CN101210039A - 一种羟基积雪草甙化学对照品的分离制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种羟基积雪草甙化学对照品的分离制备方法，以重量含量30～97％的羟基积雪草甙提取物为原料，以制备型高效液相色谱为分离手段，以一定比例的甲醇－水溶液为洗脱体系，获得纯度大于98％的羟基积雪草甙化学对照品；工艺步骤有：样品预处理，色谱柱处理，进样，洗脱，在线监测，收集含有羟基积雪草甙的洗脱液，减压浓缩羟基积雪草甙洗脱液至干，即得羟基积雪草甙化学对照品。经高效液相色谱法监测，羟基积雪草甙的含量可达到98％以上。

Description

一种羟基积雪草甙化学对照品的分离制备方法

技术领域

本发明涉及一种从羟基积雪草甙提取物中分离获得纯度大于98％的羟基积雪草甙化学对照品的制备方法。

背景技术

羟基积雪草甙(Madecassoside)是积雪草中一种重要的活性化学成分，属于五环三萜类化合物。羟基积雪草甙的结构式如下：

羟基积雪草的制备方法主要有如下方法：

1.大孔吸附树脂吸附法：秦路平等(中国专利CN1211098C，2005年公开)报道了积雪草总甙的提取方法，该方法采用皂甙型大孔吸附树脂吸附积雪草提取物，经蒸馏水洗脱，去除杂质后，以水醇洗脱，得到积雪草总甙溶液，乙酸乙酯结晶，减压浓缩至干，经核磁共振分析，所得总皂甙主要由积雪草甙和羟基羟基积雪草甙组成，两种成分占总该提取物的60％以上。

2.正相色谱法：陈瑶等(中国专利CN1377649，2002年公开)报道了采用正相色谱制备羟基积雪草甙的方法：以积雪草总甙为原料，进行硅胶正相层析，氯仿：甲醇为洗脱液，收取其中的2∶1比例部分洗脱液，回收获得羟基积雪草甙晶体。

3.离子交换色谱法：A·卢瓦索等报道(中国专利CN1774257，2006年公开)报道积雪草甙、羟基积雪草甙和另一种五环三萜成分特米诺甙总含量为75％混合物可以通过如下方法获得：积雪草地上部分的醇提取物经过阴离子树脂后，用液/液提取的方法进行选择性脱脂，浓缩脱脂后的水-醇液依次通过阳离子树脂、阴离子树脂获得混合物。该混合物如通过选择性色谱分离可以获得羟基积雪草甙和特米诺甙两种成分总量占混合物含量95％以上的混合物。

羟基积雪草是积雪草中一种具有很强生物活性的化合物，将积雪草甙和羟基积雪草甙共同做为研究对象开展有关研究成为积雪草植物研究的趋势。积雪草苷和羟基积雪草苷含量之和大于40％的积雪草总甙可以用来用于防治冠心病、心绞痛、心肌梗死、脑血栓形成、脑梗塞等心脑血管疾病。当积雪草甙、羟基积雪草甙和特米诺甙三种成分总量占混合物含量75％以上时具有抗炎作用，可以用于治疗多种炎性疾病及银屑病、白癜风等皮肤疾病。但目前羟基积雪草甙的提取方法都无法稳定获得纯度为98％以上的羟基积雪草甙化学对照品，无法满足羟基积雪草药材或相关制剂的质量分析及控制要求。制约了积雪草及羟基积雪草甙的科学研究及应用。开发一种可以获得克级纯度在98％以上羟基积雪草甙化学对照品的方法是当前积雪草研究的难点。针对该问题，我们开发了一种可以获得10克/月以上规模、纯度在98％以上羟基积雪草甙的制备方法。

发明内容

为克服现有技术的缺陷，优化分离条件，本发明的目的在于提供一种分离时间短、分离效果好、产品纯度高(纯度在98％以上)的羟基积雪草甙化学对照品的分离制备方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案：对照品的分离制备方法，以重量含量30～97％(优选60～97％)的羟基积雪草甙提取物为原料，以制备型高效液相色谱为分离手段，以甲醇-水溶液为洗脱体系，获得纯度98％以上羟基积雪草甙化学对照品；具体步骤为，

