CN102911218B - 从甘草中同步分离甘草苷和甘草苷芹糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及从中草药中制备活性成分的方法，具体涉及一种从甘草中同步分离甘草苷和甘草苷芹糖的方法。以甘草为原料，经加热回流或超声提取、大孔树脂串联吸附、梯度解吸附、解析液回收有机溶剂后再进行二次吸附、解吸附，最后经中压梯度洗脱系统同时得到纯度为90％-98％的甘草苷和甘草苷芹糖。该方法工艺流程短，操作简单，同时分离出高纯度的甘草苷和甘草苷芹糖，不仅成本低廉而且适用于较大规模的制备。
Description
技术领域
本发明涉及从中草药中制备活性成分的方法，具体涉及一种从甘草中同步分离甘草苷和甘草苷芹糖的方法。
背景技术
甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch．、胀果甘草Glycyrrhiza inflata Bat．或光果甘草Glycyrrhiza glabra L．的干燥根及根茎。临床中的应用有甘草和炙甘草，其中甘草具有补脾益气、清热解毒、化痰止咳、缓急止痛等作用，常用于治疗脾胃虚弱，倦怠乏力，咳嗽痰多等。甘草中主要含有皂苷和黄酮类成分，研究发现甘草黄酮类成分有抗菌、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒等生理活性。甘草苷是甘草中主要的黄酮类成分，具有抗病毒，抗氧化，抗心律失常等作用。同时，甘草苷还是食品高甜度的甜味剂和解毒剂，其甜度约为蔗糖的177倍，2010年版《中国药典》中规定甘草干燥品含甘草苷不得少于0.5％，其含量的高低作为评价甘草质量的重要指标。甘草苷芹糖是甘草中重要的黄酮类成分，据报道，甘草苷芹糖具有止咳、平喘、祛痰、抗病毒等作用。
现有技术中分离纯化活性成分的方法较多，主要有色谱法，但是不同植物中含有的活性成分种类和结构都存在很大的差异，从而化学性质存在差异，在提取纯化过程中套用一般的提取纯化方法，得到的活性成分的纯度不高，如要达到很高的纯度，其分离效率较低，成本较高。目前针对甘草提取纯化高纯度甘草苷和甘草苷芹糖的报道较少，且甘草中化学成分复杂，在提取分离过程中非常困难。公开号为CN101289480发明名称为一种甘草苷的分离制备方法的专利中通过水提醇沉、膜分离，然后使用大孔树脂分离甘草苷；公开号为CN102050851A发明名称为甘草苷及其制备方法的专利，是从甘草酸粉中提取甘草苷，采用稀氨水提取，有机溶剂萃取，然后聚酰胺树脂分离甘草苷；公开号为CN102391330A发明名称为从甘草中提取甘草苷的方法的专利，通过水提、过混合树脂柱分离得到甘草苷，但是这些方法均采用单级分离的方式，并且产量低，不适合大规模生产；申请号为200710011041.0发明名称一种甘草苷的制备方法中公开甘草药材通过水提、醇沉、先后经分子量膜分离仪、大孔树脂柱、高效工业色谱柱分离，冷冻干燥得甘草苷，该方法虽然一次制备量大，但是该方法仍然采取单级分离的方式，生产效率低，并且仅得到了甘草苷，造成了资源的浪费。
总之，现有的方法均有间歇不连续化操作、上柱液和洗脱液利用率不高等缺点，合理利用树脂的选择性吸附分离的优势，优化分离工艺，将大大降低生产成本，提高生产效率，无毒环保，为甘草苷和甘草苷芹糖的制备工艺开辟全新的工业格局。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从甘草中同步分离甘草苷和甘草苷芹糖的方法。
具体操作步骤如下：
为实现上述目的本发明采用技术方案为：
