CN105601693B - 人参皂苷f1的制备及其抗肿瘤作用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种人参皂苷的提取纯化方法和其药物用途，具体涉及抗肿瘤有效成分人参皂苷F₁的分离、纯化方法。本发明以人参花为原料，将其用甲醇提取，环己烷、乙酸乙酯依次萃取后，将乙酸乙酯萃取物经过硅胶柱层析和MCI GEL柱层析，得到人参皂苷F₁单体。具有制备工艺易于操作，收率高，纯度高，不引入有毒物质，成本低廉等特点，产品在抗肿瘤药物中具有广泛用途。

Description

人参皂苷F1的制备及其抗肿瘤作用

技术领域

本发明涉及一种天然产物活性成分的分离纯化及其抗肿瘤作用，具体涉及人参皂苷F₁的分离纯化新方法及其对肺癌、胃癌和乳腺癌的作用，属于医药领域。

背景技术

近几年，全球癌症病例呈迅猛增长态势，是对人类健康和生命构成严重威胁的主要病种之一。在我国，癌症发病率前三位是肺癌、乳腺癌、胃癌，死亡率前三位是肺癌、肝癌、胃癌，并且女性癌症发病率上升明显，特别是乳腺癌。所以，积极有效的预防和治疗癌症依然是亟待解决的医学难题。

人参(Panax ginseng C.A.Mey.)系五加科(Araliaceae)人参属(Panax)植物，是产于我国东北地区的一味名贵药材。人参皂苷是人参的主要活性成分，显示出了一系列生物活性，如抗肿瘤、抗炎和抗衰老等。人参的根、茎叶、花和果实中均含有人参皂苷，但各个部位中人参皂苷的种类和含量不同，迄今为止已从人参各部位分离鉴定的单体人参皂苷已有200余个。人参皂苷F₁是人参皂苷Rg₁和三七皂苷R₁的肠内菌代谢产物，在天然药材中含量较低，目前仅在人参叶及花中分离得到过。人参皂苷主要通过诱导细胞凋亡、抑制血管生成、干扰或调控细胞周期、抑制炎症因子等途径发挥抗肿瘤作用，不同的单体皂苷作用机制不同，所以为了达到最大并能直接发挥其作用的目标，有必要从人参中提取出人参皂苷单体制剂。目前，人参皂苷单体化合物制剂亦是其开发成药物的发展趋势，如人参皂苷Rg₃、Rh₂、C-K等已有上市销售品种。

人参地上部分是不可忽视的宝贵资源，其中人参花是人参含苞待放的花，人参花中的总皂苷含量最高(约5～7％)，部分单体皂苷的含量超过人参根中的十倍(如人参皂苷Re)。研究发现，人参地上部分皂苷成分的药理活性与人参根总皂苷相似，因此人参地上部分尤其是人参花具有很好的药物开发利用前景。

经查阅专利文献得知，截至目前与人参皂苷F₁制备工艺相关的专利公开如下所述。

CN 101012473A-平滑青霉或者疣孢漆斑菌及用其制备人参皂苷F₁的方法。该项发明是一种利用生物转化方法获得人参皂苷F₁的制备工艺。将人参三醇组皂苷或人参皂苷Rg₁，通过与具有水解人参皂苷的菌株平滑青霉或疣孢漆斑菌作用，在自动旋转摇瓶机上震荡，220-240rpm，27-28℃培养72-96小时，得到转化产物。将转化产物离心浓缩，采用石油醚、氯仿、正丁醇混合溶剂萃取，正丁醇部分为粗提取物，再经硅胶柱色谱法，用氯仿-甲醇梯度洗脱薄层色谱跟踪人参皂苷F₁组分，进行纯化，进一步经重结晶，得到高纯度产物。本发明适用于大规模工业化生产，原料成本低。

