CN113968893A - 一种具有抗血管生成活性的强心苷及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物化工用技术领域，具体涉及一种具有抗血管生成活性的强心苷及其制备方法和应用。一种具有抗血管生成活性的强心苷是从毛花洋地黄叶子中提取并分离得到的化合物，该化合物对非小细胞肺癌细胞A549,宫颈癌细胞Hela,乳腺癌细胞MCF‑7具有纳摩尔浓度级的增殖抑制活性；另外该化合物能在鸡胚绒毛尿囊膜模型上显著抑制新血管生成，因此可为开发新型抗肿瘤血管生成药物提供候选药物。

Description

一种具有抗血管生成活性的强心苷及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物化工用技术领域，具体涉及一种具有抗血管生成活性的强心苷及其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤是严重威胁人类健康和生命的常见疾病，全球癌症发病率和死亡率正在呈迅速上升的趋势，已成为21世纪世界各国人类死亡的首要原因和人寿命延长的最主要的障碍。为了降低肿瘤的发病率和死亡率，各国研究人员都在为之进行不懈努力。尽管人类在肿瘤方面取得了长足的进步，但是肿瘤的治疗仍然是一个有待攻克的难题。
肿瘤的生长依赖于血管生成，肿瘤血管生成在恶性肿瘤的生长、侵袭和转移等过程中发挥了极其重要的作用，也被认为是癌症的主要特征之一。以肿瘤的新生血管为作用靶点，通过切断对肿瘤的营养供应和转移路径，阻止肿瘤的生长、侵袭和转移，是一种重要的靶向治疗方法。肿瘤血管靶向药与传统的抗肿瘤药相比，具有毒性小、不易产生耐药性以及具有防止肿瘤的转移等诸多优点。抑制肿瘤血管生成已成为国际上一个很有潜力的研究热点。
强心苷是自然界中存在的一类能够增强心肌收缩作用的甾体苷类化合物，近些年的研究表明其具有抗癌作用，因此对富含强心苷成分的药用植物毛花洋地黄(Digitalislanata)的进行研究，有望从中获得结构新颖活性优良的化合物。
为此，我们提出一种具有抗血管生成活性的强心苷及其制备方法和应用。
发明内容
本发明的目的在于提出了一种结构新颖的具有抗血管生成活性的强心苷及其制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种具有抗血管生成活性的强心苷是从毛花洋地黄(Digitalis lanata)叶子中提取并分离得到的化合物digitoxigenin3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-methylglucopyranosyl-(1→4)-β-D-digitoxopyranosyl-(1→4)-β-D-digitoxopyranoside；所述化合物的结构式如下
Figure BDA0003348615890000021
所述一种具有抗血管生成活性的强心苷的制备方法包括以下步骤：
S1、将毛花洋地黄(Digitalis lanata)干燥叶子用甲醇浸泡3次，每次7天，甲醇浸提液减压浓缩得到总浸膏。
S2、将步骤S1所得总浸膏分别用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇进行萃取，其中乙酸乙酯段用大孔树脂进行色谱分离，分离时依次采用乙醇-水从0:100,30:70,50:50,80:20,95:5v/v梯度洗脱，收集梯度为乙醇：水＝80:20的洗脱组分；
S3、将步骤S2所得的洗脱组分再用MCI柱色谱进行分离，分离时依次采用甲醇-水从50:50，60:40,70:30,80:20,90:10,100:0v/v梯度洗脱，收集80:20组分并用硅胶柱色谱进行分离；
S4、将步骤S3所得的组分用凝胶柱色谱进行分离，洗脱液为体积比1:1的二氯甲烷-甲醇溶液，收集TLC板上经喷洒3，5-二硝基苯甲酸试剂并加热后显色为紫红色的组分；