一种从甘草中同步分离甘草苷和甘草苷芹糖的方法，
1）提取：以甘草为原料,加入到原料8-20倍量（mL/g）的溶剂中，经回流或超声提取，提取液减压浓缩所得残液即为中间产物A，其中原料与溶剂按质量体积比混合。
2）树脂柱一次分离纯化：将中间产物A以1-10BV/h的流速通过大孔树脂柱，动态吸附至穿透；再用5-15BV的蒸馏水以5-20BV/h的流速淋洗上述大孔吸附树脂柱洗脱至无色，除去水溶性杂质；最后用浓度为40％-70％的乙醇以5-15BV/h的流速进行洗脱，收集洗脱液直至洗脱液无色，而后减压浓缩所得残液即为中间产物B；
3）树脂柱的二次分离纯化：中间产物B以1-10BV/h的流速通过大孔吸附树脂柱，动态吸附至穿透；再用5-15BV的蒸馏水以5-20BV/h的流速淋洗上述大孔吸附树脂柱去除水溶性杂质；最后用30％-50％的乙醇以5-20BV/h的流速进行洗脱，收集洗脱液直至洗脱液无色，将收集的洗脱液减压浓缩至浸膏，即得中间产物C；
4）中压梯度洗脱系统分离：中间产物C以甲醇和水为流动相，用中压梯度洗脱系统在50-200ml/min的流速下进一步分离，按出峰时间先后顺序分别收集甘草苷芹糖和甘草苷（其中，收集出峰时间为26-28min的色谱峰即为甘草苷芹糖，收集出峰时间为29-31min的色谱峰即为甘草苷）。
所述步骤1）将原料甘草干燥粉碎至30-50目后，加至8-20倍量（mL/g）的溶剂中，经回流或超声提取2-3次，每次1-3小时，合并提取液，提取液过滤后，减压浓缩回收溶剂，残液中加入水使其浓度为5-20g/L，充分混匀，即得中间产物A；所述提取溶剂为体积分数为70％-100％的甲醇或乙醇。
所述步骤2）和步骤3）中的大孔吸附树脂柱为串联的大孔吸附树脂柱；所述各个串联的大孔吸附树脂柱的径高比为1:4-1:10。
所述步骤2）和步骤3）中的大孔树脂为非极性吸附树脂、弱极性吸附树脂或中极性吸附树脂；串联的大孔吸附树脂柱可以是一种树脂或几种树脂的组合；串联的大孔吸附树脂柱至少为3级串联。
所述步骤2）和步骤3）洗脱处理后的大孔吸附树脂柱经再生液再生后可重复利用，从而达到连续操作的目的。所述再生液为无水乙醇。
步骤（2）和步骤（3）所述的各级吸附柱包括玻璃柱、耐有机溶剂不锈钢柱、搪瓷柱等。
所述步骤4）中间产物C以粒径为15-40μm的C18硅胶键合固定相为色谱填料，以甲醇和水为流动相，梯度洗脱，按出峰时间的先后顺序分别收集甘草苷芹糖和甘草苷本发明具有以下优点：
1.本发明提取方法采用多柱串联吸附技术，不仅实现了连续操作，而且对原料液的处理量大，分离效果好；
2.本发明采用多柱串联吸附技术可使得其每级单柱实现穿透吸附后再进行切换，有效提高了树脂的利用率，同时也提高了样品的浓度；
3.本发明中各级吸附柱洗杂后溶液尾流还可以重复利用上柱，减少了样品损失；同时洗脱剂和再生剂均可回收重复利用，降低了生产成本；
4.本发明选择多柱串联装置的填料为大孔吸附树脂，其具有吸附容量大，选择性好，易于吸附，机械强度高，再生处理简单，吸附速度快，操作简单，得率恒定，产品质量稳定，适合甘草苷和甘草苷芹糖的分离富集；
5.本发明采用中压梯度洗脱系统，填料为高分离能力的ODS（C18键合固定相）分离材料，利用中压梯度洗脱系统的高分离能力，可以保证产品的纯度；
6.本发明采用一次制备，操作简单，控制参数少，效率高，易于工业放大，同时得到高纯度的极性比较相近的甘草苷和甘草苷芹糖两种活性成分；
7.本发明方法能解决常规方法中大孔树脂对甘草苷和甘草苷芹糖的吸附和洗脱过程中对原料液、洗脱液利用率低等缺点，实现甘草苷和甘草苷芹糖的同步高效高纯度提取，并适宜工业生产。同时利用中压梯度洗脱系统高效快速的制备出高纯度甘草苷和甘草苷芹糖。该方法工艺流程短，操作简单，不仅成本低廉而且适用于较大规模的制备。
