CN103083392B

CN103083392B - 一种分离富集山豆根中具异戊烯基黄酮部位的方法

Info

Publication number: CN103083392B
Application number: CN201210580237.2A
Authority: CN
Inventors: 颜继忠; 李行诺; 陈垚
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2012-12-27
Filing date: 2012-12-27
Publication date: 2015-10-07
Anticipated expiration: 2032-12-27
Also published as: CN103083392A

Abstract

本发明公开了一种分离富集山豆根中具异戊烯基黄酮部位的方法，所述方法包括如下步骤：使山豆根的乙醇提取液通过大孔吸附树脂进行柱色谱分离，所述大孔吸附树脂为大孔吸附树脂D101或大孔吸附树脂AB-8，依次用40%-50%乙醇、80%-95%乙醇洗脱，收集80%-95%乙醇洗脱液，浓缩至浸膏状，干燥得到山豆根中具异戊烯基黄酮部位。本发明所述的方法采用高浓度乙醇提取，大孔吸附树脂分离富集的工艺简单，高效，过程简便，目标明确，适合工业生产。

Description

一种分离富集山豆根中具异戊烯基黄酮部位的方法

（一）技术领域

本发明涉及一种中药有效成分分离技术领域，特指一种利用大孔吸附树脂法富集纯化山豆根中具异戊烯基黄酮部位的方法。

（二）背景技术

山豆根为豆科（Leguminosae）槐属植物越南槐Sophora tonkinensis Gagnep.的干燥根及根茎，主产于广西、贵州、云南、广东、江西等地，其味苦、性寒，为清热解毒、消肿利咽之要药，主治火毒蕴结、咽喉肿痛、齿龈肿痛等症。现代药理研究表明山豆根具有抗病毒、抗肝损伤、抗肿瘤等作用，其含有的黄酮和生物碱两大类成分主要为这些药理活性的物质基础。

经检索，现有专利中，CN1994364A的发明专利是通过调节溶液pH，使用二次大孔吸附树脂柱色谱法，收集40%-60%乙醇洗脱液作为山豆根提取物；CN101347497A的发明专利是通过有机溶剂提取，硅胶柱层析结合制备液相色谱分离得到山豆根中的一些有效成分；CN101278969A的发明专利是使用聚苯乙烯型阳离子交换树脂对山豆根水提物中非生物碱部位进行制备。而采用大孔吸附树脂分离富集山豆根的95%乙醇提取物，制备山豆根中具异戊烯基黄酮部位的研究尚未见报道。

（三）发明内容

本发明的目的是提供一种一步柱层析即可得到山豆根中具异戊烯基黄酮部位的分离富集方法，具有简单、快速、成本较低的特点。

为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种分离富集山豆根中具异戊烯基黄酮部位的方法，包括如下步骤：使山豆根的乙醇提取液通过大孔吸附树脂进行柱色谱分离，所述大孔吸附树脂为大孔吸附树脂D101或大孔吸附树脂AB-8，依次用40%-50%乙醇、80%-95%乙醇洗脱，收集80%-95%乙醇洗脱液，浓缩至浸膏状，干燥得到山豆根中具异戊烯基黄酮部位。

本发明所述的山豆根的乙醇提取液是以山豆根药材为原料，以乙醇为提取试剂，通过常规提取方法获得，其中控制山豆根的乙醇提取液中的乙醇浓度为20%-40%。本发明具体推荐所述的山豆根的乙醇提取液通过如下方法获得：将山豆根药材粉碎，加入8~20倍的70%-95%乙醇（优选为95%乙醇），回流提取，提取液过滤，取滤液浓缩至乙醇浓度为20%-40%，即得山豆根的乙醇提取液。作为优选，将山豆根药材粉碎至40~200目。作为优选，回流提取2~3次，每次60~90分钟，以充分提取山豆根中的有效成分。