S5、将步骤S4所得的组分采用半制备液相色谱进行纯化，流动相为体积比为23:17的甲醇/水，流速为2mL/min，检测波长为200-400nm，接收保留时间为34min,紫外吸收特征波长为215nm的组分即得到所述化合物。
进一步地，所述步骤S3中流动相为二氯甲烷/甲醇的混合溶剂梯度洗脱，体积比从40:1到1:1，收集梯度为20:1至10:1的二氯甲烷/甲醇洗脱组分，以二氯甲烷：甲醇＝8:1为展开剂进行薄层色谱分析，该组分Rf值为0.5-0.8，紫外波长254nm下有吸收，TLC板上喷洒3，5-二硝基苯甲酸试剂并加热，显色为紫红色。
进一步地，所述步骤S5中分离过程时半制备液相色谱的液相色谱仪为Waters1525，流动相为乙腈-水或甲醇-水，流速为2mL/min，检测器为Waters2998光电二极管阵列检测器，色谱柱为Waters Sunfire C18半制备柱，规格为10×150mm。
优选地，本发明提供了所述化合物对非小细胞肺癌细胞A549,宫颈癌细胞Hela,乳腺癌细胞MCF-7细胞具有明显的细胞毒活的应用。
优选地，本发明还提供了所述化合物在抗肿瘤血管生成药物方面的应用。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益技术效果是：
本发明所述的化合物对非小细胞肺癌细胞A549,宫颈癌细胞Hela,乳腺癌细胞MCF-7具有纳摩尔浓度级的增殖抑制活性；另外该化合物能在鸡胚绒毛尿囊膜模型上显著抑制新血管生成，因此可为开发新型抗肿瘤血管生成药物提供候选药物。
最后本发明中所述化合物是从可大规模种植的药用植物中直接提取分离，原料易得，因此可大规模的生产社会效益显著，且成本低。
附图说明
图1为本发明所述化合物的的二级质谱图；
图2为本发明所述化合物的为本发明所述化合物的1HNMR谱图；
图3为本发明所述化合物的的13CNMR谱图；
图4为本发明所述化合物的的HSQC谱图；
图5为本发明所述化合物的的HMBC谱图；
图6为本发明所述化合物的的1H-1H COSY谱图；
图7为本发明所述化合物的的NOESY谱图；
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
活性测试
1、细胞毒活性
将处于对数增长期的人非小细胞肺癌细胞A549,宫颈癌细胞Hela,乳腺癌细胞MCF-7分别消化制成细胞悬液，细胞计数后分别按每孔4000个细胞接种于96孔培养板中，每孔接种100μL，同时保留空白组，于37℃、5％CO2下培养过夜。待细胞贴壁后，实验组加入100μL含不同浓度测试样品的培养基，对照组加入等体积的培养基，置于37℃、5％CO2下培养48h后，吸掉96孔培养板中的培养基，并用无菌PBS洗一次，避光条件下，加入20μL 5mg/mL的MTT溶液和100μL的培养基，对照组在空白孔中加入20μL 5mg/mL的MTT溶液和100μL的培养基，继续培养5h，然后每孔加入100μL的三联溶解液(含95％的SDS(质量分数为10％)，5％异丁醇，0.1％的浓盐酸)过夜，至甲臜完全溶解后用酶联免疫检测仪检测吸光度值。设置检测波长为570nm，背景波长为630nm，进行吸光度(OD)检测。并将结果用Origin 8.0软件进行处理。生长曲线以药物浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标，按照公式“细胞生长存活率(％)＝(实验组OD值-空白OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100％”计算存活率，绘制剂量反应回归曲线，计算IC50值。实验结果表明，化合物对A549,Hela和MCF-7细胞具有明显的细胞毒活性IC50分别为40,20和23nmol/L。
2、新血管生成抑制活性