附图说明
图1为本发明实施例提供的甘草苷的高效液相色谱图；
图2为本发明实施例提供的甘草苷芹糖的高效液相色谱图。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，但本发明不限于此。
本发明以甘草为原料，经回流或超声提取、大孔吸附树脂串联吸附、解吸附，回收溶剂，经中压梯度洗脱系统分别得到高纯度的甘草苷和甘草苷芹糖。
本发明所述实施例中，甘草苷和甘草苷芹糖的纯度采用高效液相色谱法进行检测，所用色谱柱为Zorbax Extend-C18（4.6mm×250mm，5μm)，检测波长为254nm，流动相A为0.1%三氟乙酸水溶液，B为乙腈，流速为1mL/min，进样量为10μL，梯度洗脱程序如表1。
表1HPLC梯度洗脱程序
实施例1
（1）提取：取甘草粉末0.5kg，加入体积分数为85％的甲醇5L，经加热回流提取2h，过滤，滤渣中再加入85％的甲醇5L，加热回流2h，过滤，合并两次提取液，提取液压浓缩回收有机溶剂，残液中加入水，充分混匀，使其残液浓度为10g/L，即得中间产物A。
（2）树脂柱一次分离纯化：中间产物A以流速为3BV/h的速度通过装填有按常规方法处理后的3级串联的D101树脂柱，动态吸附至穿透，其中每级D101树脂柱的径高比为1:10；树脂柱用流速为8BV/h的水洗脱除去水溶性杂质，弃去水解析液；用60％的乙醇对洗杂后的串联树脂柱进行洗脱，收集洗脱液至洗脱液无色，将所收集的流出液减压浓缩回收有机溶剂，残液中加入适量水，使其浓度为10g/L，即得中间产物B。
（3）树脂柱的二次分离纯化：中间产物B以流速为3BV/h的速度通过3级串联的AB-8大孔吸附树脂柱进行二次吸附，动态吸附至穿透，其中每级AB-8树脂柱的径高比为1:6；树脂柱用流速为6BV/h的水洗脱除去水溶性杂质，弃去水解析液；再用流速为6BV/h的50％的乙醇对串联树脂柱进行洗脱，收集洗脱液至洗脱液无色，将所收集得流出液过滤后减压浓缩得到浸膏，即得中间产物C。
（4）中压梯度洗脱系统分离：中间产物C用30％的甲醇溶解，中压梯度洗脱系统进一步分离，具体为以粒径为15-40μm的C18硅胶键合固定相为色谱填料，色谱柱规格为60mm×400mm，以甲醇和水为流动相，梯度洗脱，分3次进样，甘草苷芹糖每次收集出峰时间为26-28min的色谱峰，甘草苷收集出峰时间为29-31min的色谱峰（梯度程序如表2），合并3次洗脱组分，减压浓缩回收有机溶剂，冷冻干燥分别得到甘草苷芹糖0.52g，甘草苷0.71g。经高效液相色谱分析，甘草苷芹糖的纯度为94.8％，甘草苷纯度为96.4％（参见图1和图2）。
表2中压梯度洗脱系统梯度洗脱程序1
实施例2
（1）提取：取甘草粉末1kg，加入75％的甲醇10L，经超声提取2h，过滤，滤渣中再加入75％的甲醇10L，超声提取2h，过滤，合并两次提取液，提取液减压浓缩回收有机溶剂，残液中加入水，充分混匀，使其浓度为8g/L，即得中间产物A。
（2）树脂柱一次分离纯化：中间产物A以流速为5BV/h的速度通过装填有径高比为1:8的AB-8树脂柱，4级串联，动态吸附至穿透，其中每级AB-8树脂柱的径高比为1:6；树脂柱用流速为8BV/h的水洗脱除去水溶性杂质，弃去水解析液；用70％的乙醇以5BV/h的速度对洗杂后的串联树脂柱进行洗脱，收集洗脱液至洗脱液无色，将所收集得流出液减压浓缩回收有机溶剂，残液中加入适量水，使其浓度为8g/L，即得中间产物B。