CN 1869055A-一种从人参叶中分离纯化人参皂苷单体的方法。本项发明公开了从人参叶中提取分离人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rb₂、人参皂苷Rb₃、人参皂苷Rc、人参皂苷Rd、人参皂苷F₂、三七皂苷Fe、人参皂苷Re、人参皂苷Rg₁、人参皂苷Rg₂、人参皂苷F₁，尤其是人参皂苷F₁、人参皂苷F₂、三七皂苷Fe的方法。利用大孔吸附树脂将人参叶中的人参皂苷分成主要由人参皂苷Re和人参皂苷Rg₁组成的混合皂苷A 和主要由人参皂苷F₁、人参皂苷Rg₂、人参皂苷F₂、三七皂苷Fe、人参皂苷Rd、人参皂苷Rb₂、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb₁和人参皂苷Rb₃组成的混合皂苷B，接着用重结晶或氧化铝柱层析的方法获得组成更加简单的人参皂苷混合物，最后通过柱层析的方法获得人参皂苷单体。获得的各种人参皂苷单体可用于制备药物组合物、保健食品及其他产品。

CN 1869052A-一种从人参叶中提取分离人参皂苷混合物的方法。本项发明公开了从人参叶中提取分离含有人参皂苷F₁、人参皂苷F₂、三七皂苷Fe的人参皂苷混合物方法。将人参叶加水煎煮，合并煎煮液，过大孔吸附树脂吸附，用水冲净，85％乙醇洗脱得人参叶总皂苷。将人参叶总皂苷用水溶解后上氧化铝柱，先用水洗脱，洗脱液过大孔吸附树脂吸附，乙醇解吸，回收溶剂，得主要含人参皂苷F1、人参皂苷Rg₂、人参皂苷Rg₁和人参皂苷Re的人参皂苷混合物。获得的人参皂苷混合物可用于制备药物组合物、保健食品及人参皂苷单体。

CN 1869056A-一种从人参叶中提取分离人参皂苷混合物的方法。本项发明公开了从人参叶中提取分离含有人参皂苷F₁、人参皂苷F₂、三七皂苷Fe的人参皂苷混合物方法。将人参叶加水煎煮，合并煎煮液，过大孔吸附树脂吸附，用水冲净，18％乙醇洗脱至洗脱液检测不到人参皂苷Re和人参皂苷Rg₁后改用85％乙醇洗脱至洗脱液检测不到人参皂苷Rd和人参皂苷Rb₁为止。85％乙醇洗脱液直接回收乙醇，获得含有人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rb₂、人参皂苷Rb₃、人参皂苷Rc、人参皂苷Rd、人参皂苷F₁、人参皂苷F₂和三七皂苷Fe的人参皂苷混合物。

上述关于人参皂苷F₁分离制备的专利技术除生物转化的方法可以获得单体化合物以外，其余分离制备的方法均以含有人参皂苷F₁的混合物为主，纯度较低，并且未见有关于从天然植物中制备纯化人参皂苷F₁单体的方法报道。

发明内容

本发明提供了一种人参皂苷F₁单体的纯化制备方法，适用于工业化生产。本发明是从人参花甲醇提取物中分离纯化出单体人参皂苷F₁。由于单体人参皂苷抗肿瘤作用机制不同，为了最大并且直接的发挥其作用，有必要从人参中提取出人参皂苷单体进而开发出制剂。目前，制备单体化合物制剂是人参及其相关制品的一个主要发展趋势。

本发明通过下述技术方案实现，人参皂苷F₁制备方法包括：

(1)人参花总皂苷的制备

取新鲜干燥的人参花，粉碎，用甲醇提取，合并滤液，浓缩，得到甲醇提取物。依次用环己烷、乙酸乙酯萃取，至萃取液颜色明显变浅为止。合并乙酸乙酯萃取物，浓缩，得到含人参皂苷F₁的人参花总皂苷。

