CN104892708B - 从黄绿蜜环菌子实体规模化制备腺苷化学对照品的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从黄绿蜜环菌子实体规模化制备腺苷化学对照品的方法，该方法包括以下步骤：⑴醇沉除杂：黄绿蜜环菌子实体水提物用水溶解后醇沉，经过滤、减压干燥得棕黄色浸膏；⑵微孔树脂柱富集：棕黄色浸膏用乙醇溶液溶解，经过滤、上微孔树脂柱分离后，依次用水、乙醇溶液进行台阶梯度洗脱，收集50%乙醇水洗脱物，该洗脱物减压干燥，即得腺苷粗品；⑶反相液相制备色谱精制：腺苷粗品用甲醇溶液溶解，经过滤、高效反相液相制备色谱柱进行分离，收集制备色谱图中主要的色谱峰馏分，该色谱峰馏分经减压干燥即可得白色粉末状的腺苷对照品。本发明工艺简单、易规模化。
Description
技术领域
本发明涉及一种腺苷化学对照品的制备方法，尤其涉及从黄绿蜜环菌子实体规模化制备腺苷化学对照品的方法。
背景技术
黄绿蜜环菌（Armillaria luteo-rivens），俗名黄蘑菇，为野生大宗高原真菌，具有抗流感、防治神经炎、脚气病、促进儿童发育、抗氧化及抗肿瘤等作用，所含的核苷和甾醇类成分为其主要活性成分。迄今，黄绿蜜环菌并未有质控指标成分。腺苷是黄绿蜜环菌子实体中含量较高的核苷类化合物，由于该化合物极性较大，从子实体中获取高纯度腺苷对照品较为困难。为了加快黄绿蜜环菌的质量评价、生产销售及相关新药的研发步伐，发展高纯度腺苷的高效制备方法，尤其规模化制备技术显得尤为重要。
目前，从黄绿蜜环菌子实体制备核苷类化合物的文献未见报道，艾凤伟，郭文娟，张伟等报道从白附子，内生真菌及天麻中采用萃取，结晶及反复柱层析等手段获取纯度90%以上的腺苷（艾凤伟，张嵩，李艳凤，等. 白附子的化学成分研究，中草药，2010，41(2)：201-203；郭文娟，郭顺星. 潜在抗HIV活性内生真菌Epulorhiza sp.的化学成分研究，中草药，41(11)：1773-1775；张伟，宋启示. 贵州大方林下栽培天麻的化学成分研究，中草药，2010，41(11)：1782-1785）。其中硅胶柱层析次数至少3~5次，过程繁琐且重结晶损失量较大（回收率较少），而且规模化纯化制备腺苷的研究未见文献报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种工艺简单、易规模化的从黄绿蜜环菌子实体规模化制备腺苷化学对照品的方法。
为解决上述问题，本发明所述的从黄绿蜜环菌子实体规模化制备腺苷化学对照品的方法，包括以下步骤：
⑴醇沉除杂：
黄绿蜜环菌子实体水提物用其质量5~10倍的水溶解后，采用体积分数60~95%的乙醇溶液进行醇沉，经过滤得到滤液A，该滤液A经减压干燥得棕黄色浸膏；
⑵微孔树脂柱富集：
所述棕黄色浸膏用其质量5~10倍的体积分数5~20%的乙醇溶液溶解，滤纸过滤，得到滤液B；该滤液B上微孔树脂柱分离后，依次用2~5倍柱体积的水、20%~35%乙醇溶液、50%乙醇溶液进行台阶梯度洗脱，收集50%乙醇水洗脱物，该洗脱物减压干燥，即得腺苷粗品；所述棕黄色浸膏与所述微孔树脂比例为1 g：10 mL；
⑶反相液相制备色谱精制：
所述腺苷粗品用其质量2~5倍的体积分数为30~80%的甲醇溶液溶解，然后配制样品浓度为60.0~150.0 mg/mL，经0.45 μm微孔滤膜过滤，得到滤液C；该滤液C采用高效反相液相制备色谱柱进行分离，经检测波长为254 nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中主要的色谱峰馏分，该色谱峰馏分经减压干燥即可得白色粉末状的腺苷对照品。
所述步骤⑴、所述步骤⑵和所述步骤⑶中的减压干燥的条件均是指真空度为0.06~0.09 MPa，温度为50~70 ℃。
所述步骤⑶中制备液相色谱的工作参数是指色谱柱柱长250 mm、直径20 mm，反相制备柱固定相为耐纯水C18或常用C18，流动相为体积分数2~10%的乙腈-水溶液或5~20%的甲醇水溶液，进样体积为5.0 mL，流速为20 mL/min。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明采用醇沉处理，可直接将黄绿蜜环菌子实体水提物中脂溶性成分和水溶性成分（多糖、蛋白等生物大分子）分开。