（3）树脂柱的二次分离纯化：中间产物B以流速为5BV/h的速度通过4级串联的D101大孔吸附树脂柱进行二次吸附，其中每级D101树脂柱的径高比为1:8动态吸附至穿透；树脂柱用流速为7BV/h的水洗脱除去水溶性杂质，弃去水解析液；再用流速为7BV/h的50％的乙醇对串联树脂柱进行洗脱，收集洗脱液至洗脱液无色，将所收集的流出液过滤后减压浓缩得到浸膏，即得中间产物C。
（4）中压梯度洗脱系统分离：中间产物C用30％的甲醇溶解，中压梯度洗脱系统进一步分离，具体为以粒径为15-40μm的C18硅胶键合固定相为色谱填料，色谱柱规格为60mm×400mm，以甲醇和水为流动相，梯度洗脱、分6次进样，甘草苷芹糖每次收集出峰时间为26-28min的色谱峰，甘草苷收集29-31min的色谱峰（梯度程序如表2），分别合并6次洗脱组分，减压浓缩回收有机溶剂，再冷冻干燥分别得到甘草苷芹糖1.15g，甘草苷1.58g。经高效液相色谱分析，甘草苷芹糖的纯度为93.9％，甘草苷纯度为95.8％。
实施例3
（1）提取：取甘草粉末2kg，加入70％的乙醇20L，经超声提取1h，过滤，滤渣中再加入70％的乙醇20L，超声1h，过滤，合并两次提取液，提取液减压浓缩回收有机溶剂，残液中加入水，充分混匀，使其浓度为12g/L，即得中间产物A。
（2）树脂柱一次分离纯化：中间产物A以流速为8BV/h的速度通过装填有按常规方法处理后的D101树脂柱，5级串联，径高比为1:10，动态吸附至穿透，树脂柱用流速为10BV/h的水洗脱除去水溶性杂质，弃去水解析液。用60％的乙醇以6BV/h对洗杂后的串联树脂柱进行洗脱，收集洗脱液至洗脱液无色，将所收集的流出液减压浓缩回收有机溶剂，残液中加入适量水，使其浓度为12g/L，即得中间产物B。
（3）树脂柱的二次分离纯化：中间产物B以流速为6BV/h的速度通过5级串联的X-5树脂柱进行二次吸附，动态吸附至穿透，其中每级X-5树脂柱的径高比为1:9；树脂柱用流速为10BV/h的水洗脱除去水溶性杂质，弃去水解析液；再用流速为6BV/h的50％的乙醇对串联树脂柱进行洗脱，收集洗脱液至洗脱液无色，将所收集得流出液过滤后减压浓缩得到浸膏，即得中间产物C。
（4）中压梯度洗脱系统分离：中间产物C用30％的甲醇溶解，中压梯度洗脱系统进一步分离，以粒径为15-40μm的C18硅胶键合固定相为色谱填料，色谱柱规格为70mm×500mm，以甲醇和水为流动相，梯度洗脱，分8次进样，甘草苷芹糖每次收集出峰时间为25-27min的色谱峰，甘草苷收集28-30min的色谱峰（梯度程序如表3），合并8次洗脱组分，减压浓缩回收有机溶剂，冷冻干燥分别得到甘草苷芹糖2.71g，甘草苷3.28g。经高效液相色谱分析，甘草苷芹糖的纯度为94.6％，甘草苷纯度为95.1％。
表3中压梯度洗脱系统梯度洗脱程序2
实施例4
（1）提取：取甘草粉末5kg，加入95％的乙醇40L，超声提取2h，过滤，滤渣中再加入50L体积分数为95％的乙醇，超声提取2h，过滤，合并两次提取液，提取液减压浓缩回收有机溶剂，残液中加入水，充分混匀，使其浓度为15g/L，即得中间产物A。
（2）树脂柱一次分离纯化：中间产物A以流速为6BV/h的速度通过装填有按常规方法处理后的AB-8树脂柱，6级串联，高径比为1:10，动态吸附至穿透，树脂柱用流速为8BV/h的水洗脱除去水溶性杂质，弃去水解析液。用60％的乙醇以8BV/h的流速对洗杂后的串联树脂柱进行洗脱，收集洗脱液至洗脱液无色，将所收集的流出液减压浓缩回收有机溶剂，残液中加入适量水，使其浓度为15g/L，即得中间产物B。