市售受种蛋用新洁尔灭消毒，于温度为38±0.5℃、相对湿度为65％-70％的培养箱中孵育，种蛋钝端向上,呈45°倾斜,每天转蛋至少2～4次，孵育8天后，消毒蛋壳气室端约2cm*2cm，并开窗，用眼科弯剪夹去蛋壳及壳膜，开窗面积约为1.5cm*1.5cm，用生理盐水润湿并撕去气室膜，暴露鸡胚绒毛尿囊膜。膜上放置1cm*1cm的聚乙烯树脂环，环内加入20uL事先用生理盐水配置好的待测化合物，并设置对照组。用封口膜封窗继续孵育48h，剪开封口膜，在显微镜下观察聚乙烯树脂环内鸡胚绒毛尿囊膜新生血管情况，用image J软件对血管数目进行统计，计算血管生成率。实验结果表明，化合物能明显抑制新血管的生成，但对原存在血管没有破坏作用。化合物浓度为0.015ug/uL时，和对照相比，抑制了63.41％的新生血管。
化合物的核磁数据如表1，
Figure BDA0003348615890000051
Figure BDA0003348615890000061
以上所述为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种具有抗血管生成活性的强心苷是从毛花洋地黄叶子中提取并分离得到的化合物digitoxigenin3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-methylglucopyranosyl-(1→4)-β-D-digitoxopyranosyl-(1→4)-β-D-digitoxopyranoside，所述化合物的结构式如下
Figure FDA0003348615880000011
2.根据权利要求1所述的一种具有抗血管生成活性的强心苷制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、将毛花洋地黄干燥叶子用甲醇浸泡3次，每次7天，甲醇浸提液减压浓缩得到总浸膏。
S2、将步骤S1所得总浸膏分别用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇进行萃取，其中乙酸乙酯段用大孔树脂进行色谱分离，分离时依次采用乙醇-水从0:100,30:70,50:50,80:20,95:5v/v梯度洗脱，收集梯度为乙醇：水＝80:20的洗脱组分；
S3、将步骤S2所得的洗脱组分再用MCI柱色谱进行分离，分离时依次采用甲醇-水从50:50，60:40,70:30,80:20,90:10,100:0v/v梯度洗脱，收集80:20组分并用硅胶柱色谱进行分离；
S4、将步骤S3所得的组分用凝胶柱色谱进行分离，洗脱液为体积比1:1的二氯甲烷-甲醇溶液，收集TLC板上经喷洒3，5-二硝基苯甲酸试剂并加热后显色为紫红色的组分；
S5、将步骤S4所得的组分采用半制备液相色谱进行纯化，流动相为体积比为23:17的甲醇/水，流速为2mL/min，检测波长为200-400nm，接收保留时间为34min,紫外吸收特征波长为215nm的组分即得到所述化合物。
3.根据权利要求1所述的一种具有抗血管生成活性的强心苷制备方法，其特征在于：所述步骤S3中流动相为二氯甲烷/甲醇的混合溶剂梯度洗脱，体积比从40:1到1:1，收集梯度为20:1至10:1的二氯甲烷/甲醇洗脱组分，以二氯甲烷：甲醇＝8:1为展开剂进行薄层色谱分析，该组分Rf值为0.5-0.8，紫外波长254nm下有吸收，TLC板上喷洒3，5-二硝基苯甲酸试剂并加热，显色为紫红色。
4.根据权利要求1所述的一种具有抗血管生成活性的强心苷制备方法，其特征在于：所述步骤S5中分离过程时半制备液相色谱的液相色谱仪为Waters
1525，流动相为乙腈-水或甲醇-水，流速为2mL/min，检测器为Waters 2998光电二极管阵列检测器，色谱柱为Waters Sunfire C18半制备柱，规格为10×150mm。
5.如权利要求1-4任意一项所述的一种具有抗血管生成活性的强心苷在非小细胞肺癌细胞A549、宫颈癌细胞Hela以及乳腺癌细胞MCF-7细胞毒活性的应用。
6.如据权利要求1-4任意一项所述的一种具有抗血管生成活性的强心苷在抗肿瘤血管生成药物方面的应用。
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