(2)样品胶的制备

将人参花总皂苷用甲醇溶解，加入总皂苷质量2-4倍的80～100目硅胶，水浴蒸干至粉末状，成为硅胶柱层析样品胶。

(3)分离胶的制备

取人参花总皂苷质量15-25倍的300～400目硅胶，用氯仿充分溶解，超声20min，搅拌，除气泡制得硅胶分离胶。

(4)洗脱

采用硅胶柱层析，将分离胶均匀加至玻璃柱内，再把样品胶缓慢均匀加至分离胶上层进行硅胶柱层析，分别以氯仿:甲醇:水的体积比为100:10:1，80:10:1，60:10:1， 40:10:1，20:10:1及10:10:1的混合液作为洗脱液，依次进行梯度洗脱，分别收集洗脱流份的同时，采用薄层色谱法检测，收集、合并与人参皂苷F₁阳性对照品Rf值相同的流份溶液，用旋转蒸发仪旋干并保存。

本发明中所述的人参皂苷F₁阳性对照品可以由公共的商业途径获得。

(5)人参皂苷F₁的纯化

将步骤(4)旋干的人参皂苷F₁样品，用50％甲醇水溶液溶解后作为样品备用；称取总皂苷质量30倍的MCI GEL作为分离胶，50％甲醇溶液装柱；先加入两个柱体积的50％甲醇水溶液平衡柱子，再用滴管沿着柱内壁加入备用的样品；依次用50％甲醇， 60％甲醇，70％甲醇混合液进行梯度洗脱，采用薄层色谱法检测，收集、合并与人参皂苷F₁阳性对照品Rf值相同的流份溶液，用旋转蒸发仪旋干并保存。

具体的，在上文所述的制备方法中，薄层色谱法检测的步骤包括：利用薄层层析板Silica gel 602F₂₅₄，以体积比为6:1:0.1的氯仿-甲醇-水混合溶剂作为展开剂，用5％硫酸-乙醇溶液显色。

进一步地，在上述技术方案中，步骤(2)所述的超声除气泡的时间为20min。

进一步地，在上述技术方案中，旋转蒸发仪的水浴温度为40-50℃。

进一步地，在上述技术方案中，总皂苷中含人参皂苷F₁单体约10-15％。

本发明进一步提供了人参皂苷F₁单体在抗肿瘤方面的作用，尤其是对人肺癌、人胃癌和人乳腺癌细胞的体外抑制作用，强于人参皂苷Rg3。

本发明进一步提供了人参皂苷F₁单体在制备抗肿瘤药物中的应用。

进一步地，在上述技术方案中，所述肿瘤包括人肺肿瘤、人胃肿瘤和人乳腺肿瘤。

发明有益效果

1、本发明所选用的原料人参花甲醇提取物来源于纯天然植物人参的花，从中分离一种抗肿瘤作用的有效成分—人参皂苷F₁，其在人参花中的含量达到约1.02％，具备无化学合成药物、无毒副作用、不会产生药物依赖性的特点，因而安全可靠。

2、本发明的工艺易于操作，收率高，纯度高，不引入有毒物质，无毒副作用及药物依赖性，而且高纯度的人参皂苷F₁单体，可以更好的，更加广泛的应用于抗肿瘤药物中。

附图说明

图1为人参花甲醇提取物乙酸乙酯萃取部位的高效液相色谱(HPLC)图。

图2为从人参花中纯化得到的人参皂苷F₁单体的高效液相色谱(HPLC)图。

图3为人参皂苷F₁的核磁共振氢谱(¹H NMR)图。

图4为人参皂苷F₁的核磁共振碳谱(¹³C NMR)图。

图5为人参皂苷F₁的质谱(MS)图。

图6为人参皂苷F₁对三种人肿瘤细胞存活率的影响。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中所用试剂，如无特殊说明，均为商业途径获得；下述实施例中所用试验方法，如无特殊说明，均为本领域技术人员熟知的常规实验方法。

