CN102718827B

CN102718827B - 一种分离和纯化人参皂苷Rb3的方法

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Publication number: CN102718827B
Application number: CN201210215470.0A
Authority: CN
Inventors: 弓晓杰; 陈丽荣; 李珂珂; 马畅; 盖鑫
Original assignee: Dalian University
Current assignee: Beijing Zhong Yun Xinhe Technology Co.,Ltd.; JILIN SHENWEI GEN-SENG PRODUCTS TECHNOLOGY CO.,LTD.
Priority date: 2012-06-27
Filing date: 2012-06-27
Publication date: 2014-07-16
Anticipated expiration: 2032-06-27
Also published as: CN102718827A

Abstract

本发明涉及中药生物活性成分的提取制备方法，具体涉及一种降血糖作用有效成分——人参皂苷Rb₃的分离、纯化方法。本发明以人参茎叶总皂苷为原料，将其用甲醇与硅胶混溶后，水浴蒸干，制备成粉末状样品胶。利用干法上样，解决了人参茎叶总皂苷难溶解的问题。采用柱层析法分离、纯化制备出高纯度的人参皂苷Rb₃。本发明具有制备工艺易于操作，收率高，不引入有毒物质，成本低廉等特点，产品可以用于治疗和预防糖尿病。对功能化人参皂苷的制备、开发的研究具有非常重要的意义。

Description

一种分离和纯化人参皂苷Rb3的方法

技术领域

本发明属于中药活性成分的分离和纯化方法领域，具体涉及人参皂苷Rb₃的分离和纯化方法。

背景技术

糖尿病是现代人类所面临的一个主要的健康问题。据资料统计，目前世界上已有3%的人口患有糖尿病，糖尿病已被列为世界前十位“杀手”之一，所以，积极预防和治疗糖尿病已迫在眉睫。现代流行病研究表明了：高血糖是糖尿病患者伴有并发症的主要原因。预防和抵抗糖尿病并发症，改善糖尿病患者生活质量的关键是有效地控制血糖。人参(Panax ginseng C.A.Mey.)系五加科(Araliaceae)人参属(Panax)植物，是特产于我国的一味珍贵药材。在《神农本草经》中云：“人参，味甘，微寒。主补五脏，安精神、定魂魄、止惊悸；除邪气；明目，开心益智。久服轻身延年。”人参多年来被用作贵重的药物治疗各种虚弱病症、补血等，而临床试验有力的证明了人参及其有效活性成分人参皂苷具有抗糖尿病的作用。其通过抑制食欲、减缓肠道对葡萄糖和脂肪的吸收；影响糖脂代谢通路，增加葡萄糖的摄取及消耗，增强葡萄糖刺激的胰岛素分泌和抗胰岛B细胞的凋亡等途径达到降低血糖的治疗目标。由于单体皂苷作用机制不同，所以为了达到最大并且直接的发挥其作用的目标，有必要从人参中提取出人参皂苷单体制剂。目前，单体化合物制剂是人参及其制品的一个主要发展趋势。而且人参地上部位是不可忽视的宝贵资源，人参茎叶含有大量的人参总皂苷(约7%~16%)，且皂苷成分和药理活性与人参根总皂苷相似，因此人参地上部位具有很好的开发利用前景。

经查阅专利文献得知，截至目前已经有如下所述关于人参皂苷制备工艺的专利公开。

CN 1765917A-人参皂苷Rb₂的制备工艺。该项发明是一种人参皂苷Rb₂的制备工艺。将鲜人参粉碎，室温下用乙醇冷浸提取，减压回收溶剂，浓缩为水溶液，向浓缩液中加入氢氧化钠或氢氧化钾或氢氧化铵，水解后上大孔树脂柱，先用水洗，再用乙醇洗脱，得到总皂苷，用正丁醇萃取得人参二醇组皂苷；采用ODS加压柱层析法，将人参二醇组皂苷上样，洗脱液用乙醇、水，梯度洗脱，回收溶剂后冻干得到人参皂苷Rb₂粗品，再经乙醇和正丁醇重结晶，得到单体人参皂苷Rb₂。该工艺采用可进行工业化生产的柱层析加压办法，分离、制备人参单体皂苷Rb₂。

