲醇-水梯度洗脱(梯度为20︰80，50︰50，80︰20和100︰0)，经薄层色谱检测，乙醇-浓硫酸加热显色，合并色谱行为及显色相同的洗脱部位，50％甲醇部分减压浓缩至干，得到二次柱层析分离物备用。

步骤5：将步骤4中所得的二次柱层析分离物经Sephadex LH-20(羟丙基葡聚糖凝胶)层析分离，采用5000ml三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇(体积比为1︰1︰1)溶剂系统等度洗脱，洗脱得50瓶，每瓶100mL。经薄层色谱检测，乙醇-浓硫酸加热显色，合并色谱行为及显色相同的洗脱部位，得到8个部位，经薄层色谱进行检测，将7部位合并，减压浓缩至干，得到三次柱层析分离物备用。

步骤6：将步骤5中所得的三次柱层析分离物进行半制备高效液相色谱分离，以甲醇-水溶液(40/60，v/v)作为流动相，流速为8ml/min，检测波长为295nm，经减压浓缩，得到黄色粉末。

经以上方法确证，该黄色粉末为本发明的生物碱类化合物诸葛碱D，归一法测定纯度高于98％。

以下实施例均得到黄色粉末状产品，同样经以上方法确证，为本发明的生物碱类化合物诸葛碱D。

实施例二：

步骤1-步骤4、步骤6：同实施例一。

步骤5：同实施例一，仅三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇的体积比为1︰5︰5。

归一法测定纯度高于98％。

实施例三：

步骤1-步骤4、步骤6：同实施例一。

步骤5：同实施例一，仅三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇的体积比为1︰1︰3。

归一法测定纯度高于98％。

实施例四：

步骤1-步骤4、步骤6：同实施例一。

步骤5：同实施例一，仅三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇的体积比为2︰1︰2。

归一法测定纯度高于98％。

实施例五：

步骤1：称取干燥的诸葛菜种子40kg，含水量1％，采用乙醇水(乙醇：水(体积比)＝1:10)混合溶剂40kg在65℃回流提取，回流提取3次，每次0.5h，减压回收乙醇，放至室温，得回流提取液备用。

步骤2：同实施例一，仅是步骤1得到的回流提取液与正丁醇的体积比为2:1，萃取7次。

步骤3-步骤6：同实施例一。

归一法测定纯度高于98％。

实施例六：

步骤1：称取干燥的诸葛菜种子40kg，含水量10％，采用乙醇水(乙醇：水(体积比)＝10:1)混合溶剂7kg在90℃回流提取，回流提取3次，每次5h，减压回收乙醇，放至室温，得回流提取液备用。

步骤2：同实施例一，仅是步骤1得到的回流提取液与正丁醇的体积比为1:5，萃取5次。

步骤3-步骤6：同实施例一。

归一法测定纯度高于98％。

实施例七：

步骤1：称取干燥的诸葛菜种子40kg，含水量3％，采用乙醇水(乙醇：水(体积比)＝9:1)混合溶剂80kg在70℃回流提取，回流提取3次，每次1h，减压回收乙醇，放至室温，得回流提取液备用。

步骤2：同实施例一，仅是步骤1得到的回流提取液与正丁醇的体积比为5:1，萃取8次。

步骤3-步骤6：同实施例一。

归一法测定纯度高于98％。

实施例八：

步骤1：称取干燥的诸葛菜种子40kg，含水量8％，采用乙醇水(乙醇：水(体积比)＝3:7)混合溶剂60kg在85℃回流提取，回流提取3次，每次4h，减压回收乙醇，放至室温，得回流提取液备用。

步骤2：同实施例一，仅是步骤1得到的回流提取液与正丁醇的体积比为1:2，萃取7次。

步骤3-步骤6：同实施例一。

归一法测定纯度高于98％。

实施例九：

步骤1：称取干燥的诸葛菜种子40kg，含水量4％，采用乙醇水(乙醇：水(体积比)＝5:2)混合溶剂160kg在75℃回流提取，回流提取3次，每次3h，减压回收乙醇，放至室温，得回流提取液备用。

