CN113264974A - 一种乙型强心苷的制备及其抗血管生成应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种乙型强心苷及其制备方法和应用，其结构如下：

Description

一种乙型强心苷的制备及其抗血管生成应用
技术领域
本发明属于天然药物化学领域，涉及从铁筷子中分离的化合物的制备方法及其在制备抗血管生成药物的应用。
背景技术
据统计：恶性肿瘤在我国城市居民的死因中排名第l位。研究发现肿瘤生长和转移均具有血管依赖性，并提出抗血管生成治疗成为一个全新的领域。目前，抗血管生成药物治疗已成为肺癌脑转移治疗的重要手段之一，在传统治疗干预基础上，积极探索联合应用抗血管生成药物治疗成为重要研究方向之一。当前治疗肿癌的抗血管生成药物包括单克隆抗体、内源性血管生成抑制剂和血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶。但是存在局部严重缺氧，酸中毒等不良反应。因此，开发高效安全的新型抗血管生成药物是当今药物研发领域的重点之一。近年来，天然产物的结构多样性及易于生物大分子结合的特点，在新药研发中发挥着重要的作用。
铁筷子植物是我国特有的一种植物，主要分布在四川西北部、甘肃南部和陕西南部，主治活血散瘀、尿道炎、膀胱炎、疮疖肿毒等症。近年来人们研究了铁筷子的化学成分，主要包括甾体皂苷、黄酮、植物蜕皮激素、脂肪酸和乙型强心苷，且具有较好的生物活性，包括抗血管生成活性。因此，从铁筷子中分离具有抗血管生成的化合物对于新型抗血管生成药物研发发挥着重要作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种乙型强心苷化合物，具有抗血管生成作用。
本发明所要解决的另一目的在于提供上述的乙型强心苷的制备方法。
本发明所要解决的再一目的在于上述乙型强心苷在抗血管生成药物的应用。
本发明的具体技术方案。
一种乙型强心苷，其结构式如下：
Figure RE-GDA0003151966380000011
命名为：5β,10β,14β,16β-tetrahyclroxy-19-norbufa-3,20,22-trienolide
上述乙型强心苷化合物的制备步骤：
(1)将采集的铁筷子植物根茎部位自然风干，粉碎后用95％乙醇浸泡，浸泡液减压浓缩得到浓缩液；
(2)浓缩液制成水浊液，然后用正丁醇萃取，有机相浓缩后得到正丁醇萃取物；
(3)将正丁醇萃取物采用D101大孔树脂柱层析，分别用水、30％、50％、 95％的乙醇洗脱，最后分别蒸馏浓缩得到四个馏分；
(4)铁筷子正丁醇30％部分过正相硅胶柱层析，用二氯甲烷-甲醇洗脱剂 (50:1、20:1、15:1、8:1、2:1)梯度洗脱得到五个组分Fr.1-Fr.5；
(5)将组分Fr.4过正相硅胶柱层析，依次用15:1、8:1、5:1、2:1的二氯甲烷：甲醇洗脱剂梯度洗脱，得到五个组分Fr.4.1-Fr.4.5；
(6)将Fr.4.4过反相色谱柱层析，用甲醇-水洗脱剂梯度洗脱，得到五个组分Fr.4.4.1-Fr.4.4.5；
(7)Fr.4.4.2先用凝胶柱(二氯甲烷：甲醇＝1:1)、硅胶柱(二氯甲烷：甲醇＝13:1、8:1、5:1)纯化，最后经半制备型高效液相色谱，用甲醇：水(52:48) 洗脱，检测波长为210nm，收集保留时间为13.5min的组分，得到上述乙型强心苷纯品。
步骤(1)中，铁筷子粉碎至粒度直径小于3mm。
步骤(1)中，铁筷子与95％乙醇的体积比1:2-1:3。
步骤(1)中，浸泡四次，每次浸泡时间为一周。
步骤(2)中，浓缩液与水的体积比为1:3-1:4。
步骤(2)中，正丁醇与水浊液的体积比3:1，萃取次数为3-4次。
步骤(7)中，流速为3mL/min。
一种乙型强心苷在抗血管生成药物中的应用。
本发明的优点以及有益效果：
(1)铁筷子是中国特有的一种单属植物，是中国传统的中草药；
(2)本发明获得的乙型强心苷化合物具有良好的人脐静脉内皮细胞抑制活性，且对正常细胞的毒性低；
(3)本发明获得提取物的制备方法操作简单方便、成本低。
附图说明
图1为化合物的结构式；
图2为图1化合物的高分辨质谱；
图3为图1所示化合物的氢谱(600MHz)和碳谱(150MHz)数据(CDOD3)。
图4为乙型强心苷(h10)对HUVEC细胞的活性检测图
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。实施例中的实验方法，如无特别说明，均采用本领域常规技术，实验试剂均为商业购买。
实施例1铁筷子正丁醇提取物的制备
将采集的铁筷子根茎部位自然风干，称重得7.5kg。粉碎至粒度直径小于 3mm，用95％乙醇浸泡4次，每次15L，每次7天。将所有的浸泡液用旋转蒸发仪除去溶剂，得到浓缩液4L；向浓缩液中加入12L乙酸乙酯进行萃取，萃取 4次，收集萃取后的有机相(乙酸乙酯相)；再向水相中加入正丁醇，萃取四次，同理得到正丁醇相，弃去水相。将正丁醇提取液用旋转蒸发仪进行减压浓缩至恒重，得到棕红色浆状物,作为粗提物(650g)。
实施例2乙型强心苷的制备
铁筷子正丁醇相浓缩至500mL，呈现深棕红色粘稠状液体，采用D101 大孔树脂柱子层析，分别用水、30％、50％、95％的乙醇梯度洗脱，最后分别蒸馏浓缩得到四个馏分。正丁醇30％部分减压浓缩得到棕黑色粘稠状物(212g)，湿法上样，湿法装柱(200-300目硅胶柱)，用二氯甲烷-甲醇-水洗脱剂梯度洗脱得到五个组分(Fr.1-Fr.5)。Fr.4 首先用正相硅胶柱层析，用二氯甲烷：甲醇(15:1、8:1、5:1、2:1)梯度洗脱，得到五个组分Fr.4.1-Fr.4.5。将Fr.4.4在反相色谱柱采用甲醇-水洗脱剂梯度洗脱继续分离，得到五个组分Fr.4.4.1-Fr.4.4.5。Fr.4.4.2先在凝胶柱(二氯甲烷：甲醇＝1:1)、硅胶柱(二氯甲烷：甲醇＝13:1、8:1、5:1)进一步反复纯化，最后经半制备型高效液相(色谱柱为YMC-Pack ODS-A 10mm×250mm，流速为3.0 mL/min，流动相甲醇：水＝52:48)纯化，检测波长为210nm，收集时间为13.5 min的组分，得到上述乙型强心苷纯品。
化合物为白色固体，易溶于氯仿、甲醇、DMSO，难溶于水，分子式为 C23H30O6，比旋光度[a]D 29+5.01(C0.10，MeOH)。
对分离获得的化合物进行高分辨质谱(HR-ESIMS)、1H NMR、13C NMR 分析，确定了结构。1H和13C NMR数据见图3，分离得到的化合物的结构如图 1所示。
实施例3乙型强心苷化合物抗血管生成活性
首先将人脐静脉内皮细胞加药处理24h后，吸去上清，缓慢的加入100 uL10％TCA用来固定细胞，静置5min，置于4℃的冰箱冷冻1h；倒掉固定液，用去离子水冲洗5次放在空气中干燥；50uL SRB缓冲液加入96孔板中放于摇床中震荡10min混合均匀。酶标仪540nm处测试其吸光度，计算OD值。
实验结果表示，化合物对人正常的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)作用不明显，但对VEGF诱导的人脐静脉内皮细胞具有明显的抑制作用。