CN 101463061A-三七中人参皂苷Rg₁、Rb₁及其总皂苷的制备方法。该发明以中药三七的新鲜药材、干燥后药材以及市售药材为原料，根据化合物的极性和溶解度性质，采用溶剂提取法、溶剂萃取法、结晶法、色谱层析法分离纯化、结合减压浓缩干燥、冷冻干燥、真空干燥等常用干燥方法制备成三七人参总皂苷粉末，该粉末经重结晶、正相、反相硅胶柱层析、柱聚酰胺柱层析、葡聚糖凝胶层析等以上方法中的一种或几种合用制备出人参皂苷Rg₁和人参皂苷Rb₁单体。

CN 101032535-从西洋参叶、人参叶中共同提取分离纯化人参皂苷有效部位及其制备方法。本发明涉及一种中药及提取加工领域，是从西洋参叶、人参叶中共同提取分离纯化人参皂苷有效部位及其制备方法。该方法是将西洋参叶、人参叶按1:0.3比例共同进行水提取，经处理后的水提取液上大孔吸附树脂柱吸附，用水洗脱除杂质，用俩种洗脱剂，分别进行洗脱，分别收集洗脱液，总固物再精制纯化即得，纯度达63.45%。具有副作用小，适用人群广泛，特别适用于复方药物制剂、功能食品及分离人参皂苷单体上的应用。

CN 1869051A-一种三醇组人参皂苷和二醇组人参皂苷的制备方法。本项发明公开了从人参或红参中制备出二醇组人参皂苷和三醇组人参皂苷的方法。即人参或红参中的人参皂苷Ra₁、人参皂苷Ra₂、人参皂苷Ra₃、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rb₂、人参皂苷Rb₃、人参皂苷Rc、人参皂苷Rd等二醇组人参皂苷同人参皂苷Rg₁、人参皂苷Re等三醇组人参皂苷分离从而制备二醇组人参皂苷和三醇组人参皂苷的方法。将人参或红参提取物用大孔吸附树脂吸附后先用低浓度有机溶剂的水溶液洗脱，然后用高浓度有机溶剂的水溶液洗脱，分别收集洗脱液，回收溶剂，即可获得三醇组人参皂苷和二醇组人参皂苷。

上述关于人参皂苷分离制备的专利技术普遍工艺比较复杂，而且收率较低，并且未见有关于人参皂苷Rb₃纯化方法的报道。

发明内容

本发明是从人参茎叶总皂苷中分离，纯化出单体人参皂苷Rb₃。由于单体皂苷作用机制不同，为了最大并且直接的发挥其作用，所以有必要从人参中提取出人参皂苷单体制剂。目前，制备单体化合物制剂是人参及其相关制品的一个主要发展趋势。

本发明通过下述技术方案实现，人参皂苷Rb₃制备方法包括：

(1)样品胶的制备

将人参茎叶总皂苷用甲醇溶解，加入总皂苷质量2倍的80～100目硅胶，水浴蒸干至粉末状，成为样品胶；

人参茎叶总皂苷是市售产品，可以由商业途径获得。

(2)分离胶的制备

取人参茎叶总皂苷质量20倍的300～400目硅胶，用二氯甲烷充分溶解，超声20min，搅拌，除气泡制得分离胶；

(3)装柱

干法上样将步骤（2）获得的分离胶装入到底部有玻璃棉的玻璃柱内，再装入步骤（1）获得的样品胶，最后装入一层石英砂，备用；

(4)洗脱

分别以甲醇和二氯甲烷的体积比为1:4,3:7,2:3,1:1的混合液作为洗脱液，依次进行梯度洗脱，分别收集洗脱流份的同时，采用薄层色谱法检测，收集、合并与人参皂苷Rb₃阳性对照品Rf值相同的流份溶液，用旋转蒸发仪旋干并保存；

本发明中所述的人参皂苷Rb₃阳性对照品可以由公共的商业途径获得。

(5)人参皂苷Rb₃的纯化

步骤（4）获得的人参皂苷Rb₃，用40%甲醇水溶液溶解后作为样品备用；称取总皂苷质量35倍的ODS硅胶作为分离胶，甲醇装柱；先加入两个柱体积的40%甲醇水溶液，再用滴管沿着柱内壁加入备用的样品；用甲醇与水体积比为2:3,9:11,11:9,13:7,3:1的混合溶剂依次进行梯度洗脱，采用薄层色谱法检测，收集、合并与人参皂苷Rb₃阳性对照品Rf值相同的流份溶液，用旋转蒸发仪旋干并保存；

