CN105998154B - 狭山野豌豆中总黄酮的制备方法 - Google Patents

狭山野豌豆中总黄酮的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及狭山野豌豆中总黄酮的制备方法。采用的技术方案是：取狭山野豌豆药材粉末，以40‑95％的乙醇水溶液为溶剂，液料比为1:10‑20，70‑90℃下提取，得提取液。选取填充有弱极性‑中等极性大孔吸附树脂的吸附柱，上样总黄酮浓度为0.21‑3.18mg/mL，调节pH为1‑8，上样于吸附柱，上样体积为4‑6倍树脂柱床体积，调节吸附流速为2‑6mL/min进行动态吸附，以30‑95％的乙醇水溶液，2‑6mL/min流速进行洗脱，收集洗脱液。本发明总黄酮大孔吸附树脂制备方法，总黄酮的收率高，解吸条件比较温和、使用周期长、再生简便、提取率高、成本低，适于工业化生产的推广和应用。

Description

狭山野豌豆中总黄酮的制备方法
技术领域
本发明属于中药提取领域，具体地涉及一种狭山野豌豆中药有效部位的制备方法。
背景技术
狭山野豌豆(V.amoena Fisch.var.angusta Freyn.)为豆科(Leguminosae)野豌豆属(Vicia L.)植物，主要分布在我国东北、华北、西北等地，其地上部分作为中药透骨草入药。2015年版《中国药典》一部中收载的中成药“坎离砂”、“养血荣筋丸”、“疏痛安涂膜剂”处方中均有透骨草，且四部附录(成方制剂中本版药典未收载的药材和饮片)中收录了狭山野豌豆V.amoena Fisch.var.angusta Freyn.作为透骨草使用。
狭山野豌豆“味甘、性平”，“能补、能和、能缓”，属于补肝肾型祛风湿药，其祛风湿作用是通过调节免疫，进而补益肝肾，达到祛风湿的目的。狭山野豌豆中黄酮类物质是其免疫调节的活性部位之一，总黄酮通过调节免疫，发挥补益肝肾、祛风湿的功效。现有技术中，总黄酮的提取方法主要有pH梯度萃取法、乙酸乙酯萃取法、碱提酸沉法，提取率低。所以，优化狭山野豌豆中总黄酮富集工艺，建立质量控制方法，可以为狭山野豌豆这一东北丰富植物资源的开发与利用提供科学依据。
发明内容
本发明的目的是建立狭山野豌豆总黄酮的制备方法。
本发明采用的技术方案是：狭山野豌豆中总黄酮的制备方法，包括提取步骤，方法如下：取狭山野豌豆药材粉末，以40-95％的乙醇水溶液为溶剂，液料比为1:10-20，提取温度为70-90℃，提取1-3次，每次提取时间为1-1.5小时，得提取液。
优选的，所述的提取步骤为：取狭山野豌豆药材粉末，以70％的乙醇水溶液为溶剂，液料比为1:20，提取温度为90℃，提取2次，每次提取时间为1小时，得提取液。
上述的狭山野豌豆中总黄酮的制备方法，包括纯化步骤，方法如下：将提取液旋转蒸发得浓缩液，将浓缩液加水至浓度为0.21-3.18mg/mL，得上样液，调节上样液的pH为1-8；选取填充有大孔吸附树脂的吸附柱，上样液上样于吸附柱，上样体积为4-6倍树脂柱床体积，调节吸附流速为2-6mL/min进行动态吸附，以30-95％的乙醇水溶液作为洗脱剂，以2-6mL/min流速进行洗脱，以5-12倍树脂柱床体积洗脱液洗脱，收集洗脱液。
优选的，所述的纯化步骤为：将提取液旋转蒸发得浓缩液，将浓缩液加水至浓度为0.39mg/mL，得上样液，调节上样液的pH为5-6；选取填充有大孔吸附树脂的吸附柱，上样液上样于吸附柱，上样体积为5倍树脂柱床体积，调节吸附流速为2mL/min进行动态吸附，以70％的乙醇水溶液作为洗脱剂，以3mL/min流速进行洗脱，以10倍树脂柱床体积洗脱液洗脱，收集洗脱液。
上述的狭山野豌豆中总黄酮的制备方法，所述的大孔吸附树脂是HPD-826型大孔吸附树脂。
本发明的原理是：本发明首次对狭山野豌豆中总黄酮的制备方法进行了优化，采用大孔吸附树脂富集总黄酮，采用正交设计考察了药材提取溶剂、料液比、提取时间、提取次数，建立了最佳的提取工艺；考察了树脂类型、上样浓度、pH值、上样体积、吸附流速、洗脱剂、洗脱流速、洗脱体积，建立最佳的纯化工艺。
本发明的有益效果是：本发明，总黄酮大孔吸附树脂制备方法和其他方法相比，总黄酮的收率高于pH梯度萃取法、乙酸乙酯萃取法、碱提酸沉法；大孔树脂具有物理稳定性高、不受无机物存在的影响、吸附选择性好、解吸条件比较温和、使用周期长、再生简便、提取率高、成本低等特点，适于狭山野豌豆总黄酮的制备，也适合工业化生产的推广和应用。
