CN111675717B - 粉防己单体化合物及其提取方法和用途 - Google Patents

粉防己单体化合物及其提取方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了粉防己单体化合物及其提取方法和用途，属于药物化学技术领域。所述粉防己单体化合物包括两种，其中之一的粉防己单体化合物结构式如式(I)；其中之二的粉防己单体化合物结构式如式(II)：
Figure DDA0002549327310000011
本发明所述的两种单体化合物对HepG2肝癌细胞具有较好的抑制作用，可用于制备抗肝癌药物。

Description

粉防己单体化合物及其提取方法和用途
技术领域
本发明属于药物化学技术领域，尤其涉及粉防己单体化合物及其提取方法和用途。
背景技术
肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，具有起病隐匿、发展快的特点，发现多为中晚期，错过了最佳的手术时机。射频消融、肝动脉介入化疗栓塞、无水酒精注射等治疗手段临床疗效也不理想。同时，肝癌组织和细胞对化疗药物如丝裂霉素、5-FU等不敏感，导致化疗效果较差。研究证实中药可抑制肿瘤细胞的生长和转移，并能提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，国内外对其药理作用和机制进行了大量研究，并取得了较好的进展。有效成分的提取作为药理研究的关键，尤其被研究者重视。
粉防己是一味常见药材，其性寒、味苦，归膀胱、肺经，具有祛风止痛、利水消肿的功效，临床常用于治疗风湿痹痛、水肿脚气、小便不利和湿疹疮毒等症。粉防己中所含成分以生物碱、黄酮、多糖为主，其中的异喹啉生物碱类化合物为其重要药效物质，具有镇痛、抗炎,降压、抗菌、抗肿瘤等药理活性，是今后研究的主要方向。已知的生物碱主要有粉防己碱(汉防己甲)，结构式为
Figure GDA0003961779030000011
防己诺林碱，结构式为
Figure GDA0003961779030000012
小檗胺，结构式为
Figure GDA0003961779030000021
和轮环藤酚碱，结构式为
Figure GDA0003961779030000022
等。重视粉防己活性成分的研究，对于阐明其药效物质有着十分重要的意义，也为相关疾病的防治提供了新的思路。本发明人在对粉防己有效成分提取的研究过程中，意外分离出两种具有新型化合物结构的活性成分，对其药理作用进行研究，发现这两种活性成分可用于抗肝癌HepG2细胞。
发明内容
本发明的目的在于：提供两种粉防己单体化合物及其提取方法和用途，该两种粉防己单体化合物均可应用于抑制肝癌HepG2细胞。
为了实现以上目的，本发明采取的技术方案是：
本发明提供了两种粉防己单体化合物I和化合物II，所述化合物I的分子式为C38H44N2O7，结构式为式(I)：
Figure GDA0003961779030000023
所述化合物II的分子式为C19H17NO3Cl，结构式为下式(II)：
Figure GDA0003961779030000024
本发明还提供了所述粉防己单体化合物I和化合物II的提取方法，其步骤如下：
提取粉防己总生物碱；
用大孔吸附树脂梯度洗脱对所述粉防己总生物碱进行粗分，洗脱剂为乙醇-水体系，洗脱梯度依次为：
10v/v％乙醇洗脱，收集洗脱组分并去除洗脱剂，得到A组分；
30v/v％乙醇洗脱，收集洗脱组分并去除洗脱剂，得到B组分；
50v/v％乙醇洗脱，收集洗脱组分并去除洗脱剂，得到C组分；
70v/v％乙醇洗脱，收集洗脱组分并去除洗脱剂，得到D组分；
90v/v％乙醇洗脱，收集洗脱组分并去除洗脱剂，得到E组分；
用碱性氧化铝柱层析梯度洗脱对所述B组分进行分离，洗脱剂为氯仿-丙酮体系，洗脱梯度依次为：
v/v＝20:1的氯仿-丙酮洗脱，收集洗脱组分并去除洗脱剂，得到B-a组分；
v/v＝10:1的氯仿-丙酮洗脱，收集洗脱组分并去除洗脱剂，得到B-b组分；
v/v＝5:1的氯仿-丙酮洗脱，收集洗脱组分并去除洗脱剂，得到B-c组分；