具体的，在上文所述的制备方法中，薄层色谱法检测的步骤包括：利用薄层层析板Silica gel 602F₂₅₄，以体积比为7:15:0.5的甲醇-二氯甲烷-三乙胺混合溶剂作为展开剂，用5％硫酸-乙醇溶液显色。

具体的，在上文所述的制备方法中，步骤(2)所述的超声除气泡的时间为20min。

具体的，在上文所述的制备方法中，旋转蒸发仪的水浴温度为50℃。

本发明中，对利用上述方法制备的人参皂苷Rb₃样品进行纯度检测以及结构分析，其结果如下：

纯度检测，是通过HPLC面积归一法对其进行检测，色谱条件：色谱柱， -C18(3.9mm×150mm,4μm)；流动相，体积比为65:35:1的甲醇-水-磷酸；流速，1.0mL/min；检测波长，203nm；进样量，20μL。

结构分析，选用仪器Nicolet 550型傅里叶变换红外光谱仪(Nicolet company USA)和Bruker DRX-500型核磁共振仪(TMS作内标，CD3OD作溶剂)，对其进行了结构表征，获得了人参皂苷Rb₃的IR和NMR波谱数据。

有益效果：

1本发明所选用的原料人参茎叶总皂苷来之于纯天然植物人参茎叶，从中分离一种降血糖作用的有效成分——人参皂苷Rb₃，无化学合成药物，无毒副作用，不会产生药物依赖性，因而安全可靠。

2本发明的工艺易于操作，收率高，不引入有毒物质，无毒副作用及药物依赖性，而且高纯度的人参皂苷Rb₃单体，可以更好的，更加广泛的应用于糖尿病的治疗或预防的药物中。

附图说明

图1为提取、分离和纯化人参皂苷Rb₃的实验装置示意图，其中：

1为层析柱，实施例中选用聚四氟乙烯活塞玻璃柱，径长比一般为1:10～1:20，内壁光滑均匀，上下粗细一致，管壁无裂缝，活塞密封良好；

2为玻璃棉，防止硅胶被洗脱液冲洗出柱子；

3为石英砂，在添加溶剂的时候，使样品层保持整齐；

4为样品胶，人参茎叶总皂苷作为样品，其溶解性差，能溶解的溶剂又不能上柱，这时就必须用干法上柱。加入样品中硅胶的量越少越好，通常是样品的2-3倍，但是要保证在旋干后，不能看到明显的固体颗粒，否则说明样品没有完全吸附在硅胶上；

5为分离胶，采用300～400目硅胶作固定吸附剂，吸附剂对溶剂及样品中的各组分的吸附能力不同，故在吸附剂表面，组分分子与溶剂分子对吸附剂表面活性中心发生吸附竞争，整个层析过程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸过程；

6为洗脱液，采用甲醇和二氯甲烷的混合溶剂作洗脱液，使用单一溶剂，往往不能达到很好的分离效果，使用混合溶剂通常用一个高极性和低级性溶剂组成的混合溶剂，根据人参茎叶总皂苷结构与所选用的硅胶吸附剂的极性，以确定洗脱液及其混合溶剂比例。

图2为人参皂苷Rb₃的红外吸收光谱(IR)图。

图3为人参皂苷Rb₃的核磁共振氢谱(¹H NMR)图。

图4为人参皂苷Rb₃的核磁共振碳谱(¹³C NMR图)。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中所用试剂，如无特殊说明，均为商业途径获得，或者以常规实验方法配制；下述实施例中所用试验方法，如无特殊说明，均为本领域技术人员熟知的常规实验方法。

实施例1

本发明的目的在于提供一种从人参茎叶总皂苷中提取一种降血糖作用的有效成分——人参皂苷Rb₃的提取方法。具体步骤如下：

(1)制备样品胶

精确称取人参茎叶总皂苷3.167g，用20mL甲醇完全溶解，再加入6.447g 80～100目硅胶（用量约为总皂苷质量的2倍），在50℃的水浴蒸干，同时不断搅拌，勿使结块，直至硅胶呈现出干燥不留手的粉末状态，置于干燥皿干燥，使之成为样品胶。