本发明中，对人参皂苷F₁样品进行纯度检测以及结构分析，其条件如下：

纯度检测，是通过HPLC面积归一法对其进行检测，色谱条件：色谱柱，ZorbaxEclipse XDB C-18(5μm；4.6mm i.d.×250mm)；流动相，体积比为60:40的甲醇-水；流速，1.0mL/min；检测波长，203nm；进样量，20μL。

结构分析，选用Orbitrap Elite质谱仪(Thermo Scientific,Bremen,Germany)和Bruker DRX-500型核磁共振仪(TMS作内标，C₅D₅N作溶剂)，对其进行了结构表征，获得了人参皂苷F₁的MS和NMR数据。

我们利用硅胶柱层析法和MCI GEL柱层析法，从人参花中获得了高纯度的人参皂苷F₁，通过药效学实验对3种人肿瘤细胞的抗癌试验证明具有较强的抗肿瘤活性。该制备方法得到的人参皂苷F₁单体纯度高，质量稳定，能用于抗肿瘤药物开发或药物组合物的制备。

实施例1

本发明的目的在于提供一种从人参花甲醇提取物中制备一种抗肿瘤作用的有效成分—人参皂苷F₁的提取纯化方法。具体步骤如下：

(1)人参花总皂苷的制备

取新鲜干燥的人参花4.02kg，粉碎，加16L甲醇溶液加热回流提取，每次2h，共提取3次，合并提取液，减压回收溶剂至干，得甲醇提取物1130g。将甲醇提取物加500mL水，分散溶解，依次用环己烷、乙酸乙酯萃取至溶液颜色明显变浅，将乙酸乙酯萃取液减压回收浓缩，得乙酸乙酯萃取部位355g。此即为含人参皂苷F₁的人参花总皂苷(图1)，收率约8.8％。

(2)制备样品胶

精确称取上述得到的人参花总皂苷5.242g，用30mL甲醇完全溶解，再加入11.061g 80～100目硅胶(用量约为总皂苷质量的2倍)，在50℃的水浴蒸干，同时不断搅拌，勿使结块，直至硅胶呈现出干燥不留手的粉末状态，置于干燥皿干燥，使之成为样品胶。

(3)制备分离胶

称取101.368g 300～400目硅胶(用量约为总皂苷质量的20倍)，用250mL氯仿充分溶解，超声除气泡20min，同时不断搅拌，直至无大量气泡产生。

(4)洗脱

采用硅胶柱层析，将分离胶均匀加至玻璃柱内，再把样品胶缓慢均匀加至分离胶上层进行硅胶柱层析，分别以氯仿:甲醇:水的体积比为100:10:1，80:10:1，60:10:1， 40:10:1，20:10:1及10:10:1的混合液作为洗脱液，依次进行梯度洗脱，分别收集洗脱流份。

(5)薄层色谱(TLC)检测

薄层层析板选用薄层层析板Silica gel 602F₂₅₄,德国Merck公司制品，展开剂选用氯仿-甲醇-水(体积比为7:1:0.1)，显色剂选用5％H₂SO₄-乙醇溶液。合并与人参皂苷F₁对照品(人参皂苷F₁对照品，NIFDC提供)Rf值相同的流份溶液，在60:10:1洗脱流份中，人参皂苷F₁被洗脱出，再用旋转蒸发仪水浴(温度为50℃)旋干，得粗品人参皂苷 F₁质量为0.726g，放入干燥器中保存。

(6)柱层析法纯化人参皂苷F₁

将步骤(5)分离得到的人参皂苷F₁粗品0.726g，用2mL 50％甲醇水溶液完全溶解。称取20.556g MCI GEL(F型75-150u，成都科谱生物有限公司)作为分离胶，用量约为样品质量的30倍，50％甲醇装柱。先用50％甲醇洗脱2个柱体积以平衡柱子，然后用滴管沿着柱内壁加样。依次用50％甲醇，60％甲醇，70％甲醇混合液进行梯度洗脱，采用薄层色谱法检测，发现60％甲醇洗脱液后半段有人参皂苷F₁洗脱出来，收集、合并与人参皂苷F₁阳性对照品Rf值相同的流份溶液，用旋转蒸发仪(水浴温度为50℃) 旋干，得人参皂苷F₁0.589g。从人参花总皂苷到分离纯化得到单体皂苷的总收率约 11.2％。