具体实施方式
实施例1狭山野豌豆总黄酮的制备方法
1)提取：取狭山野豌豆药材粉末10g，70％的乙醇水溶液200mL(液料比为1:20)，提取温度为90℃，提取2次，每次提取时间为1小时，得提取液；
2)纯化：选取填充有HPD-826型大孔吸附树脂的吸附柱(Φ1.5cm×20cm，10g)，将步骤1)获得的提取液旋转蒸发回收乙醇，得浓缩液，浓缩液加水调节浓度为0.39mg/mL，用HCl调节样品水溶液pH为5.5，上样体积为5倍树脂柱床体积，调节流速为2mL/min进行动态吸附，洗脱剂为70％乙醇水溶液，以3mL/min流速进行洗脱，洗脱体积为10倍树脂床体积，收集洗脱液。
3)以金丝桃苷、异槲皮苷、山柰苷、槲皮苷及山柰酚-3-O-α-L-阿拉伯糖作为检测物，测定洗脱液中总黄酮的含量,得总黄酮34.01mg。
实施例2提取步骤的优化
(一)提取溶剂的影响
精密称取狭山野豌豆药材粉末(4号筛)5g，共7份，置250ml锥形瓶中，分别加入40％、50％、60％、70％、80％、95％乙醇水溶液75ml(料液比为1：15)，90℃，加热1小时，提取2次，提取液合并，蒸干，甲醇溶解，定容至50ml。测定提取液中总黄酮的含量，结果如表1。
表1提取试剂考察结果
Figure BDA0001019743280000031
(二)提取条件的影响
提取溶剂浓度为70％乙醇水溶液。以提取温度、料液比、提取时间、提取次数4个因素进行正交试验设计，因素水平见表2，L9(34)正交设计试验方案及结果分析见表2、表3和表4。
表2正交试验设计因素水平表
Figure BDA0001019743280000032
表3正交设计试验结果
Figure BDA0001019743280000033
表4方差分析表
Figure BDA0001019743280000034
影响狭山野豌豆总黄酮提取效率的因素依次为：液料比(B)、提取次数(D)、提取温度(A)、提取时间(C)。综合考虑节省能源、节约时间等因素，确定最佳提取工艺，即采用70％乙醇水溶液，提取温度为90℃，液料比为1:20，提取次数为2次，提取时间为每次1h。
实施例3纯化步骤的优化
(一)大孔吸附树脂对狭山野豌豆总黄酮的影响
考察的树脂型号为HPD-750、HPD-600、HPD-826、HPD-5000、ADS-17、ADS-7、AB-8、D101、X-5、DM-130。精密称取10种经过预处理的大孔树脂各1g(干燥无水)，置于50mL锥形瓶中，分别加入50mL生药浓度为0.17g/mL溶液(5种黄酮苷浓度C0为0.6404mg/mL),时时振摇(120r/min)，振摇2小时，滤过，取续滤液，测定5个黄酮苷含量，得浓度C1。取上述滤过得到的10种大孔树脂，分别置于50mL锥形瓶中，分别加入50mL70％乙醇水溶液，时时振摇(120r/min)，振摇2小时，滤过，取续滤液，测定5个黄酮苷含量，得浓度C2，计算，结果见表5。
表5 10种大孔树脂静态吸附与解吸附试验结果
Figure BDA0001019743280000041
(二)上样浓度对狭山野豌豆总黄酮的影响
称取5份经过预处理的HPD-826型大孔树脂各10g(干燥)湿法装于各层析柱(Φ1.5cm×20cm)中，取0.2g/mL生药浓度的样品20mL，共5份，分别经过稀释或浓缩至不同浓度，超声溶解，使样品充分溶解。取样品分别上柱，控制流速为2mL/min，收集流出液，滤过，以5个黄酮苷含量为指标进行检测。结果见表6。
表6上样浓度对总黄酮影响试验结果
Figure BDA0001019743280000042
Figure BDA0001019743280000051
(三)pH对狭山野豌豆总黄酮的影响
分别量取样品溶液(总黄酮浓度为0.385 60mg/mL)100mL，共5份，其中4份用1moL/L HCl溶液或1moL/L NaOH溶液调节PH范围1～2、3～4、5～6、7～8。将上述5份溶液依次加入HPD-826型大孔树脂柱(Φ1.5cm×20cm，10g)中，控制流速为2mL/min，收集流出液，滤过，以5个黄酮苷含量为指标进行检测。结果见表7。当上样液体pH 5～6时，HPD-826型大孔树脂对狭山野豌豆总黄酮的吸附率达到95.67％，pH范围为1～2和3～4时，吸附率均达到了90％以上，然而pH值偏低，在工业化生产中会腐蚀金属机器及色谱柱，故将上样液体pH范围定为5～6。