（3）树脂柱的二次分离纯化：中间产物B以流速为6BV/h的速度通过6级串联的X-5大孔吸附树脂柱进行二次吸附，其中每级X-5树脂柱的径高比为1:6动态吸附至穿透，树脂柱用流速为8BV/h的水洗脱除去水溶性杂质，弃去水解析液，再用流速为8BV/h的50％的乙醇对串联树脂柱进行洗脱，收集洗脱液至洗脱液无色，将所收集得流出液过滤后减压浓缩得到浸膏，即得中间产物C。
（4）中压梯度洗脱系统分离：中间产物C用30％的甲醇溶解，中压梯度洗脱系统进一步分离，以粒径为15-40μm的C18硅胶键合固定相为色谱填料，色谱柱规格为70mm×500mm，以甲醇和水为流动相，梯度洗脱，分12次进样，甘草苷芹糖每次收集出峰时间为25-27min的色谱峰，甘草苷收集28-30min的色谱峰（梯度程序如表3），合并12次洗脱组分，减压浓缩回收有机溶剂，冷冻干燥分别得到甘草苷芹糖7.11g，甘草苷8.76g。经高效液相色谱分析，甘草苷芹糖的纯度为93.8％,甘草苷纯度为96.5％。
Claims (4)
1.一种从甘草中同步分离甘草苷和甘草苷芹糖的方法，其特征在于：
1)提取：以甘草为原料,加入到8-20倍量(mL/g)的溶剂中，经回流或超声提取，提取液减压浓缩所得残液即为中间产物A；
2)树脂柱一次分离纯化：将中间产物A以1-10BV/h的流速通过大孔树脂柱，动态吸附至穿透；再用5-15BV的蒸馏水以5-20BV/h的流速淋洗上述大孔吸附树脂柱洗脱至无色，除去水溶性杂质；最后用浓度为40％-70％的乙醇以5-15BV/h的流速进行洗脱，收集洗脱液直至洗脱液无色，而后减压浓缩所得残液即为中间产物B；
3)树脂柱的二次分离纯化：
中间产物B以1-10BV/h的流速通过大孔吸附树脂柱，动态吸附至穿透；再用5-15BV的蒸馏水以5-20BV/h的流速淋洗上述大孔吸附树脂柱去除水溶性杂质；最后用30％-50％的乙醇以5-20BV/h的流速进行洗脱，收集洗脱液直至洗脱液无色，将收集的洗脱液减压浓缩至浸膏，即得中间产物C；
4)中压梯度洗脱系统分离：中间产物C以甲醇和水为流动相，用中压梯度洗脱系统在50-200ml/min的流速下进一步分离，按出峰时间先后顺序分别收集甘草苷芹糖和甘草苷；
所述步骤2)和步骤3)中的大孔吸附树脂柱为串联的大孔吸附树脂柱；所述各个串联的大孔吸附树脂柱的径高比为1:4-1:10；
所述步骤4)中间产物C以粒径为15-40μm的C18硅胶键合固定相为色谱填料，以甲醇和水为流动相，梯度洗脱，按出峰时间的先后顺序分别收集甘草苷芹糖和甘草苷；
所述步骤1)将原料甘草干燥粉碎至30-50目后，加至8-20倍量(mL/g)的溶剂中，经回流或超声提取2-3次，每次1-3小时，合并提取液，提取液过滤后，减压浓缩回收溶剂，残液中加入水使其浓度为5-20g/L，充分混匀，即得中间产物A；所述提取溶剂为体积分数为70％-100％的甲醇或乙醇；
所述步骤2)和步骤3)中的大孔树脂为D101树脂柱、AB-8大孔吸附树脂柱、X-5树脂柱；串联的大孔吸附树脂柱可以是一种树脂或几种树脂的组合；串联的大孔吸附树脂柱为3-6级串联。
2.按权利要求1所述的从甘草中同步分离甘草苷和甘草苷芹糖的方法，其特征在于：所述步骤2)和步骤3)洗脱处理后的大孔吸附树脂柱经再生液再生后可重复利用，从而达到连续操作的目的。
3.按权利要求1所述的从甘草中同步分离甘草苷和甘草苷芹糖的方法，其特征在于：步骤(2)和步骤(3)所述的各级吸附柱为玻璃柱、耐有机溶剂不锈钢柱、搪瓷柱。
4.按权利要求2所述的从甘草中同步提取甘草苷和甘草苷芹糖的方法，其特征在于：所述再生液为无水乙醇。
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