v/v＝2:1的氯仿-丙酮洗脱，收集洗脱组分并去除洗脱剂，得到B-d组分；
用硅胶柱层析等度洗脱对所述B-c组分进行纯化，洗脱剂为氯仿-丙酮v/v＝8:1体系，收集洗脱组分并对所述洗脱组分进行TLC检测，之后再用碘-碘化铋钾进行显色，合并显色相同的组分，即得粉防己单体化合物I；或者
用凝胶柱色谱等度洗脱对所述B-d组分进行纯化，洗脱剂为氯仿-甲醇v/v＝1:1体系，收集洗脱组分并对所述洗脱组分进行TLC检测，之后再用碘-碘化铋钾进行显色，合并显色相同的组分，即得粉防己单体化合物II。
在本发明的一些优选实施方案中，所述提取粉防己总生物碱包括：
对粉防己药材粉碎后加甲醇或乙醇作提取溶剂，并在温度为80℃的水浴中热回流提取2次，滤过，合并滤液并减压蒸除溶剂，得到粉防己提取物浸膏；
将所述粉防己提取物浸膏分散在水中形成悬浮液，并调节悬浮液的pH值为2-3，静置后抽滤，收集滤液；
调节收集的滤液的pH值为10-11，进行萃取2-4次，合并萃取液并去除萃取剂，即得粉防己总生物碱浸膏。
在本发明的一些优选实施方案中，所述萃取剂为氯仿、二氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯中的任一种。
本发明还公开了所述粉防己单体化合物I或所述粉防己单体化合物II在抑制肝癌HepG2细胞中的应用。
本发明还公开了一种所述粉防己单体化合物I或所述粉防己单体化合物II在制备治疗肝癌药物中的应用。
本发明还公开了一种治疗肝癌的药物，由所述粉防己单体化合物I或所述粉防己单体化合物II和药学上可接受的载体制成。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明通过大孔吸附树脂、正向硅胶色谱及薄层色谱(TLC)等多种现代色谱法对粉防己总生物碱进行分离并鉴定出两种单体化合物，该两种单体化合物均能较好地抑制HepG2肝癌细胞，对粉防己的药效物质研究具有重要意义，也为肝癌的防治提供了新思路。
附图说明
图1为本发明粉防己单体化合物I的HMBC、1H-1H COSY和NOESY图；
图2为本发明粉防己单体化合物I的ECD图；
图3为本发明粉防己单体化合物II的1H-1H COSY和HMBC图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明进行描述。应当理解，以下描述仅用于说明和解释本发明，而不是对本发明权利要求的限制。
参照图1至图3，图1提供了本发明所述粉防己单体化合物I的HMBC(异核多碳谱)图、1H-1HCOSY(二维1H-1H谱)图和NOESY(二维奥弗豪塞尔核效应光谱)图；图2提供了本发明所述粉防己单体化合物I的ECD(圆二色谱)图；图3提供了本发明所述粉防己单体化合物II的1H-1H COSY(二维1H-1H谱)图和HMBC(异核多碳谱)图。
实施例1
本实施例提供了粉防己单体化合物I和化合物II的提取方法，包括：
步骤一：提取粉防己总生物碱
将20kg干燥粉防己药材粉碎，并按每100g药材粉末加700mL 95％乙醇作提取溶剂，在温度为80℃的水浴中热回流提取2次，每次2小时，减压抽滤，合并滤液，滤液在减压条件下回收乙醇，即得粉防己提取物浸膏；
将所述粉防己提取物浸膏分散在100mL蒸馏水中形成悬浮液，对所述悬浮液用2M的盐酸调节pH值为2-3；静置过夜后，减压抽滤，滤液用浓氨水调节pH为10-11，并立即用等体积的氯仿萃取三次，合并有机相并减压条件下回收氯仿，得到500g粉防己总生物碱浸膏；
步骤二：分离粉防己单体化合物I和化合物II
1)将粉防己总生物碱浸膏溶于少量甲醇中，湿法上样，用大孔吸附树脂梯度洗脱对其进行粗分，洗脱剂为乙醇-水体系，洗脱梯度依次为：
10v/v％乙醇洗脱后，收集洗脱组分并在减压下回收乙醇，即得100g A组分；
30v/v％乙醇洗脱后，收集洗脱组分并在减压下回收乙醇，即得80g B组分；
50v/v％乙醇洗脱后，收集洗脱组分并在减压下回收乙醇，即得60g C组分；
70v/v％乙醇洗脱后，收集洗脱组分并在减压下回收乙醇，即得4g D组分；
90v/v％乙醇洗脱后，收集洗脱组分并在减压下回收乙醇，即得80g E组分；