Claims (9)

1.一种乙型强心苷类化合物，命名为：
5β,10β,14β,16β-tetrahyclroxy-19-norbufa-3,20,22-trienolide，结构式如下：
Figure FDA0002974745080000011
2.权利要求1所述的乙型强心苷类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)铁筷子根茎部位，粉碎后用95％乙醇浸泡，浸泡液减压浓缩得到浓缩液；
(2)浓缩液制成水浊液，然后用正丁醇萃取，有机相浓缩后得到正丁醇萃取物；
(3)将正丁醇萃取物采用D101大孔树脂柱层析，分别用水、30％、50％、95％的乙醇洗脱，最后分别蒸馏浓缩得到四个馏分；
(4)铁筷子正丁醇30％部分过正相硅胶柱层析，用二氯甲烷-甲醇洗脱剂(50:1、20:1、15:1、8:1、2:1)梯度洗脱得到五个组分Fr.1-Fr.5；
(5)将组分Fr.4过正相硅胶柱层析，依次用15:1、8:1、5:1、2:1的二氯甲烷：甲醇洗脱剂梯度洗脱，得到五个组分Fr.4.1-Fr.4.5；
(6)将Fr.4.4过反相色谱柱层析，用甲醇-水洗脱剂梯度洗脱，得到五个组分Fr.4.4.1-Fr.4.4.5；
(7)Fr.4.4.2先用凝胶柱(二氯甲烷：甲醇＝1:1)、硅胶柱(二氯甲烷：甲醇＝13:1、8:1、5:1)纯化，最后经半制备型高效液相色谱，用甲醇：水(52:48)洗脱，检测波长为210nm，收集保留时间为13.5min的组分，得到上述乙型强心苷纯品。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，铁筷子粉碎至粒度直径小于3mm。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，铁筷子与95％乙醇的体积比为1:2-1:3。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，浸泡四次，每次浸泡时间为一周。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，浓缩液与水的体积比为1:3-1:4。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，正丁醇与水浊液的体积比3:1，萃取次数为3-4次。
8.一种如权利要求1所述的乙型强心苷在制备抗血管生成药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述细胞为人脐静脉内皮(HUVEC)细胞。
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