作为优选，柱色谱分离过程中，用40%-50%乙醇或80%-95%乙醇洗脱时，每个浓度冲洗8~10个保留体积。

作为优选，柱色谱分离过程中，先用50%乙醇洗脱，再用90%乙醇洗脱。

本发明具体推荐所述的分离富集山豆根中具异戊烯基黄酮部位的方法按照如下步骤进行：

（1）将山豆根药材粉碎，加入8~20倍的70%-95%乙醇，回流提取，过滤，取滤液浓缩至乙醇浓度为20%-40%，得到山豆根的乙醇提取液；

（2）将山豆根的乙醇提取液通过大孔吸附树脂，依序用40%-50%乙醇、80%-95%乙醇洗脱，每个浓度冲洗8~10个保留体积，收集80%-95%乙醇洗脱液；

（3）将步骤（2）获得的80%-95%乙醇洗脱液减压浓缩至浸膏状，经真空干燥或冷冻干燥成干粉，即得山豆根中具异戊烯基黄酮部位。

本发明进一步推荐所述的分离富集山豆根中具异戊烯基黄酮部位的方法按照如下步骤进行：

（1）将山豆根药材粉碎，加入8~20倍的95%乙醇，回流提取2~3次，每次60~90分钟，过滤，取滤液浓缩至乙醇浓度为20%-40%，得到山豆根的乙醇提取液；

（2）将山豆根的乙醇提取液通过大孔吸附树脂，依序用50%乙醇、90%乙醇洗脱，每个浓度冲洗8~10个保留体积，收集90%乙醇洗脱液；

（3）将步骤（2）获得的90%乙醇洗脱液减压浓缩至浸膏状，经真空干燥或冷冻干燥成干粉，即得山豆根中具异戊烯基黄酮部位。

本发明中的乙醇浓度均为体积浓度。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：

（1）本发明所述的方法采用高浓度乙醇提取，大孔吸附树脂分离富集的工艺简单，高效，过程简便，目标明确，适合工业生产；

（2）本发明整个工艺过程中，除使用乙醇外，未带入其他外源物质，并且在减压浓缩过程中可除去；未使用其它任何毒性有机溶剂，安全、环保；

（3）本发明所用树脂均可再生并重复使用，有利于降低工艺的成本。

（四）附图说明

图1 为山豆根中具异戊烯基黄酮对照品的HPLC图谱；

图2为实施例1大孔吸附树脂50%乙醇洗脱液的HPLC图谱；

图3是实施例1中大孔吸附树脂90%乙醇洗脱液的HPLC图谱；

图4 为实施例1中山豆根中具异戊烯基黄酮部位的HPLC图谱。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明制得的具异戊烯基黄酮部位的检测采用高效液相色谱-示差折光检测法和碘化铋钾显色剂进行检测，色谱分析条件如下：

仪器：高效液相色谱仪（Agilent1260四元液相色谱，安捷伦科技有限公司）

色谱柱：Eclipse XDB-C18色谱柱（250×4.6 mm，5 μm，Agilent）；Zorbax SB C18 保护柱（12.5×4.6 mm，5 μm，Agilent）；

流动相：乙腈（A）-0.03%甲酸（B）；

流速：1.0mL·min^-1；

检测波长：280nm；

柱温：40℃；

进样量：20μL；

洗脱梯度表

图1 为山豆根中具异戊烯基黄酮对照品的HPLC图谱；表1 为山豆根中具异戊烯基黄酮对照品：

表1

实施例1

（1）取40~200目山豆根药材粉末500g与95%乙醇按质量比1∶10混合，回流提取60分钟，过滤，再加入8倍量的95%乙醇，回流提取60分钟，过滤，合并提取液；

（2）取步骤（1）中合并提取液，减压浓缩至干，使用100ml 25%乙醇溶解，备用；

（3）将步骤（2）获得的25%乙醇溶液通过AB-8大孔吸附树脂，首先使用50%乙醇洗脱，冲洗8个保留体积，然后使用90%乙醇洗脱，冲洗10个保留体积，收集洗脱液，至洗脱液至无色；

（4）将步骤（3）获得的90%乙醇洗脱液减压浓缩，至浸膏状，经真空干燥或冷冻干燥成干粉，即得山豆根中具异戊烯基黄酮部位。

（5）取少量步骤（4）获得的浸膏于试管中，使用95%乙醇溶解，以95%乙醇溶液作为对照溶液，然后滴加碘化铋钾溶液，未呈现阳性反应，表明其中无生物碱成分的残留，与生物碱成分得到了很好的分离。

（6）使用HPLC对经大孔吸附树脂柱层析分离得到的组分进行检测，结果如图2、3、4。HPLC检测表明90%乙醇洗脱液中具异戊烯基黄酮部位得到了有效的富集，已知结构色谱峰的峰面积占到了总峰面积的70%以上，同时，紫外分光光度法测定总黄酮含量从23.21%（95%乙醇粗提物）提高到71.65%。

实施例2

（1）取40~200目山豆根药材粉末500g与95%乙醇按质量比1∶15混合，回流提取90分钟，过滤，再加入10倍量的95%乙醇，回流提取60分钟，过滤，合并提取液；

（2）取步骤（1）中合并提取液，减压浓缩至醇浓度为25%，备用；

（3）将步骤（2）获得的25%乙醇溶液通过AB-8大孔吸附树脂，首先使用50%乙醇洗脱，冲洗10个保留体积，然后使用90%乙醇洗脱，冲洗10个保留体积，收集洗脱液，至洗脱液至无色；

（6）使用HPLC对经大孔吸附树脂柱层析分离得到的组分进行检测。HPLC检测表明90%乙醇洗脱液中具异戊烯基黄酮部位得到了有效的富集，已知结构色谱峰的峰面积占到了总峰面积的70%以上，同时，紫外分光光度法测定总黄酮含量从22.57%（95%乙醇粗提物）提高到73.17%。

实施例3

（1）取40~200目山豆根药材粉末1000g与95%乙醇按质量比1∶20混合，回流提取90分钟，过滤，再加入10倍量的95%乙醇，回流提取60分钟，过滤，再加入8倍量的95%乙醇，回流提取60分钟，过滤，合并提取液；