2、本发明采用微孔树脂柱富集腺苷，可获取含量约为70%~80%的（HPLC归一化法）的腺苷粗品，同时，微孔树脂具有良好的脱色效果。另外微孔树脂柱可以再生循环使用，平均价格低廉。
3、本发明采用反相高效液相制备，可获取高纯度对照品，且收率较高（>90%）。
4、本发明原料要求不高，一般市售黄绿蜜环菌子实体即可，易于批量备料。
5、本发明工艺简单、易于操作，采用本发明方法可快速制备纯度大于98%的腺苷对照品，制备规模为克级到百克级，非常适宜规模化生产。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1为本发明醇沉后腺苷的HPLC代表性分析图谱（254 nm）。
图2为本发明微孔树脂柱富集后腺苷的HPLC代表性分析图谱（254 nm）。
图3为本发明腺苷粗品的高效液相色谱分析及制备代表性图谱（254 nm）。
具体实施方式
实施例1 从黄绿蜜环菌子实体规模化制备腺苷化学对照品的方法，包括以下步骤：
⑴醇沉除杂：
100 g黄绿蜜环菌子实体水提物（棕黑色固体）用其质量5倍的水溶解后，采用体积分数60%的乙醇溶液进行醇沉，经过滤得到滤液A，该滤液A经真空度为0.06 MPa、温度为70℃减压干燥得棕黄色浸膏25.20 g。
⑵微孔树脂（MCI）柱富集：
棕黄色浸膏用其质量5倍的体积分数20%的乙醇溶液溶解，滤纸过滤，得到滤液B；该滤液B上微孔树脂（MCI）柱分离后，依次用5倍柱体积的水、20%乙醇溶液、50%乙醇溶液进行台阶梯度洗脱，收集50%乙醇水洗脱物，该洗脱物减压干燥即得1.80 g腺苷粗品。
其中：棕黄色浸膏与微孔树脂比例为1 g：10 mL。
减压干燥的条件是指真空度为0.06 MPa，温度为70 ℃。
⑶反相液相制备色谱精制：
腺苷粗品用其质量2倍的体积分数为40%的甲醇溶液溶解，然后配制样品浓度为100.0 mg/mL，经0.45 μm微孔滤膜过滤，得到滤液C；该滤液C采用柱长250 mm、直径20 mm的高效反相液相制备色谱柱进行分离，经检测波长为254 nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中主要的色谱峰馏分，该色谱峰馏分经真空度为0.06 MPa、温度为70 ℃减压干燥即可得到纯度大于98%的白色粉末状的腺苷对照品1.62 g。收率约为90.0%。
其中：制备色谱柱的填料为10 μm耐纯水C18（Megress）；进样体积为5.0 mL，采用的流动相为体积分数为20%的甲醇水溶液，流速为20 mL/min。
实施例2 从黄绿蜜环菌子实体规模化制备腺苷化学对照品的方法，包括以下步骤：
⑴醇沉除杂：
10 g黄绿蜜环菌子实体水提物（棕黑色固体）用其质量10倍的水溶解后，采用体积分数95%的乙醇溶液进行醇沉，经过滤得到滤液A，该滤液A经真空度为0.09 MPa、温度为50℃减压干燥得棕黄色浸膏1.82 g。
⑵微孔树脂（MCI）柱富集：
棕黄色浸膏用其质量10倍的体积分数5%的乙醇溶液溶解，滤纸过滤，得到滤液B；该滤液B上微孔树脂（MCI）柱分离后，依次用2倍柱体积的水、30%乙醇溶液、50%乙醇溶液进行台阶梯度洗脱，收集50%乙醇水洗脱物，该洗脱物减压干燥即得140.2 mg腺苷粗品。
其中：棕黄色浸膏与微孔树脂比例为1 g：10 mL。
减压干燥的条件是指真空度为0.09 MPa，温度为50 ℃。
⑶反相液相制备色谱精制：
腺苷粗品用其质量5倍的体积分数为30%的甲醇溶液溶解，然后配制样品浓度为60.0 mg/mL，经0.45 μm微孔滤膜过滤，得到滤液C；该滤液C采用柱长250 mm、直径20 mm的高效反相液相制备色谱柱进行分离，经检测波长为254 nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中主要的色谱峰馏分，该色谱峰馏分经真空度为0.09 MPa、温度为50 ℃减压干燥即可得到纯度大于98%的白色粉末状的腺苷对照品126.9 mg。收率约为90.5%。
其中：制备色谱柱的填料为10 μm常用C18（Innovol）；进样体积为5.0 mL，采用的流动相为体积分数为10%的甲醇水溶液，流速为20 mL/min。
实施例3 从黄绿蜜环菌子实体规模化制备腺苷化学对照品的方法，包括以下步骤：
⑴醇沉除杂：