(2)制备分离胶

称取60.641g 300～400目硅胶（用量约为总皂苷质量的20倍），用200mL二氯甲烷充分溶解，超声除气泡20min，同时不断搅拌，直至无大量气泡产生。

(3)装柱

干法上样：柱层析法分离、纯化人参皂苷Rb₃的实验装置图如图1所示。用口径较大的玻璃漏斗慢慢将步骤（2）制备的分离胶装入到底部有玻璃棉的玻璃柱内，尽量均匀地倾入，且保持上表面水平，同时打开活塞，先让分离胶自然走柱一个硅胶柱体积的洗脱液，再加压走三个硅胶柱体积的洗脱液把硅胶抽实。再用漏斗慢慢装入样品胶，铺放均匀，保持上面水平，最上层放上一层石英砂，厚度约1cm，备用；其中，上述装柱过程所用的洗脱液为甲醇和二氯甲烷以1:4的体积比混合。

(4)洗脱

为了分离制得较纯人参皂苷Rb₃，采用甲醇和二氯甲烷的混合溶剂作为洗脱液，按照甲醇与二氯甲烷体积比为1:4,3:7,2:3,1:1的混合比依次进行梯度洗脱，分别收集洗脱流份。

(5)薄层色谱(TLC)检测

薄层层析板选用薄层层析板Silica gel 602F₂₅₄,德国Merck公司制品，展开剂选用甲醇-二氯甲烷-三乙胺(体积比为7:15:0.5)，显色剂选用5%H₂SO₄-乙醇溶液。合并与人参皂苷Rb₃对照品(人参皂苷Rb₃对照品，NIFDC提供)Rf值相同的流份溶液，再用旋转蒸发仪水浴(温度为50℃)旋干，得粗品人参皂苷Rb₃质量为1.222g，放入干燥的容器中保存。

(6)柱层析法纯化人参皂苷Rb₃

精确称取经过步骤(5)分离得到的人参皂苷Rb₃粗品1.008g，用3mL 40%甲醇水溶液完全溶解。称取35.055g ODS硅胶(日本YMC C18 ODS-A)作为分离胶，用量约为样品质量的35倍，甲醇装柱。装好柱子后先加入150mL 40%甲醇-水溶液进行洗脱剂置换，然后用滴管沿着柱内壁加样。本实验选用甲醇和水的混合溶剂作为洗脱液，采用甲醇与水体积比为2:3,9:11,11:9,13:7,3:1的混合比依次进行梯度洗脱。收集合并与人参皂苷Rb₃对照品Rf值相同的流份溶液，用旋转蒸发仪(水浴温度为50℃)旋干，得人参皂苷Rb₃0.301g。

实施例2

(1)纯度检测

采用高效液相色谱(HPLC)法对经柱层析法纯化得到的人参皂苷Rb₃进行检测，其纯度为90.17%。色谱条件：色谱柱， -C₁₈(3.9mm×150mm,4μm)；流动相，甲醇:水:磷酸体积比为65:35:1；流速，1.0mL/min；检测波长，203nm；进样量，20μL。此色谱条件下，人参皂苷Rb₃标准曲线回归方程为y=445193.3113x-175865.1971，R=0.9999；进样量在0.8μg~20μg范围内具有良好的线性关系。

(2)人参皂苷Rb₃的结构分析

采用红外吸收光谱法和核磁共振波谱法，对经纯化后的产物进行了结构表征，获得了人参皂苷Rb₃的IR和NMR波谱特征。选用的仪器为Nicolet 550型傅里叶变换红外光谱仪(Nicolet company USA)和Bruker DRX-500型核磁共振仪(TMS作内标，CD₃OD作溶剂)，实验结果分析如下。

红外吸收光谱法结果分析：

人参皂苷Rb₃的红外吸收光谱如图2所示。图谱中其特征谱带分别在3421cm^-1表示有羟基存在；1653cm^-1表示有碳碳双键存在；2924cm^-1左右表示有次甲基存在；1461和1384cm^-1表示有甲基和亚甲基存在；1079cm^-1左右表示有碳碳单键存在；1040cm^-1附近表示有醚键存在。