（6）使用HPLC对经大孔吸附树脂柱层析分离得到的组分进行检测。HPLC检测表明90%乙醇洗脱液中具异戊烯基黄酮部位得到了有效的富集，已知结构色谱峰的峰面积占到了总峰面积的70%以上，同时，紫外分光光度法测定总黄酮含量从22.87%（95%乙醇粗提物）提高到70.06%。

实施例4

实施步骤同实施例2，其中的大孔吸附树脂为D-101。最终结果与以上实施例相同。最终结果表明90%乙醇洗脱液中具异戊烯基黄酮部位得到了有效的富集，已知结构色谱峰的峰面积占到了总峰面积的70%以上，同时，紫外分光光度法测定总黄酮含量从22.57%（95%乙醇粗提物）提高到70.14%。

实施例5

实施步骤同实施例3，其中的大孔吸附树脂为D-101。最终结果与以上实施例相同。最终结果表明90%乙醇洗脱液中具异戊烯基黄酮部位得到了有效的富集，已知结构色谱峰的峰面积占到了总峰面积的70%以上，同时，紫外分光光度法测定总黄酮含量从22.87%（95%乙醇粗提物）提高到68.42%。

实施例6

步骤(3)中，先用40%乙醇洗涤，再用80%乙醇洗涤，其他实施步骤同实施例1。最终结果表明80%乙醇洗脱液中具异戊烯基黄酮部位得到了有效的富集，已知结构色谱峰的峰面积占到了总峰面积的70%以上，同时，紫外分光光度法测定总黄酮含量从23.21%（95%乙醇粗提物）提高到68.73%。

实施例7

步骤（1）中用80%乙醇进行提取，其他实施步骤同实施例1。最后结果表明80%乙醇洗脱液中具异戊烯基黄酮部位得到了有效的富集，已知结构色谱峰的峰面积占到了总峰面积的70%以上，同时，紫外分光光度法测定总黄酮含量从18.57%（80%乙醇粗提物）提高到61.28%。

Claims

1.一种分离富集山豆根中具异戊烯基黄酮部位的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：使山豆根的乙醇提取液通过大孔吸附树脂进行柱色谱分离，所述大孔吸附树脂为大孔吸附树脂D101或大孔吸附树脂AB-8，依次用40％-50％乙醇、80％-95％乙醇洗脱，收集80％-95％乙醇洗脱液，浓缩至浸膏状，干燥得到山豆根中具异戊烯基黄酮部位；所述的山豆根的乙醇提取液通过如下方法获得：将山豆根药材粉碎，加入8～20倍的70％-95％乙醇，回流提取，提取液过滤，取滤液浓缩至乙醇浓度为20％-40％，即得山豆根的乙醇提取液。

2.如权利要求1所述的分离富集山豆根中具异戊烯基黄酮部位的方法，其特征在于：回流提取2～3次，每次60～90分钟。

3.如权利要求2所述的分离富集山豆根中具异戊烯基黄酮部位的方法，其特征在于山豆根药材用95％乙醇提取。

4.如权利要求1～3之一所述的分离富集山豆根中具异戊烯基黄酮部位的方法，其特征在于：用40％-50％乙醇或80％-95％乙醇洗脱时，每个浓度冲洗8～10个保留体积。

5.如权利要求1～3之一所述的分离富集山豆根中具异戊烯基黄酮部位的方法，其特征在于：柱色谱分离过程中，先用50％乙醇洗脱，再用90％乙醇洗脱。

6.如权利要求1所述的分离富集山豆根中具异戊烯基黄酮部位的方法，其特征在于所述方法按照如下步骤进行：

(1)将山豆根药材粉碎，加入8～20倍的70％-95％乙醇，回流提取，过滤，取滤液浓缩至乙醇浓度为20％-40％，得到山豆根的乙醇提取液；

(2)将山豆根的乙醇提取液通过大孔吸附树脂，依序用40％-50％乙醇、80％-95％乙醇洗脱，每个浓度冲洗8～10个保留体积，收集80％-95％乙醇洗脱液；

(3)将步骤(2)获得的80％-95％乙醇洗脱液减压浓缩至浸膏状，经真空干燥或冷冻干燥成干粉，即得山豆根中具异戊烯基黄酮部位。

7.如权利要求1所述的分离富集山豆根中具异戊烯基黄酮部位的方法，其特征在于所述方法按照如下步骤进行：

(1)将山豆根药材粉碎，加入8～20倍的95％乙醇，回流提取2～3次，每次60～90分钟，过滤，取滤液浓缩至乙醇浓度为20％-40％，得到山豆根的乙醇提取液；

(2)将山豆根的乙醇提取液通过大孔吸附树脂，依序用50％乙醇、90％乙醇洗脱，每个浓度冲洗8～10个保留体积，收集90％乙醇洗脱液；

(3)将步骤(2)获得的90％乙醇洗脱液减压浓缩至浸膏状，经真空干燥或冷冻干燥成干粉，即得山豆根中具异戊烯基黄酮部位。