200 g黄绿蜜环菌子实体水提物（棕黑色固体）用其质量7倍的水溶解后，采用体积分数75%的乙醇溶液进行醇沉，经过滤得到滤液A，该滤液A经真空度为0.07MPa、温度为60℃减压干燥得棕黄色浸膏48.52 g。
⑵微孔树脂（MCI）柱富集：
棕黄色浸膏用其质量7倍的体积分数10%的乙醇溶液溶解，滤纸过滤，得到滤液B；该滤液B上微孔树脂（MCI）柱分离后，依次用3倍柱体积的水、25%乙醇溶液、50%乙醇溶液进行台阶梯度洗脱，收集50%乙醇水洗脱物，该洗脱物减压干燥即得3.84 g腺苷粗品。
其中：棕黄色浸膏与微孔树脂比例为1 g：10 mL。
减压干燥的条件是指真空度为0.07 MPa，温度为60 ℃。
⑶反相液相制备色谱精制：
腺苷粗品用其质量3倍的体积分数为80%的甲醇溶液溶解，然后配制样品浓度为150.0 mg/mL，经0.45 μm微孔滤膜过滤，得到滤液C；该滤液C采用柱长250 mm、直径20 mm的高效反相液相制备色谱柱进行分离，经检测波长为254 nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中主要的色谱峰馏分，该色谱峰馏分经真空度为0.07 MPa、温度为60 ℃减压干燥即可得到纯度大于98%的白色粉末状的腺苷对照品3.46 g。收率约为90.1%。
其中：制备色谱柱的填料为10 μm常用C18（Innovol）；进样体积为5.0 mL，采用的流动相为体积分数为5%的乙腈-水溶液，流速为20 mL/min。
实施例4 从黄绿蜜环菌子实体规模化制备腺苷化学对照品的方法，包括以下步骤：
⑴醇沉除杂：
50 g黄绿蜜环菌子实体水提物（棕黑色固体）用其质量8倍的水溶解后，采用体积分数80%的乙醇溶液进行醇沉，经过滤得到滤液A，该滤液A经真空度为0.08 MPa、温度为50℃减压干燥得棕黄色浸膏11.41 g。
⑵微孔树脂（MCI）柱富集：
棕黄色浸膏用其质量8倍的体积分数15%的乙醇溶液溶解，滤纸过滤，得到滤液B；该滤液B上微孔树脂（MCI）柱分离后，依次用3倍柱体积的水、35%乙醇溶液、50%乙醇溶液进行台阶梯度洗脱，收集50%乙醇水洗脱物，该洗脱物减压干燥即得0.70 g腺苷粗品。
其中：棕黄色浸膏与微孔树脂比例为1 g：10 mL。
减压干燥的条件是指真空度为0.08 MPa，温度为50 ℃。
⑶反相液相制备色谱精制：
腺苷粗品用其质量4倍的体积分数为50%的甲醇溶液溶解，然后配制样品浓度为90.0 mg/mL，经0.45 μm微孔滤膜过滤，得到滤液C；该滤液C采用柱长250 mm、直径20 mm的高效反相液相制备色谱柱进行分离，经检测波长为254 nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中主要的色谱峰馏分，该色谱峰馏分经真空度为0.08 MPa、温度为50 ℃减压干燥即可得到纯度大于98%的白色粉末状的腺苷对照品0.63 g。收率约为90.0%。
其中：制备色谱柱的填料为10 μm耐纯水C18（Megress）；进样体积为5.0 mL，采用的流动相为体积分数为10%的乙腈-水溶液，流速为20 mL/min。
实施例5 从黄绿蜜环菌子实体规模化制备腺苷化学对照品的方法，包括以下步骤：
⑴醇沉除杂：
100 g黄绿蜜环菌子实体水提物（棕黑色固体）用其质量9倍的水溶解后，采用体积分数60%的乙醇溶液进行醇沉，经过滤得到滤液A，该滤液A经真空度为0.07MPa、温度为70℃减压干燥得棕黄色浸膏25.20 g。
⑵微孔树脂（MCI）柱富集：
棕黄色浸膏用其质量9倍的体积分数20%的乙醇溶液溶解，滤纸过滤，得到滤液B；该滤液B上微孔树脂（MCI）柱分离后，依次用5倍柱体积的水、20%乙醇溶液、50%乙醇溶液进行台阶梯度洗脱，收集50%乙醇水洗脱物，该洗脱物减压干燥即得1.80 g腺苷粗品。
其中：棕黄色浸膏与微孔树脂比例为1 g：10 mL。
减压干燥的条件是指真空度为0.07 MPa，温度为70 ℃。
⑶反相液相制备色谱精制：