(1)样品预处理：将重量含量30～97％的羟基积雪草甙提取物用甲醇或乙醇溶液溶解，配置成重量浓度为20～60mg/ml的积雪草甙提取物溶液，经0.22～0.45μm微孔滤膜过滤；

(2)色谱柱处理：高效液相色谱柱选择制备型高效液相色谱柱，以5～20倍柱体积的洗脱体系溶液平衡色谱柱；洗脱体系溶液为甲醇水溶液，其体积浓度为50-80％；

(3)进样：将过滤后的样品溶液通过六通阀或泵进样，进样体积为1～100ml；

(4)洗脱：采用洗脱体系溶液洗脱色谱柱，流速控制在10～600ml/min，在线紫外监测，收集含有羟基积雪草甙的洗脱液；

(5)羟基积雪草甙化学对照品的获得：减压浓缩所收集到的羟基积雪草甙洗脱液至干，获得纯度高于98％的羟基积雪草甙化学对照品。

所述制备型高效液相柱选用商品化或自己装填的制备型高效液相柱；其填料可为C8或C18键合相填料；自己装填的制备型高效液相柱装填方式为湿法装柱，填料粒径为5-20μm，柱效在2000以上；在线紫外检测，其检测波长为190nm～220nm，具体监测波长根据样品中干扰成分与羟基积雪草甙的灵敏度确定，在所选择波长下，可以灵敏监测到干扰成分与羟基积雪草甙的信号；羟基积雪草甙洗脱液收集后，减压浓缩，浓缩温度控制在40～70℃。

以本方法从羟基积雪草提取物中分离羟基积雪草甙化学对照品具有如下优点和进步：

1.本发明以制备型高效液相为分离手段，在保证羟基积雪草甙得到高效分离的前提下，提高了羟基积雪草甙化学对照品的产量，可以获得克级纯度在98％以上的羟基积雪草甙化学对照品。

2.本发明所述的甲醇-水洗脱体系能有效的保证羟基积雪草甙与其他成分得到有效分离，从而保证分离的效果。

3.本发明采用紫外监测器在线监测，监测波长为200至220nm间任一波长，使羟基积雪草甙的分离情况可以直接监测，并可以选择性收集，显著提高收集效果。

4.本发明所述方法操作简便，条件温和，能有效的保证羟基积雪草甙的稳定性。

5.可产业推广。色谱柱规格为20×250mm时，其规模可达到10克/月以上。

附图说明

图1为本发明实施例1制备的羟基积雪草甙化学对照品的纯度分析色谱图。

具体实施方式

下面通过实施例和附图对本发明做进一步详细说明。

实施例1

本实施例中，以30％的羟基积雪草甙提取物为原料，以5μmC18键合相填料为吸附剂，以含有甲醇-水(50∶50，体积比)溶液为洗脱溶剂，具体工艺步骤如下：

1.样品预处理

羟基积雪草甙提取物用甲醇溶解，配置成浓度为60mg/ml的羟基积雪草甙溶液，经0.22μm微孔滤膜过滤。

2.色谱柱处理

制备型高效液相柱选择为日本Sheshido生产的固定相为C18的制备柱(5μm，20×250mm)，以约5倍柱体积的洗脱体系溶液平衡色谱柱。

3.上样

将过滤后的样品溶液通过六通阀进样，进样体积为1ml。

4.洗脱

流速控制在10ml/min，在线200nm紫外监测，收集含有羟基积雪草甙的洗脱液，

5.羟基积雪草甙化学对照品的获取

减压浓缩羟基积雪草甙洗脱液，减压浓缩，浓缩温度控制在70℃。得到纯度为98.89％的羟基积雪草甙化学对照品；如图1所示，其分析结果如表1所示：

表1

峰	名称	保留时间	峰面积	面积百分比
					1		1.881	3004	0.16
2		10.313	3070	0.17
					3	羟基积雪草甙	11.735	1836233	98.89
4		14.764	14456	0.78