2)将所述B组分湿法装柱，干法上样，用碱性氧化铝柱层析梯度洗脱进行分离，洗脱剂为氯仿-丙酮体系，洗脱梯度依次为：
v/v＝20:1的氯仿-丙酮洗脱，收集洗脱组分并在减压下回收氯仿-丙酮，得到B-a组分；
v/v＝10:1的氯仿-丙酮洗脱，收集洗脱组分并在减压下回收氯仿-丙酮，得到B-b组分；
v/v＝5:1的氯仿-丙酮洗脱，收集洗脱组分并在减压下回收氯仿-丙酮，得到B-c组分；
v/v＝2:1的氯仿-丙酮洗脱，收集洗脱组分并在减压下回收氯仿-丙酮，得到B-d组分；
3)将所述B-c组分湿法装柱，干法上样，用硅胶柱层析等度洗脱对其进行纯化，洗脱剂为氯仿-丙酮(v/v＝8:1)体系，每500mL收集一次洗脱液，共收集10个洗脱液，对所述洗脱液在减压下回收氯仿-丙酮，即得10个洗脱组分，对所述洗脱组分进行TLC检测，之后再用碘-碘化铋钾进行显色，合并显色相同的组分，即得85mg粉防己单体化合物I；
3)用凝胶柱色谱等度洗脱对所述B-d组分进行纯化，洗脱剂为氯仿-甲醇(v/v＝1:1)体系，每200mL收集一次洗脱液，共收集10个洗脱液，对所述洗脱液在减压下回收氯仿-甲醇，即得10个洗脱组分，对所述洗脱组分进行TLC检测，之后再用碘-碘化铋钾进行显色，合并显色相同的组分，即得4.8mg粉防己单体化合物II。
本发明所述粉防己单体化合物I的理化性质如下：
白色粉末；碘-碘化铋钾显红色；
旋光度：[α]D 20+60.0°(c 10mM，CH3OH)；
TLC展开体系：v/v＝10:1的氯仿-甲醇，R值＝0.5。
本发明所述粉防己单体化合物I结构的确定
采用高分辨电喷雾电离质谱(HRESIMS)进行分析，确定化合物I分子式为：C38H44N2O7(m/z 641.3217[M+H]+，C38H45N2O7的计算值为641.3221)；IR光谱在Vmax＝3424cm-1处的峰指示有羟基存在；粉防己单体化合物I的1H和13C NMR光谱数据如表1所示。
表1-粉防己单体化合物I的1H和13C NMR(150M)光谱数据
Figure GDA0003961779030000071
Figure GDA0003961779030000081
通过表1可知，本发明所述粉防己单体化合物I包括：6个甲基、6个亚甲基、12个次甲基、14个季碳和3个甲氧基。本发明所述粉防己单体化合物I的1H和13CNMR数据与limacine的结构非常相似，但所述化合物I在δH 2.58(s，H-17')处多一个N-甲基，表明本发明所述粉防己单体化合物I是limacine的类似物。
limacine的结构式如下：
Figure GDA0003961779030000082
进一步，图1中H-17'/C-16'之间的HMBC峰表明，N-甲基连接在N-2'位上。同时，本发明所述粉防己单体化合物I相比于limacine，其分子量多32个单位，扣除N-2'位上连接的所述N-甲基的15个质量单位后，剩下17个质量单位，这恰好是羟基的质量单位，所以粉防己单体化合物I应当还具有一个羟基。而综观整个结构，只有一个位置还可以安排羟基，即N-2位置。16-甲基H信号向低场的强烈移动(从2.32到3.11)也可以进一步证明。
本领域周知，具有1S，1'S构型的天然双苄基异喹啉的ECD(圆二色谱)图通常在218nm处显示出正Cotton效应，而图2表明粉防己单体化合物I的ECD光谱在221nm处显示出正Cotton效应。因此，粉防己单体化合物I绝对构型为1S，1'S。此外，在Me-16和H-1之间未观察到NOESY峰，表明Me-16应该是α方向。
综上所述，可确定本发明所述粉防己单体化合物I的结构如下：
Figure GDA0003961779030000091
本发明所述粉防己单体化合物II的理化性质
白色粉末；碘-碘化铋钾显红色；
旋光度：[α]D 20+90.0°(c 10mM，CH3OH)；
TLC展开体系：v/v＝8:1的氯仿:甲醇，R值＝0.5。
本发明所述粉防己单体化合物II结构的确定