步骤2：同实施例一，仅是步骤1得到的回流提取液与正丁醇的体积比为3:1，萃取6次。

步骤3-步骤6：同实施例一。

归一法测定纯度高于98％。

实施例十：

步骤1：称取干燥的诸葛菜种子40kg，含水量6％，采用乙醇水(乙醇：水(体积比)＝8:5)混合溶剂120kg在80℃回流提取，回流提取3次，每次1.5h，减压回收乙醇，放至室温，得回流提取液备用。

步骤2：同实施例一，仅是步骤1得到的回流提取液与正丁醇的体积比为1:3，萃取6次。

步骤3-步骤6：同实施例一。

归一法测定纯度高于98％。

比较例一：

步骤1-步骤4、步骤6：同实施例一。

步骤5：同实施例一，仅三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇的体积比为1︰1︰7。

归一法测定纯度为85％。

比较例二：

步骤1-步骤4、步骤6：同实施例一。

步骤5：同实施例一，仅三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇的体积比为7︰1︰7。

归一法测定纯度为80％。

比较例三：

步骤1-步骤4、步骤6：同实施例一。

步骤5：同实施例一，仅三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇的体积比为7︰1︰1。

归一法测定纯度为75％。

实验一：保肝护肝作用

1、主要材料

1.1、药品和试剂：实施例一至实施例十的生物碱类化合物，纯度为98～99％，精密称取，用DMSO溶解至下述各剂量组所需的浓度；双环醇和D-氨基半乳糖盐酸盐均购自上海源叶生物科技有限公司。RPMI-1640培养基：购自美国Gibco公司；胎牛血清、胰蛋白酶：购自美国Sigma公司；青霉素：山东新华制药有限责任公司；链霉素：华北制药有限责任公司；四甲基偶氮唑盐(MTT)：美国Sigma公司；二甲亚砜：美国Sigma公司。

1.2、细胞株：人正常肝细胞LO2(美国ATCC细胞库)。

1.3、分组：空白对照组、阴性对照组、阳性对照组和实验组。

2、实验方法

2.1、细胞培养，RPMI-1640培养基，加入l0％的胎牛血清，l％抗生素(100U/mL青霉素和100U/mL链霉素)，置于5％CO₂培养箱37℃条件下培养。

2.2、MTT比色法测定细胞活力，上述三组分别取对数生长期LO2细胞接种于96孔培养板中，细胞密度为5×10⁴个/mL，每孔100μL，置于5％CO₂培养箱37℃条件下恒温培养12h。阴性对照组、阳性对照组和实验组每孔加入10μL含D-氨基半乳糖盐酸盐的RPMI-1640培养液(终浓度为10mM)，空白对照组每孔加入10μL的RPMI-1640培养液；10min后，实验组加入不同浓度的本发明生物碱类化合物1μL(每孔终浓度分别为50μM,25μM,12.5μM 6.25μM和3.125μM)，空白对照组和阴性对照组每孔中加入1μL的DMSO溶液，阳性对照组每孔加入1μL的双环醇溶液(每孔终浓度为50μM)，每组设3个复孔，考察加入药物后对细胞的影响。继续培养24h，每孔加入5mg/mL MTT溶液10μL，继续恒温培养4h，弃去培养液，每孔加入100μLDMSO，混合均匀后，用酶标仪在540nm处测定每孔吸光值，测得的光密度值反映细胞活性和数量多少，以空白孔吸光值为存活率100％，计算各实验组、阳性对照组及阴性对照组的细胞相对存活率。独立重复实验三次。

3、实验结果。

以实施例一的化合物为例，实验结果见表2。

表2本发明生物碱类化合物对D-氨基半乳糖盐酸盐致肝细胞损伤的保护作用

实验结果表明本发明生物碱类化合物对D-氨基半乳糖盐酸盐致肝细胞损伤具有较好的保护作用，实验组均与阴性对照组具有显著性差异。与阳性对照组相比，在浓度相同的前提下(50μM)，本发明的化合物对D-氨基半乳糖盐酸盐致肝细胞损伤具有更好的保护作用，比阳性对照组有更显著的保护作用。