实施例2

本实施例中，以60％羟基积雪草甙提取物为原料，以10μm的C8键合相填料为吸附剂，以含有甲醇-水(70∶30，体积比)溶液为洗脱溶剂，具体工艺步骤如下：

1.样品预处理

60％羟基积雪草甙提取物用乙醇溶解，配置成浓度为40mg/ml的羟基积雪草甙溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤。

2.色谱柱处理

制备型高效液相柱是自己装填的制备柱，填料为粒径为10μm的C18键合相填料，湿法装柱，色谱柱规格为50×250mm，以约10倍柱体积的洗脱体系溶液平衡色谱柱。

3.上样

将过滤后的样品溶液通过六通阀进样，进样体积为5ml。

4.洗脱

流速控制在90ml/min，在线207nm紫外监测，收集含有羟基积雪草甙的洗脱液，

5.羟基积雪草甙化学对照品的获取

减压浓缩羟基积雪草甙洗脱液，减压浓缩，浓缩温度控制在60℃。得到纯度为98.91％的羟基积雪草甙化学对照品。

实施例3

本实施例中，以60％的羟基积雪草甙提取物为原料，以10μm的C18键合相填料为吸附剂，以含有甲醇-水(60∶40，体积比)溶液为洗脱溶剂，具体工艺步骤如下：

1.样品预处理

羟基积雪草甙提取物用甲醇溶解，配置成浓度为40mg/ml的羟基积雪草甙溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤。

2.色谱柱处理

制备型高效液相柱是自己装填的制备柱，填料为粒径为10μm的C18键合相填料，色谱柱规格为75×250mm，以约10倍柱体积的洗脱体系溶液平衡色谱柱。

3.上样

将过滤后的样品溶液通过六通阀进样，进样体积为10ml。

4.洗脱

流速控制在150ml/min，在线200nm紫外监测，收集含有羟基积雪草甙的洗脱液，

5.羟基积雪草甙化学对照品的获取

减压浓缩羟基积雪草甙洗脱液，减压浓缩，浓缩温度控制在65℃。得到纯度为98.14％的羟基积雪草甙化学对照品。

实施例4

本实施例中，以90％的羟基积雪草甙提取物为原料，以20μmC18键合相填料为吸附剂，含有甲醇-水(80∶20，体积比)溶液为洗脱溶剂，具体工艺步骤如下：

1.样品预处理

羟基积雪草甙提取物用甲醇溶解，配置成浓度为40mg/ml的羟基积雪草甙溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤。

2.色谱柱处理

制备型高效液相柱是自己装填的制备柱，填料为粒径为20μm的C18键合相填料，色谱柱规格为100×270mm，以约10倍柱体积的洗脱体系溶液平衡色谱柱。

3.上样

将过滤后的样品溶液通过六通阀进样，进样体积为20ml。

4.洗脱

流速控制在300ml/min，在线207nm紫外监测，收集含有羟基积雪草甙的洗脱液，

5.羟基积雪草甙化学对照品的获取

减压浓缩羟基积雪草甙洗脱液，减压浓缩，浓缩温度控制在60℃。得到纯度为98.95％的羟基积雪草甙化学对照品。

实施例5

本实施例中，以80％的羟基积雪草甙提取物为原料，以10μmC18键合相填料为吸附剂，含有甲醇-水(75∶25，体积比)溶液为洗脱溶剂，具体工艺步骤如下：

1.样品预处理

羟基积雪草甙提取物用甲醇液溶解，配置成浓度为30mg/ml的羟基积雪草甙溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤。