腺苷粗品用其质量2倍的体积分数为40%的甲醇溶液溶解，然后配制样品浓度为100.0 mg/mL，经0.45 μm微孔滤膜过滤，得到滤液C；该滤液C采用柱长250 mm、直径20 mm的高效反相液相制备色谱柱进行分离，经检测波长为254 nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中主要的色谱峰馏分，该色谱峰馏分经真空度为0.07 MPa、温度为70 ℃减压干燥即可得到纯度大于98%的白色粉末状的腺苷对照品1.60 g。收率约为0.89%。
其中：制备色谱柱的填料为10 μm耐纯水C18（Megress）；进样体积为5.0 mL，采用的流动相为体积分数为5%的甲醇水溶液，流速为20 mL/min。
实施例6 从黄绿蜜环菌子实体规模化制备腺苷化学对照品的方法，包括以下步骤：
⑴醇沉除杂：
50 g黄绿蜜环菌子实体水提物（棕黑色固体）用其质量8倍的水溶解后，采用体积分数80%的乙醇溶液进行醇沉，经过滤得到滤液A，该滤液A经真空度为0.08 MPa、温度为55℃减压干燥得棕黄色浸膏11.41 g。
⑵微孔树脂（MCI）柱富集：
棕黄色浸膏用其质量8倍的体积分数15%的乙醇溶液溶解，滤纸过滤，得到滤液B；该滤液B上微孔树脂（MCI）柱分离后，依次用3倍柱体积的水、35%乙醇溶液、50%乙醇溶液进行台阶梯度洗脱，收集50%乙醇水洗脱物，该洗脱物减压干燥即得0.70 g腺苷粗品。
其中：棕黄色浸膏与微孔树脂比例为1 g：10 mL。
减压干燥的条件是指真空度为0.08 MPa，温度为55 ℃。
⑶反相液相制备色谱精制：
腺苷粗品用其质量3倍的体积分数为50%的甲醇溶液溶解，然后配制样品浓度为90.0 mg/mL，经0.45 μm微孔滤膜过滤，得到滤液C；该滤液C采用柱长250 mm、直径20 mm的高效反相液相制备色谱柱进行分离，经检测波长为254 nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中主要的色谱峰馏分，该色谱峰馏分经真空度为0.08 MPa、温度为55 ℃减压干燥即可得到纯度大于98%的白色粉末状的腺苷对照品0.64 g。收率约为91.4%。
其中：制备色谱柱的填料为10 μm耐纯水C18（Megress）；进样体积为5.0 mL，采用的流动相为体积分数为2%的乙腈-水溶液，流速为20 mL/min。
Claims (2)
1.从黄绿蜜环菌子实体规模化制备腺苷化学对照品的方法，包括以下步骤：
⑴醇沉除杂：
黄绿蜜环菌子实体水提物用其质量5~10倍的水溶解后，采用体积分数60~95%的乙醇溶液进行醇沉，经过滤得到滤液A，该滤液A经减压干燥得棕黄色浸膏；所述减压干燥的条件均是指真空度为0.06~0.09 MPa，温度为50~70 ℃；
⑵微孔树脂柱富集：
所述棕黄色浸膏用其质量5~10倍的体积分数5~20%的乙醇溶液溶解，滤纸过滤，得到滤液B；该滤液B上微孔树脂柱分离，依次用2~5倍柱体积的水、20%~35%乙醇溶液、50%乙醇溶液进行台阶梯度洗脱，收集50%乙醇水洗脱物，该洗脱物减压干燥，即得腺苷粗品；所述棕黄色浸膏与所述微孔树脂比例为1 g：10 mL；所述减压干燥的条件均是指真空度为0.06~0.09MPa，温度为50~70 ℃；
⑶反相液相制备色谱精制：
所述腺苷粗品用其质量2~5倍的体积分数为30~80%的甲醇溶液溶解，然后配制样品浓度为60.0~150.0 mg/mL，经0.45 μm微孔滤膜过滤，得到滤液C；该滤液C采用高效反相液相制备色谱柱进行分离，经检测波长为254 nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中主要的色谱峰馏分，该色谱峰馏分经减压干燥即可得白色粉末状的腺苷对照品；所述减压干燥的条件均是指真空度为0.06~0.09 MPa，温度为50~70 ℃。
2.如权利要求1所述的从黄绿蜜环菌子实体规模化制备腺苷化学对照品的方法，其特征在于：所述步骤⑶中制备液相色谱的工作参数是指色谱柱柱长250 mm、直径20 mm，反相制备柱固定相为耐纯水C18或常用C18，流动相为体积分数2~10%的乙腈-水溶液或5~20%的甲醇水溶液，进样体积为5.0 mL，流速为20 mL/min。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20171010 Termination date: 20200527 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |