CN101210040B - 一种积雪草甙化学对照品的分离制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种积雪草甙化学对照品的制备方法。以重量含量30～97％的积雪草甙提取物为原料，以制备型高效液相色谱为分离手段，以一定比例的甲醇-水溶液为洗脱体系，获得纯度大于98％的积雪草甙化学对照品。工艺步骤有：样品预处理，色谱柱处理，进样，洗脱，在线检测，收集含有积雪草甙的洗脱液，减压浓缩积雪草甙洗脱液至干，即得积雪草甙化学对照品。经高效液相色谱法检测，积雪草甙的含量可达到98％以上。
Description
技术领域
本发明涉及一种从积雪草甙提取物中分离获得纯度大于98％的积雪草甙化学对照品的制备方法。
背景技术
积雪草甙(Asiaticoside)是积雪草中一种重要的化学成分，属于五环三萜类化合物，我国2005版国家药典中把积雪草甙作为鉴定成分。积雪草甙的结构式如下：
积雪草甙能明显促进伤口愈合，刺激肉芽生长，促进表皮角质化，并有助于发生新的结缔组织，可用治疗烧伤，下肢溃烂，创伤，肌腱粘连等。蒋毅等(中国专利CN 1520824A，2004年公开)报道了积雪草甙对二甲基亚硝胺引发的大鼠肝纤维化的防治作用，证实了积雪草甙具有抑制成纤维细胞生长增殖的功能，进而确定积雪草甙的预防治疗肝纤维化药物作用。
秦路平等(中国专利CN1211098C，2005年公开)报道了积雪草总甙的提取方法，该方法采用皂甙型大孔吸附树脂吸附积雪草提取物，经蒸馏水洗脱，去除杂质后，以水醇洗脱，得到积雪草总甙溶液，以乙酸乙酯结晶，减压浓缩至干，经核磁共振分析，所得总皂甙主要由积雪草甙和羟基积雪草甙组成，两种成分占总该提取物的60％以上。何明芳等(中国药科大学学报，2000，31(2)：91～93)报道的采用大孔吸附树脂结合硅胶柱层析的方法获得积雪草甙的分离方法，王宝奎等(海峡药学，1996，8(4)：3)报道的采用正丁醇萃取结合硅胶柱层析获得积雪草甙的分离方法，获得积雪草甙结晶。
目前积雪草甙单体化合物的制备存在如下缺点：1.纯度大于98％的积雪草甙单体的获得还停留在实验室小规模水平，无法提供克级化学对照品；2.目前可大规模提供的积雪草甙纯度最高仅能达到90％，无法满足积雪草药材或相关制剂的质量分析及控制要求。以上两点原因制约了积雪草及积雪草甙的科学研究及应用。开发一种可以获得克级纯度在98％以上积雪草甙化学对照品的方法是当前积雪草研究的难点。
发明内容
为克服现有技术的缺陷，优化分离条件，本发明的目的在于提供一种分离时间短、分离效果好、产品纯度高(纯度在98％以上)的积雪草甙化学对照品的分离制备方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案：对照品的分离制备方法，以重量含量30～97％(优选60～97％)的积雪草甙提取物为原料，以制备型高效液相色谱为分离手段，以甲醇-水溶液为洗脱体系，获得克级纯度98％以上积雪草甙化学对照品；具体步骤为，
(1)样品预处理：将重量含量30～97％的积雪草甙提取物用甲醇或乙醇溶液溶解，配置成重量浓度为30～60mg/ml的积雪草甙提取物溶液，经0.22～0.45μm微孔滤膜过滤；
(2)色谱柱处理：高效液相色谱柱选择制备型高效液相色谱柱，以5-20倍柱体积的洗脱体系溶液平衡色谱柱；洗脱体系溶液为甲醇水溶液，其体积浓度为50-80％；
(3)进样：将过滤后的样品溶液通过六通阀或泵进样，进样体积为1～100ml；
(4)洗脱：采用洗脱体系溶液洗脱色谱柱，流速控制在10～600ml/min，在线紫外监测，收集含有积雪草甙的洗脱液；
(5)积雪草甙化学对照品的获得：减压浓缩所收集到的积雪草甙洗脱液至干，获得纯度高于98％的积雪草甙化学对照品。
所述制备型高效液相柱选用商品化或自己装填的制备型高效液相柱；其填料可为C8或C18键合相填料；自己装填的制备型高效液相柱装填方式为湿法装柱，填料粒径为5-20μm，柱效在2000以上；在线紫外检测，其检测波长为190nm～220nm，具体检测波长根据样品中干扰成分与积雪草甙的灵敏度确定，在所选择波长下，可以灵敏检测到干扰成分与积雪草甙的信号；积雪草甙洗脱液收集后，减压浓缩，浓缩温度控制在60-70℃。
以本方法从积雪草提取物中分离积雪草甙化学对照品具有如下优点和进步：
1.本发明以制备型高效液相为分离手段，在保证积雪草甙得到高效分离的前提下，提高了积雪草甙化学对照品的产量，可以获得克级纯度在98％以上的积雪草甙化学对照品。
2.本发明所述的甲醇-水洗脱体系能有效的保证积雪草甙与其他成分得到有效分离，从而保证分离的效果。
3.本发明采用紫外检测器在线检测，检测波长为190至210nm间任一波长，使积雪草甙的分离情况可以直接检测，并可以选择性收集，显著提高收集效果。
4.本发明所述方法操作简便，条件温和，能有效的保证积雪草甙的稳定性。
5.可产业推广。色谱柱规格为50×250mm时，其规模可达到10克/月以上。
附图说明
图1为本发明实施例一制备的积雪草甙化学对照品的纯度分析色谱图。
具体实施方式
下面通过实施例和附图对本发明做进一步详细说明。
实施例1
本实施例中，以30％的积雪草甙提取物为原料，以5μmC18键合相填料为吸附剂，以甲醇-水(50∶50，体积比)溶液为洗脱溶剂，具体工艺步骤如下：
1.样品预处理
积雪草甙提取物用甲醇溶解，配置成浓度为60mg/ml的积雪草甙溶液，经0.22μm微孔滤膜过滤。
2.色谱柱处理
制备型高效液相柱选择为日本Sheshido公司生产的固定相为C18的制备柱(5μm，20×250mm)，以约5倍柱体积的洗脱体系溶液平衡色谱柱。
3.上样
将过滤后的样品溶液通过六通阀进样，进样体积为1ml。
4.洗脱
流速控制在10ml/min，在线190nm紫外检测，收集含有积雪草甙的洗脱液，
5.积雪草甙化学对照品的获取
减压浓缩积雪草甙洗脱液，浓缩温度控制在70℃。得到纯度为99.54％的积雪草甙化学对照品；如图1所示，其分析结果如表1所示：
表1
| 峰 | 名称 | 保留时间 | A峰面积 | 面积百分比 |
| 1 | 10.066 | 7476 | 0.46 | |
| 2 | 积雪草甙 | 10.648 | 1623932 | 99.54 |
实施例2
本实施例中，以60％积雪草甙提取物为原料，以10μm的C8键合相填料为吸附剂，以甲醇-水(70∶30，体积比)溶液为洗脱溶剂，具体工艺步骤如下：
1.样品预处理
60％积雪草甙提取物用乙醇溶解，配置成浓度为40mg/ml的积雪草甙溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤。
2.色谱柱处理
制备型高效液相柱是自己装填的制备柱，填料为粒径为10μm的C18键合相填料，湿法装柱，色谱柱规格为50×250mm，以约10倍柱体积的洗脱体系溶液平衡色谱柱。
3.上样
将过滤后的样品溶液通过六通阀进样，进样体积为3ml。
4.洗脱
流速控制在90ml/min，在线207nm紫外检测，收集含有积雪草甙的洗脱液，
5.积雪草甙化学对照品的获取
减压浓缩积雪草甙洗脱液，浓缩温度控制在60℃。得到纯度为98.51％的积雪草甙化学对照品。
实施例3
本实施例中，以60％的积雪草甙提取物为原料，以10μm的C18键合相填料为吸附剂，以甲醇-水(60∶40，体积比)溶液为洗脱溶剂，具体工艺步骤如下：
1.样品预处理
积雪草甙提取物用甲醇溶解，配置成浓度为40mg/ml的积雪草甙溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤。
2.色谱柱处理
制备型高效液相柱是自己装填的制备柱，填料为粒径为10μm的C18键合相填料，色谱柱规格为75×250mm，以约10倍柱体积的洗脱体系溶液平衡色谱柱。
3.上样
将过滤后的样品溶液通过六通阀进样，进样体积为10ml。
4.洗脱
流速控制在150ml/min，在线200nm紫外检测，收集含有积雪草甙的洗脱液，
5.积雪草甙化学对照品的获取
减压浓缩积雪草甙洗脱液，浓缩温度控制在65℃。得到纯度为98.74％的积雪草甙化学对照品。
实施例4
本实施例中，以90％的积雪草甙提取物为原料，以20μmC18键合相填料为吸附剂，以甲醇-水(80∶20，体积比)溶液为洗脱溶剂，具体工艺步骤如下：
1.样品预处理
积雪草甙提取物用甲醇溶解，配置成浓度为50mg/ml的积雪草甙溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤。
2.色谱柱处理