采用高分辨电喷雾电离质谱(HRESIMS)进行分析，确定化合物II的分子式为C19H17NO3Cl(m/z 342.0889[M]+，C19H17NO3Cl的计算值为342.0892)；红外光谱在Vmax＝3419cm-1处显示有羟基；所述粉防己单体化合物II的1H和13CNMR光谱数据如表2所示。
表2-粉防己单体化合物II的1H和13C NMR(150M)光谱数据
Figure GDA0003961779030000092
Figure GDA0003961779030000101
通过表2可知，本发明所述粉防己单体化合物II包括：1个甲基、4个亚甲基、5个次甲基、9个季碳、1个N-甲基、1个氯甲基、1个亚甲二氧基和5个芳族质子。本发明所述粉防己单体化合物II的1H和13CNMR数据与去氢阿朴啡生物碱8-羟基去氢罗默碱的结构非常相似，表明本发明所述粉防己单体化合物II是8-羟基去氢罗默碱的类似物。
8-羟基去氢罗默碱的结构式如下：
Figure GDA0003961779030000102
进一步，图3中H-19/C-6、H-19/C-7、H-5/C-6、H-5/C-7之间的HMBC峰表明，本发明所述粉防己单体化合物II的亚甲二氧基与B-环并合形成1,3二恶烷。H-18/C-2、H-2/C-18、H-18/C-17、H-17/C-18、H-2/C-17之间的HMBC峰表明，甲基和氯甲基连接到氮原子上形成季胺；H-11/C-10、H-11/C-12、H-11/C-20、H-11/C-9之间的HMBC峰表明C环形成了芳环。由于D环中的三个质子分别显示dd(J＝9.3，2.6Hz)，t(J＝9.3Hz)和dd(J＝9.3，2.6Hz)峰，所以D环中的羟基只能被取代在C-13或C-16位。
本领域周知，当去氢阿朴啡生物碱的C-16位没有羟基取代时，H-16的化学位移通常较大，δH约为8.5-9.1ppm，且在C-16位有羟基取代时，D环上质子的化学位移通常不超过8.0ppm。而本发明所述粉防己单体化合物II的H-16的化学位移达到9.06ppm，这表明羟基应该连接到C-13，而不是C-16。
综上所述，可以确定本发明所述粉防己单体化合物II的结构如下：
Figure GDA0003961779030000111
实施例2
本实施例提供了测定粉防己单体化合物I和化合物II对HepG2肝癌细胞活性的抑制作用，具体提供了利用MTT法测定粉防己单体化合物I和化合物II对HepG2肝癌细胞的抑制率，表柔比星作为阳性对照药，具体实验过程如下：
1)收集处于对数生长期的HepG2肝癌细胞，利用培养基将其重悬成浓度为1-3×104个/mL的细胞悬液，然后按照每孔100μL细胞悬液将其接种到96孔板中，并置于37℃、5％CO2的细胞培养箱内孵育过夜。次日，加入100μL含有梯度浓度的化合物I和化合物II的培养基处理，每个药物浓度设置3个复孔，并用含有0.1％DMSO的培养基处理细胞作为阴性对照。将细胞培养板在细胞培养箱内继续孵育72h后，每个孔内加入20μL5mg/mL的MTT溶液，37℃孵育2-4h，形成甲臜结晶后去掉上清，再在每孔内加入150μL的DMSO溶解甲臜结晶。待甲臜溶解完全后，用酶标仪检测570nm波长下的吸光度值(A)(A值与活细胞数成正比)，并根据以下公式计算药物对肿瘤细胞的生长抑制率：
细胞生长抑制率＝(对照组A570-实验组A570)/对照组A570×100％。
采用Graphpad Prism拟合药物的生长抑制曲线并计算半数抑制浓度(IC50)值，结果见下表3。
表3-MTT法测试结果
终浓度为50μg/mL时抑制率 <![CDATA[IC<sub>50</sub>]]>
粉防己单体化合物I 86.8％ 10.4μg/mL
粉防己单体化合物II 87.8％ 7.3μg/mL
表柔比星(阳性药) 100％ 7.3μg/mL
通过表3可以看出，本发明所述粉防己单体化合物I和化合物II均对HepG2肝癌细胞具有较好的抑制作用。
按照常规的药品生产工艺，对所述粉防己单体化合物I或化合物II加入适宜的甜味剂和辅料，可制备成各种剂型的抗肝癌药物。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种粉防己单体化合物I，结构式如式(I)：