实施例2

(1)纯度检测

采用高效液相色谱(HPLC)法对经柱层析法纯化得到的人参皂苷F₁进行检测，其纯度为95.17％(图2)。色谱条件：色谱柱，Zorbax Eclipse XDB C-18(5μm；4.6mm i.d.×250mm)；流动相，甲醇:水体积比为60:40；流速，1.0mL/min；检测波长，203nm；进样量，20μL。此色谱条件下，人参皂苷F₁标准曲线回归方程为y＝2.428x-21.466，R＝ 0.9999；进样量在0.3μg～20μg范围内具有良好的线性关系。

(2)人参皂苷F₁的结构分析

采用高分辨质谱法和核磁共振波谱法，对经纯化后的产物进行了结构表征，获得了人参皂苷F₁的MS和NMR波谱特征。选用的仪器为Orbitrap Elite质谱仪(ThermoScientific,Bremen,Germany)和Bruker DRX-500型核磁共振仪(TMS作内标，C₅D₅N作溶剂)，实验结果分析如下。

高分辨质谱图结果分析：

人参皂苷F₁的高分辨质谱如图5所示。图谱中m/z 661.4279[M+Na]⁺(计算值661.4291；C₃₆H₆₂O₉Na)，说明其分子式为C₃₆H₆₂O₉，与结果相符合。

核磁共振波谱法结果分析：

人参皂苷F₁为白色无定形粉末，5％硫酸乙醇显色斑点呈紫色；Liberman-Burchard 反应阳性。

在人参皂苷F₁的¹H NMR(C₅D₅N)(图3)和¹³C NMR(C₅D₅N)(图4)谱中可看到：¹H NMR(400MHz,C₅D₅N)δ1.00，1.04，1.12，1.47，1.62，1.62，1.64，2.00(each 3H,s, CH₃)，芳香区δ5.26(1H,t,J＝6.1Hz,H-24)为H-24双键上的特征信号。此外δ5.20(1H, d,J＝6.4Hz)为葡萄糖基的端基氢信号。¹³C NMR(100MHz,C₅D₅N)谱中共给出36个碳信号，其中30个碳信号为苷元，经与文献对照，为20(S)-原人参三醇。其余6个信号为葡萄糖基信号：δ98.28，78.51，78.25，75.16，71.78，62.99。¹³C NMR(100MHz,C₅D₅N) 数据见下表。

经过上述检测数据证明，本发明所获的样品为人参皂苷F₁，其分子结构为(Ⅰ) 即本发明中所指的人参皂苷F₁化学结构；

本发明通过下面的药效学实验进一步说明其抗肿瘤作用。

实施例3

MTT(四唑盐)法测定人参皂苷F₁对人肿瘤细胞的杀伤作用。

(1)试验设计

使用的肿瘤细胞株：A549人非小细胞肺癌细胞、MGC80-3人胃癌细胞、MCF-7 人乳腺癌细胞三种人肿瘤细胞系(采用的细胞培养液分别为RPMI 1640培养液、DMEM 培养液、MEM培养液)。

试验分组：

人参皂苷F₁组：1、25、50、100、200μg/L；

人参皂苷Rg₃组：1、25、50、100、200μg/L；

空白对照组：细胞培养液；

溶剂对照组：细胞培养液及DMSO；

阳性对照组：5-氟尿嘧啶(10μg/L)