制备型高效液相柱是自己装填的制备柱，填料为粒径为20μm的C18键合相填料，色谱柱规格为100×270mm，以约10倍柱体积的洗脱体系溶液平衡色谱柱。
3.上样
将过滤后的样品溶液通过六通阀进样，进样体积为20ml。
4.洗脱
流速控制在300ml/min，在线207nm紫外检测，收集含有积雪草甙的洗脱液，
5.积雪草甙化学对照品的获取
减压浓缩积雪草甙洗脱液，浓缩温度控制在60℃。得到纯度为98.15％的积雪草甙化学对照品。
实施例5
本实施例中，以90％的积雪草甙提取物为原料，以10μmC8键合相填料为吸附剂，以甲醇-水(75∶25，体积比)溶液为洗脱溶剂，具体工艺步骤如下：
1.样品预处理
积雪草甙提取物用甲醇溶解，配置成浓度为50mg/ml的积雪草甙溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤。
2.色谱柱处理
制备型高效液相柱是自己装填的制备柱，填料为粒径为10μm的C8键合相填料，色谱柱规格为100×250mm，以约10倍柱体积的洗脱体系溶液平衡色谱柱。
3.上样
将过滤后的样品溶液通过六通阀进样，进样体积为20ml。
4.洗脱
流速控制在300ml/min，在线200nm紫外检测，收集含有积雪草甙的洗脱液，
5.积雪草甙化学对照品的获取
减压浓缩积雪草甙洗脱液，浓缩温度控制在60℃。得到纯度为99.19％的积雪草甙化学对照品。
实施例6
本实施例中，以97％的积雪草甙提取物为原料，以20μmC18键合相填料为吸附剂，以甲醇-水(65∶35，体积比)溶液为洗脱溶剂，具体工艺步骤如下：
1.样品预处理
积雪草甙提取物用甲醇溶解，配置成浓度为30mg/ml的积雪草甙溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤。
2.色谱柱处理
制备型高效液相柱是自己装填的制备柱，填料为粒径为10μm的C18键合相填料，色谱柱规格为150×250mm，以约10倍柱体积的洗脱体系溶液平衡色谱柱。
3.上样
将过滤后的样品溶液通过泵进样，进样体积为100ml。
4.洗脱
流速控制在600ml/min，在线220nm紫外检测，收集含有积雪草甙的洗脱液。
5.积雪草甙化学对照品的获取
减压浓缩积雪草甙洗脱液，浓缩温度控制在65℃。得到纯度为99.54％的积雪草甙化学对照品。
Claims (5)
1.一种积雪草甙化学对照品的分离制备方法，其特征在于：以重量含量30～97％的积雪草甙提取物为原料，以制备型高效液相色谱为分离手段，以甲醇-水溶液为洗脱体系，获得克级纯度高于98％积雪草甙化学对照品；具体步骤为，
(1)样品预处理：将重量含量30～97％的积雪草甙提取物用甲醇或乙醇溶液溶解，配置成重量浓度为30～60mg/ml的积雪草甙提取物溶液，经0.22～0.45μm微孔滤膜过滤；
(2)色谱柱处理：高效液相色谱柱选择制备型高效液相色谱柱，以5～20倍柱体积的洗脱体系溶液平衡色谱柱；洗脱体系溶液为甲醇水溶液，其体积浓度为50～80％；
(3)进样：将过滤后的样品溶液通过六通阀或泵进样，进样体积为1～100ml；
(4)洗脱：采用洗脱体系溶液洗脱色谱柱，流速控制在10～600ml/min，在线紫外监测，收集含有积雪草甙的洗脱液；
(5)积雪草甙化学对照品的获得：减压浓缩所收集到的积雪草甙洗脱液至干，获得纯度高于98％的积雪草甙化学对照品；
所述制备型高效液相色谱柱选用商品化或自己装填的制备型高效液相色谱柱；其填料为C8或C18键合相填料。
2.根据权利要求1所述积雪草甙化学对照品的分离制备方法，其特征在于：所述原料为重量含量60～97％的积雪草甙提取物。
3.根据权利要求1所述积雪草甙化学对照品的分离制备方法，其特征在于：所述自己装填的制备型高效液相柱装填方式为湿法装柱，柱效在2000以上，填料粒径为5-20μm。
4.根据权利要求1所述积雪草甙化学对照品的分离制备方法，其特征在于：所述在线紫外检测，其检测波长为190nm～220nm。
5.根据权利要求1所述积雪草甙化学对照品的分离制备方法，其特征在于：所述积雪草甙洗脱液收集后，减压浓缩，浓缩温度控制在60～70℃。
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