Figure FDA0004043179810000011
2.一种粉防己单体化合物II，其结构式如式(II)：
Figure FDA0004043179810000012
3.一种根据权利要求1所述的粉防己单体化合物I的提取方法，其特征在于，包括步骤：
S1、提取粉防己总生物碱；
S2、用大孔吸附树脂梯度洗脱对所述粉防己总生物碱进行粗分，洗脱剂为乙醇-水体系，洗脱梯度依次为：
10v/v％乙醇洗脱，收集洗脱组分并去除洗脱剂，即得A组分；
30v/v％乙醇洗脱，收集洗脱组分并去除洗脱剂，即得B组分；
50v/v％乙醇洗脱，收集洗脱组分并去除洗脱剂，即得C组分；
70v/v％乙醇洗脱，收集洗脱组分并去除洗脱剂，即得D组分；
90v/v％乙醇洗脱，收集洗脱组分并去除洗脱剂，即得E组分；
S3、用碱性氧化铝柱层析梯度洗脱对所述B组分进行分离，洗脱剂为氯仿-丙酮体系，洗脱梯度依次为：
v/v＝20:1的氯仿-丙酮洗脱，收集洗脱组分并去除洗脱剂，得到B-a组分；
v/v＝10:1的氯仿-丙酮洗脱，收集洗脱组分并去除洗脱剂，得到B-b组分；
v/v＝5:1的氯仿-丙酮洗脱，收集洗脱组分并去除洗脱剂，得到B-c组分；
v/v＝2:1的氯仿-丙酮洗脱，收集洗脱组分并去除洗脱剂，得到B-d组分；
S4、用硅胶柱层析等度洗脱对所述B-c组分进行纯化，洗脱剂为氯仿-丙酮v/v＝8:1体系，收集洗脱组分；
S5、对等度洗脱的洗脱组分进行TLC检测后，用碘-碘化铋钾进行显色，合并显色相同的组分，即得粉防己单体化合物I。
4.一种根据权利要求2所述的粉防己单体化合物II的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、提取粉防己总生物碱；
S2、用大孔吸附树脂梯度洗脱对所述粉防己总生物碱进行粗分，洗脱剂为乙醇-水体系，洗脱梯度依次为：
10v/v％乙醇洗脱，收集洗脱组分并去除洗脱剂，得到A组分；
30v/v％乙醇洗脱，收集洗脱组分并去除洗脱剂，得到B组分；
50v/v％乙醇洗脱，收集洗脱组分并去除洗脱剂，得到C组分；
70v/v％乙醇洗脱，收集洗脱组分并去除洗脱剂，得到D组分；
90v/v％乙醇洗脱，收集洗脱组分并去除洗脱剂，得到E组分；
S3、用碱性氧化铝柱层析梯度洗脱对所述B组分进行分离，洗脱剂为氯仿-丙酮体系，洗脱梯度依次为：
v/v＝20:1的氯仿-丙酮洗脱，收集洗脱组分并去除洗脱剂，得到B-a组分；
v/v＝10:1的氯仿-丙酮洗脱，收集洗脱组分并去除洗脱剂，得到B-b组分；
v/v＝5:1的氯仿-丙酮洗脱，收集洗脱组分并去除洗脱剂，得到B-c组分；
v/v＝2:1的氯仿-丙酮洗脱，收集洗脱组分并去除洗脱剂，得到B-d组分；
S4、用凝胶柱色谱等度洗脱对所述B-d组分进行纯化，洗脱剂为氯仿-甲醇v/v＝1:1体系，收集洗脱组分；
S5、对等度洗脱的洗脱组分进行TLC检测后，用碘-碘化铋钾显色，合并显色相同的组分，即得粉防己单体化合物II。
5.根据权利要求3或4所述的提取方法，其特征在于，提取粉防己总生物碱包括：
对粉防己药材粉碎后加甲醇或乙醇作提取溶剂，回流提取2次，滤过，合并滤液并去除溶剂，得到粉防己提取物浸膏；
将所述粉防己提取物浸膏分散在水中形成悬浮液，并调节悬浮液的pH值为2-3，静置后抽滤，收集滤液；
调节收集的滤液的pH值为10-11后，进行萃取2-4次，合并萃取液并去除萃取剂，即得粉防己总生物碱浸膏。
6.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，所述萃取剂为氯仿、二氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯中的任一种。
7.一种根据权利要求1所述的粉防己单体化合物I或权利要求2所述的粉防己单体化合物II在制备治疗肝癌药物中的应用。
8.一种治疗肝癌的药物，其特征在于，由权利要求1所述的粉防己单体化合物I或权利要求2所述的粉防己单体化合物II和药学上可接受的载体制成。
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