2.色谱柱处理

制备型高效液相柱是自己装填的制备柱，填料为粒径为10μm的C18键合相填料，色谱柱规格为150×250mm，以约10倍柱体积的洗脱体系溶液平衡色谱柱。

3.上样

将过滤后的样品溶液通过六通阀进样，进样体积为100ml。

4.洗脱

流速控制在600ml/min，在线220nm紫外监测，收集含有羟基积雪草甙的洗脱液，

5.羟基积雪草甙化学对照品的获取

减压浓缩羟基积雪草甙洗脱液，得到纯度为98.20％的羟基积雪草甙化学对照品。

实施例6

本实施例中，以97％的羟基积雪草甙提取物为原料，以10μmC18键合相填料为吸附剂，含有甲醇-水(65∶35，体积比)溶液为洗脱溶剂，具体工艺步骤如下：

1.样品预处理

羟基积雪草甙提取物用甲醇-水(65∶35，体积比)溶液溶解，配置成浓度为40mg/ml的羟基积雪草甙溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤。

2.色谱柱处理

制备型高效液相柱是自己装填的制备柱，填料为粒径为20μm的C18键合相填料，色谱柱规格为150×250mm，以约10倍柱体积的洗脱体系溶液平衡色谱柱。

3.上样

将过滤后的样品溶液通过六通阀进样，进样体积为100ml。

4.洗脱

流速控制在600ml/min，在线220nm紫外监测，收集含有羟基积雪草甙的洗脱液，

5.羟基积雪草甙化学对照品的获取

减压浓缩羟基积雪草甙洗脱液，减压浓缩，浓缩温度控制在70℃。得到纯度为98.34％的羟基积雪草甙化学对照品。

Claims (8)

1.一种羟基积雪草甙化学对照品的分离制备方法，其特征在于：以重量含量30～97％的羟基积雪草甙提取物为原料，以制备型高效液相色谱为分离手段，以甲醇-水溶液为洗脱体系，获得纯度98％以上羟基积雪草甙化学对照品；具体步骤为，

(1)样品预处理：将重量含量30～97％的羟基积雪草甙提取物用甲醇或乙醇溶液溶解，配置成重量浓度为20～60mg/ml的积雪草甙提取物溶液，经0.22～0.45μm微孔滤膜过滤；

(2)色谱柱处理：高效液相色谱柱选择制备型高效液相色谱柱，以5～10倍柱体积的洗脱体系溶液平衡色谱柱；洗脱体系溶液为甲醇水溶液，其体积浓度为50～80％；

(3)进样：将过滤后的样品溶液进样，进样体积为1～100ml；

(4)洗脱：采用洗脱体系溶液洗脱色谱柱，流速控制在10～600ml/min，在线紫外监测，收集含有羟基积雪草甙的洗脱液；

(5)羟基积雪草甙化学对照品的获得：减压浓缩所收集到的羟基积雪草甙洗脱液至干，获得纯度高于98％的羟基积雪草甙化学对照品。

2.根据权利要求1所述羟基积雪草甙化学对照品的分离制备方法，其特征在于：所述原料为重量含量60～97％的羟基积雪草甙提取物。

3.根据权利要求1所述羟基积雪草甙化学对照品的分离制备方法，其特征在于：所述制备型高效液相柱选用商品化或自己装填的制备型高效液相柱；其填料可为C8或C18键合相填料。

4.根据权利要求3所述羟基积雪草甙化学对照品的分离制备方法，其特征在于：所述自己装填的制备型高效液相柱装填方式为湿法装柱。

5.根据权利要求4所述羟基积雪草甙化学对照品的分离制备方法，其特征在于：所述制备型高效液相柱的柱效在2000以上。

6.根据权利要求3所述羟基积雪草甙化学对照品的分离制备方法，其特征在于：所述制备型高效液相柱的填料粒径为5-20μm。

7.根据权利要求1所述羟基积雪草甙化学对照品的分离制备方法，其特征在于：所述在线紫外检测，其检测波长为190nm～220nm。

8.根据权利要求1所述羟基积雪草甙化学对照品的分离制备方法，其特征在于：所述羟基积雪草甙洗脱液收集后，减压浓缩，浓缩温度控制在60～70℃。

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