其它实施例的生物碱类化合物也有类似效果，在此不一一赘述。

综上所述，本发明提供特殊化合物及其提取分离方法，依次采用乙醇回流提取、正丁醇萃取、硅胶柱层析、ODS层析、Sephadex LH-20层析及半制备高效液相色谱，成功的分离得到一种新化合物，该方法简便，快速，环保，且经该方法分离得到的化合物纯度较高，由于所得化合物化学结构独特，从传统药用植物诸葛菜种子中提取出来，具有保肝护肝作用，因此本发明特殊化合物及其盐和衍生物可以作为天然产物开发中药新药，具有广阔的前景。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的内容。

Claims (41)

1.一种诸葛菜种子提取的生物碱类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述生物碱类化合物的化学结构式如式(1)所示：

2.一种权利要求1所述生物碱类化合物的提取方法，其特征在于，包括依次进行的乙醇水回流提取、正丁醇萃取、层析和半制备高效液相色谱。

3.根据权利要求2所述提取方法，其特征在于，所述层析为依次进行的硅胶柱层析、ODS柱层析和Sephadex LH-20层析。

4.根据权利要求3所述提取方法，其特征在于，所述Sephadex LH-20层析中使用三氯甲烷、乙酸乙酯和甲醇的溶剂系统进行洗脱；

其中，三氯甲烷：乙酸乙酯：甲醇的体积比为(1-5)：(1-5)：(1-5)。

5.根据权利要求4所述提取方法，其特征在于，三氯甲烷：乙酸乙酯：甲醇的体积比为(1-3)：(1-3)：(1-3)。

6.根据权利要求4所述提取方法，其特征在于，三氯甲烷：乙酸乙酯：甲醇的体积比为(1-2)：(1-2)：(1-2)。

7.根据权利要求4所述提取方法，其特征在于，三氯甲烷：乙酸乙酯：甲醇的体积比为1︰1︰1。

8.根据权利要求2-7任一所述提取方法，其特征在于，所述乙醇水回流提取具体为：取干燥的含水量为1-10％的诸葛菜种子，采用乙醇水混合溶剂在65-90℃下回流提取0.5-5h，减压浓缩至无乙醇，得回流提取液备用；种子与乙醇水混合溶剂的加入质量比为(1-6)：(1-6)。

9.根据权利要求8所述提取方法，其特征在于，所述诸葛菜种子的含水量为3-8％。

10.根据权利要求8所述提取方法，其特征在于，所述诸葛菜种子的含水量为4-6％。

11.根据权利要求8所述提取方法，其特征在于，所述诸葛菜种子的含水量为5％。

12.根据权利要求8所述提取方法，其特征在于，所述乙醇水混合溶剂中乙醇和水的体积比为(1-10)：(1-10)。

13.根据权利要求8所述提取方法，其特征在于，所述乙醇水混合溶剂中乙醇和水的体积比为(3-9)：(1-7)。

14.根据权利要求8所述提取方法，其特征在于，所述乙醇水混合溶剂中乙醇和水的体积比为(5-8)：(2-5)。

15.根据权利要求8所述提取方法，其特征在于，所述乙醇水混合溶剂中乙醇和水的体积比为70︰30。

16.根据权利要求8所述提取方法，其特征在于，所述回流提取温度为70-85℃。

17.根据权利要求8所述提取方法，其特征在于，所述回流提取温度为75-80℃。

18.根据权利要求8所述提取方法，其特征在于，所述回流提取温度为78℃。

19.根据权利要求8所述提取方法，其特征在于，所述回流提取时间为1-4h。

20.根据权利要求8所述提取方法，其特征在于，所述回流提取时间为1.5-3h。

21.根据权利要求8所述提取方法，其特征在于，所述回流提取时间为2h。

22.根据权利要求8所述提取方法，其特征在于，所述种子与乙醇水混合溶剂的加入质量比为(1-4)：(2-6)。

23.根据权利要求8所述提取方法，其特征在于，所述种子与乙醇水混合溶剂的加入质量比为(1-2)：(4-6)。

24.根据权利要求8所述提取方法，其特征在于，所述种子与乙醇水混合溶剂的加入质量比为1︰6。

25.根据权利要求2-7任一所述提取方法，其特征在于，所述正丁醇萃取具体为：将乙醇水回流提取得到的回流提取液用正丁醇反复萃取，减压回收正丁醇至压力为-0.1MPa、50℃下没有正丁醇产出，得到正丁醇萃取物。