核磁共振波谱法结果分析：

人参皂苷Rb₃为白色无定形粉末，5%硫酸乙醇显色斑点呈紫色；Liberman-Burchard反应阳性。

在人参皂苷Rb₃的¹HNMR(CD₃OD)(图3)和¹³C NMR(CD₃OD)(图4)谱中可看到：¹HNMR(500MHz,CD₃OD)δ0.86，0.92，0.92，1.01，1.08，1.37，1.63，1.69(each 3H,s,CH₃)，芳香区δ5.14(1H,t,J=6.7Hz,H-24)为H-24双键上的特征信号。此外δ4.69(1H,d,J=7.7Hz)，δ4.58(1H,d,J=7.9Hz)，δ4.45(1H,d,J=7.2Hz)和δ4.32(1H,d,J=7.3Hz)分别为四个糖的端基氢信号。¹³C NMR(125MHz,CD₃OD)谱中共给出53个碳信号，其中30个碳信号为苷元，经与文献对照，为20(S)-原人参二醇。其余信号为糖基信号，包括3个葡萄糖基：δ104.5，85.0，77.9，71.6，81.2，62.9；δ105.5，77.4，78.3，71.1，78.4，63.1；δ98.1，75.2，78.5，71.5，77.7，70.1；一个木糖基：δ105.4，74.8，77.9，71.6，66.7。¹³C NMR(125MHz,CD₃OD)数据见下表。

No.	δ_C	No.	δ_C
				1	39.3	3-Glc
2	26.8	1	104.5
				3	89.0	2	85.0
4	39.8	3	77.9
				5	56.5	4	71.6
6	18.6	5	81.2
				7	35.9	6	62.9
8	40.2	-Glc
				9	50.4	1	105.5
10	37.0	2	77.4
				11	30.8	3	78.3
12	70.3	4	71.1
				13	49.4	5	78.4
14	51.5	6	63.1
				15	31.0	20-Glc
16	26.9	1	98.1
				17	51.7	2	75.2
18	16.4	3	78.5
				19	16.1	4	71.5
20	83.6	5	77.7
				21	22.4	6	70.1
22	36.3	-Xyl
				23	23.3	1	105.4
24	126.0	2	74.8
				25	132.2	3	77.9
26	25.9	4	71.6
				27	18.1	5	66.7
28	28.2
				29	16.7
30	17.6

经过上述检测数据证明，本发明所获的样品为人参皂苷Rb₃，其分子结构为(Ⅰ)即本发明中所指的人参皂苷Rb₃化学结构；

综上所述，目前，人参皂苷Rb₃单体是人参降血糖作用的主要有效成分，制备单体化合物制剂是人参及其相关制品的一个主要发展趋势。本发明是从人参茎叶总皂苷中分离，纯化出单体人参皂苷Rb₃。本发明的工艺易于操作，收率高，不引入有毒物质，无毒副作用及药物依赖性，人参皂苷Rb₃单体皂苷可以广泛的应用于糖尿病的治疗或预防的药物中。

Claims

1.一种人参皂苷Rb₃的制备方法，其操作步骤包括：

(1)样品胶的制备

(2)分离胶的制备

取人参茎叶总皂苷质量20倍的300～400目硅胶，用二氯甲烷充分溶解，超声、搅拌，除气泡制得分离胶；

(3)装柱

干法上样，将步骤(2)获得的分离胶装入到底部有玻璃棉的玻璃柱内，再装入步骤(1)获得的样品胶，最后装入一层石英砂，备用；

(4)洗脱

(5)人参皂苷Rb₃的纯化

步骤(4)获得的人参皂苷 Rb₃，用40%甲醇水溶液溶解后作为样品备用；称取总皂苷质量35倍的ODS硅胶作为分离胶，甲醇装柱；先加入两个柱体积的40%甲醇水溶液，再用滴管沿着柱内壁加入备用的样品；用甲醇与水体积比为2:3,9:11,11:9,13:7,3:1的混合溶剂依次进行梯度洗脱，采用薄层色谱法检测，收集、合并与人参皂苷Rb₃阳性对照品Rf值相同的流份溶液，用旋转蒸发仪旋干并保存；

其中，所述薄层色谱法检测的步骤包括：利用薄层层析板Silica gel 602F₂₅₄，以体积比为7:15:0.5的甲醇-二氯甲烷-三乙胺混合溶剂作为展开剂，用5％硫酸-乙醇溶液显色。

2.根据权利要求1所述的一种人参皂苷Rb₃的制备方法，其特征在于：步骤(2)超声的时间为20 min。

3.根据权利要求1所述的一种人参皂苷Rb₃的制备方法，其特征在于：旋转蒸发仪的水浴温度为50 ℃。