表7 pH对总黄酮影响试验结果
Figure BDA0001019743280000052
(四)吸附流速对狭山野豌豆总黄酮的影响
分别量取PH 5～6样品水溶液(总黄酮浓度为0.38971mg/mL)100mL，依次加入5根HPD-826型大孔树脂柱(Φ1.5cm×20cm，10g)中，分别调节流速为2、3、4、5和6mL/min进行动态吸附，收集流出液，滤过，以5个黄酮苷含量为指标进行检测。结果见表8。
表8吸附流速对总黄酮影响试验结果
Figure BDA0001019743280000053
(五)上样体积对狭山野豌豆总黄酮的影响
将pH 5～6样品水溶液(总黄酮浓度为0.377 89mg/mL)，加入预处理好的HPD-826型大孔树脂柱(Φ1.5cm×20cm，10g)中，调节流速为2mL/min进行动态吸附，按树脂床体积倍数上样，收集流出液，滤过，以5个黄酮苷含量为指标进行检测。结果见表9。
表9上样体积对总黄酮影响试验结果
Figure BDA0001019743280000061
(六)洗脱剂对狭山野豌豆总黄酮的影响
分别量取pH 5～6样品水溶液(总黄酮浓度为0.377 89mg/mL)100mL，分别加入4根预处理好的HPD-826型大孔树脂柱(Φ1.5cm×20cm，10g)中，调节流速为2mL/min进行动态吸附，收集流出液，滤过，定容。先用水洗脱至近无色，再分别用30％、50％、70％和95％乙醇水溶液洗脱至近无色，洗脱液滤过，定容。以5个黄酮苷含量为指标进行检测。结果见表10。
表10洗脱剂对总黄酮影响试验结果
Figure BDA0001019743280000062
(七)洗脱速度对狭山野豌豆总黄酮的影响
分别将pH 5～6样品水溶液(总黄酮浓度为0.361 29mg/mL)100mL，加入5根预处理好的HPD-826型大孔树脂柱(Φ1.5cm×20cm，10g)中，调节流速为2mL/min进行动态吸附，收集流出液，滤过。先用水洗脱至近无色，再70％乙醇水溶液洗脱，分别以2、3、4、5、6mL/min流速进行洗脱，收集洗脱液，滤过，以5个黄酮苷含量为指标进行检测。结果见表11。
表11洗脱流速对总黄酮影响试验结
Figure BDA0001019743280000071
(八)洗脱体积对狭山野豌豆总黄酮的影响
将pH 5～6样品水溶液(总黄酮浓度为0.359 25mg/mL)100mL，加入预处理好的HPD-826型大孔树脂柱(Φ1.5cm×20cm，10g)中，调节流速为2mL/min进行动态吸附，收集流出液，滤过。先用水洗脱至近无色，再70％乙醇水溶液洗脱，以3mL/min流速进行洗脱，按树脂床体积倍数收集洗脱液，滤过，以5个黄酮苷含量为指标进行检测。结果见表12。
表12洗脱体积考察试验结果
Figure BDA0001019743280000072
综合考虑节省能源、节约时间等因素，确定最佳纯化工艺，即，填料采用HPD-826型大孔吸附树脂，用HCl调节样品水溶液pH为5-6，上样体积为5倍树脂柱床体积，调节流速为2mL/min进行动态吸附，洗脱剂为70％乙醇水溶液，以3mL/min流速进行洗脱，以10倍树脂柱床体积洗脱液洗脱。

Claims (1)

1.狭山野豌豆中总黄酮的制备方法，其特征在于，包括提取步骤和纯化步骤，
所述的提取步骤为：取狭山野豌豆药材粉末，以40-95％的乙醇水溶液为溶剂，料液比为1:10-20，提取温度为70-90℃，提取1-3次，每次提取时间为1-1.5小时，得提取液；
所述的纯化步骤为：将提取液旋转蒸发得浓缩液，将浓缩液加水至浓度为0.39mg/mL，得上样液，调节上样液的pH为5-6；选取填充有大孔吸附树脂的吸附柱，上样液上样于吸附柱，上样体积为5倍树脂柱床体积，调节吸附流速为2mL/min进行动态吸附，以70％的乙醇水溶液作为洗脱剂，以3mL/min流速进行洗脱，以10倍树脂柱床体积洗脱液洗脱，收集洗脱液；
所述的大孔吸附树脂是HPD-826型大孔吸附树脂。
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