26.根据权利要求25所述提取方法，其特征在于，所述萃取进行5-8次。

27.根据权利要求26所述提取方法，其特征在于，所述回流提取液与正丁醇的混合比例为(1-5)：(1-5)。

28.根据权利要求26所述提取方法，其特征在于，所述回流提取液与正丁醇的混合比例为(1-3)：(1-3)。

29.根据权利要求26所述提取方法，其特征在于，所述回流提取液与正丁醇的混合比例为(1-2)：(1-2)。

30.根据权利要求26所述提取方法，其特征在于，所述回流提取液与正丁醇的混合比例为1︰1。

31.根据权利要求3-7任一所述提取方法，其特征在于，所述硅胶柱层析具体为：将正丁醇萃取得到的正丁醇萃取物经硅胶柱层析，依次用三氯甲烷和甲醇梯度洗脱，薄层色谱检测，乙醇和浓硫酸加热显色，收集显色部位，减压浓缩，得到一次柱层析分离物。

32.根据权利要求3-7任一所述提取方法，其特征在于，所述ODS柱层析具体为：将硅胶柱层析得到的一次柱层析分离物经ODS十八烷基硅烷键合硅胶柱层析分离，采用甲醇和水梯度洗脱，薄层色谱检测，乙醇和浓硫酸加热显色，收集显色部位，减压浓缩，得到二次柱层析分离物。

33.根据权利要求31所述提取方法，其特征在于，所述ODS柱层析具体为：将硅胶柱层析得到的一次柱层析分离物经ODS十八烷基硅烷键合硅胶柱层析分离，采用甲醇和水梯度洗脱，薄层色谱检测，乙醇和浓硫酸加热显色，收集显色部位，减压浓缩，得到二次柱层析分离物。

34.根据权利要求3-7任一所述提取方法，其特征在于，所述Sephadex LH-20层析具体为：将ODS柱层析得到的二次柱层析分离物经Sephadex LH-20羟丙基葡聚糖凝胶层析，采用三氯甲烷、乙酸乙酯和甲醇的溶剂系统洗脱，薄层色谱检测，乙醇和浓硫酸加热显色，收集显色部位，减压浓缩，得到三次柱层析分离物。

35.根据权利要求31所述提取方法，其特征在于，所述Sephadex LH-20层析具体为：将ODS柱层析得到的二次柱层析分离物经Sephadex LH-20羟丙基葡聚糖凝胶层析，采用三氯甲烷、乙酸乙酯和甲醇的溶剂系统洗脱，薄层色谱检测，乙醇和浓硫酸加热显色，收集显色部位，减压浓缩，得到三次柱层析分离物。

36.根据权利要求32所述提取方法，其特征在于，所述Sephadex LH-20层析具体为：将ODS柱层析得到的二次柱层析分离物经Sephadex LH-20羟丙基葡聚糖凝胶层析，采用三氯甲烷、乙酸乙酯和甲醇的溶剂系统洗脱，薄层色谱检测，乙醇和浓硫酸加热显色，收集显色部位，减压浓缩，得到三次柱层析分离物。

37.根据权利要求33所述提取方法，其特征在于，所述Sephadex LH-20层析具体为：将ODS柱层析得到的二次柱层析分离物经Sephadex LH-20羟丙基葡聚糖凝胶层析，采用三氯甲烷、乙酸乙酯和甲醇的溶剂系统洗脱，薄层色谱检测，乙醇和浓硫酸加热显色，收集显色部位，减压浓缩，得到三次柱层析分离物。

38.根据权利要求3-7任一所述提取方法，其特征在于，所述半制备高效液相色谱具体为：将Sephadex LH-20层析得到的三次柱层析分离物进行半制备高效液相色谱分离，以甲醇和水作为流动相进行洗脱，收集洗脱液，经减压浓缩，得到黄色粉末状所述生物类碱化合物。

39.权利要求1所述生物类碱化合物或其药学上可接受的盐在制备保肝护肝药物中的应用。

40.根据权利要求39所述应用，其特征在于，所述保肝护肝具体为治疗化学性肝损伤。

41.根据权利要求39所述应用，其特征在于，所述保肝护肝具体为治疗药物性肝损伤。

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