(2)方法

取对数生长期细胞，加入0.25％胰蛋白酶消化，600r/min离心10min，调整细胞浓度为6×10⁴个/mL，接种于96孔培养板中(边缘孔用无菌PBS填充)，每孔90μL。培养24h后，加入样品人参皂苷F₁(样品溶解于DMSO中，用培养基逐步稀释，加入细胞中药液的DMSO终浓度低于1％)，使细胞液终浓度达到1、25、50、100、200μg/L，每组均设3个平行孔。于37℃5％CO₂培养箱共同培养48h。每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL，溶解于PBS中)，继续培养4h后，终止培养。小心吸弃上清液，每孔加入150μL DMSO，震荡10min，使结晶物充分溶解。用酶标仪在570nm处测每孔的吸光值(A)，计算出细胞存活率：细胞存活率％＝加样品A值/对照细胞A值×100％。

(3)结果

实验结果表明，人参皂苷F₁对三种人肿瘤细胞系均具有较强的细胞杀伤作用。结果见图6。与人参皂苷Rg3相比，作用明显增强。结果见表1-3。

表1 对A549人非小细胞肺癌细胞的影响

表2 对MGC80-3人胃癌细胞的影响

表3 对MCF-7人乳腺癌细胞的影响

综上所述，目前，我们发现人参皂苷F₁单体是人参花中含量较高的一种具抗肿瘤活性的皂苷成分，随着单体化合物制剂的发展趋势，其在抗肿瘤药物研发中具有广阔前景。本发明是从人参花甲醇提取物的总皂苷中分离，纯化出单体人参皂苷F₁。本发明的工艺易于操作，收率高，纯度高，不易引入有毒物质，无毒副作用及药物依赖性，人参皂苷F₁单体可以广泛应用于抗肿瘤药物或药物组合物中。

Claims (6)

1.一种从人参花中提取、制备人参皂苷F₁的方法，其特征在于由以下步骤组成：

(1)称取新鲜干燥后的人参花，粉碎；

(2)加入3-5倍重量的甲醇，加热回流提取2h，提取3-5次，离心过滤，去除残渣，得滤液；

(3)将滤液在50℃以下减压浓缩，制成浸膏或干粉，回收溶剂甲醇；

(4)在浸膏或干粉中加入0.2-0.5倍重量的水，分散溶解，依次用环己烷、乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯萃取液，减压浓缩得到人参花总皂苷；

(5)先将人参花总皂苷样品溶解于甲醇中与2-4倍重量的80～100目硅胶搅拌混匀，水浴蒸干，制得样品胶；然后取人参花总皂苷质量15-25倍重量的300～400目硅胶，用氯仿充分溶解，制得硅胶分离胶，再把样品胶缓慢均匀加至分离胶上层进行硅胶柱层析，分别以氯仿:甲醇:水的体积比为100:10:1，80:10:1，60:10:1，40:10:1，20:10:1及10:10:1的混合液作为洗脱液，依次进行梯度洗脱，分别收集洗脱流份的同时，采用薄层色谱法检测，收集、合并与人参皂苷F₁阳性对照品Rf值相同的流份溶液；减压浓缩回收溶剂后进行MCIGEL柱层析，依次用50％甲醇，60％甲醇，70％甲醇混合液进行梯度洗脱，收集、合并与人参皂苷F₁阳性对照品Rf值相同的流份溶液，用旋转蒸发仪旋干得人参皂苷F₁单体。

2.根据权利要求1所述提取方法，其特征在于：步骤(2)中，甲醇含量为98％-100％。

3.根据权利要求1所述提取方法，其特征在于：步骤(4)中得到的人参花总皂苷中人参皂苷F₁含量为10％-15％。

4.根据权利要求1所述提取方法，其特征在于：步骤(5)中，旋转蒸发仪浓缩的水浴温度为40℃-50℃。

5.根据权利要求1所述提取方法，其特征在于：步骤(5)中，MCIGEL柱层析所用的填料为MCIGELF型，粒度75-150u。

6.根据权利要求1所述提取方法，其特征在于：步骤(5)中得到的人参皂苷F₁单体纯度为不低于95.17％。