CN101073595A - 甘草总黄酮和总皂苷提取物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从中药甘草中提取得到的总黄酮和总皂苷提取物及其制备方法。该方法所得的甘草总黄酮提取物主要包括甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素及其衍生物等，总皂苷提取物主要包括甘草酸、甘草次酸及其衍生物等。该提取物可由溶剂提取法、溶剂萃取法、大孔吸附树脂法、铅盐沉淀法、柱色谱法、液－液逆流分配色谱法等任意一种方法，或这些方法的任意组合制备获得。所制得的甘草总黄酮提取物中各种黄酮类成分百分含量的总和为5～100％(w/w)，其中甘草苷的含量占总黄酮含量的5～100％(w/w)；所制得的甘草总皂苷提取物中各种皂苷类成分百分含量的总和为5～100％(w/w)，其中甘草酸的含量占总皂苷含量的5～100％(w/w)。

Description

甘草总黄酮和总皂苷提取物及其制备方法

技术领域

本发明属医药技术领域，具体涉及中药甘草总黄酮和总皂苷提取物及其制备方法、质量控制方法及其在医药和保健食品领域的应用。

背景技术

传统中医药理论认为甘草具有补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药的作用的功效，用于脾胃虚弱，倦怠乏力，心悸气短，咳嗽痰多，脘腹、四肢挛急疼痛，痈肿疮毒，缓解药物毒性、烈性。甘草中的黄酮、皂苷类成分为其主要有效成分。现代药理研究表明，甘草黄酮具有抑菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化等药理作用，甘草皂苷具有解毒作用、止咳平喘作用、抗炎及抗过敏作用、抗肝损伤以及降低胆固醇作用。目前，有关甘草中黄酮、皂苷成分的制备方法的专利较多，如申请号为200610018275.3、01130599.1、97115712.X、95109065.8的专利等，但本发明专利公开的一种同时提取分离甘草总黄酮、总皂苷的制备方法，能使甘草黄酮、皂苷同时被提取，有效避免了单一提取所带来的资源浪费，提高了甘草的综合利用率，降低了甘草深加工的成本。同时制备方法更为简便，实用，易于工业化生产。

发明内容

本发明提供一种从甘草中提取制备的甘草总黄酮和总皂苷提取物。

本发明还提供一种同时提取、分离、制备甘草总黄酮和总皂苷提取物的方法。

本发明所述原料甘草，来源于豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fish.、胀果甘草Glycyrrhiza inflata Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根及根茎。作为提取甘草总黄酮、总皂苷的原材料，可以是市售甘草饮片，也可以是这些植物的茎、叶、花穗、果实、地下根茎及根等任一部位或全部植株，其中优选的药材部位为干燥根及根茎。上述所述的甘草包括未经任何炮制处理的原药材及饮片，还包括各种炮制品，如“蜜炙甘草”等。

本发明所述的甘草总黄酮和总皂苷提取物，是指从上述任一植物的任何部位提取得到的，包含多种黄酮、皂苷类活性成分的组合物，其中优选的是豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fish.、胀果甘草Glycyrrhiza inflata Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根及根茎中提取制备得到的，含有多种黄酮、皂苷类活性成分的组合物。甘草黄酮类成分主要包括甘草苷、甘草素、异甘草苷、异甘草素等化合物，这些化合物分别属于黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇、查尔酮、异黄酮、二氢异黄酮、异黄烷等衍生物，甘草皂苷类成分主要是一系列以齐墩果烷为结构母核的化合物，如甘草酸、甘草次酸等。

作为甘草总黄酮和总皂苷提取物，其中甘草总黄酮提取物中各种黄酮类成分百分含量的总和为5～100％(w/w)，优选的为50～100％(w/w)；甘草总皂苷提取物各种皂苷类成分百分含量的总和为5～100％(w/w)，优选的为50～100％(w/w)。

作为甘草总黄酮和总皂苷提取物，在本发明所述的甘草总黄酮提取物所涵盖的各种黄酮类活性成分之中，最主要的是甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素等成分。其中甘草总黄酮提取物中甘草苷的含量占全部总黄酮含量的5～100％(w/w)。

作为甘草总黄酮和总皂苷提取物，在本发明所述的甘草总皂苷提取物所涵盖的各种皂苷类活性成分之中，最主要的是甘草酸、甘草次酸等成分。其中甘草总皂苷提取物中甘草酸的含量占全部总皂苷含量的5～100％(w/w)

本发明还提出了所述甘草总黄酮和总皂苷提取物的制备工艺，它可以采用以下任意一种方法，或这些方法的任意组合进行制备：(1)溶剂提取法；(2)溶剂萃取法；(3)大孔吸附树脂法；(4)铅盐沉淀法；(5)超临界流体萃取法；(6)柱色谱法；(7)液-液逆流分配色谱法。其中优选的方法为大孔吸附树脂法与聚酰胺柱色谱法联用的方法。

在使用这些方法进行制备时，一般包括以下几个步骤：

(1)提取：所用溶剂可以是水或任意一种醇类、酮类及酯类溶剂，或这些溶剂按一定比例组成的混合溶剂，或由这些溶剂与酸、碱、盐配成的酸性或碱性溶剂。提取方法可以是煎煮、加热回流、超声提取、冷浸、渗漉、微波提取、高压提取等。

优选的提取工艺为：甘草药材加0～90％乙醇，回流提取2～3次，每次提取1～2小时，溶剂用量为5～15倍量(L/kg)。

(2)过滤：包括离心、抽滤、超滤、压滤等方法，使用或不使用以下任意一种澄清剂或其组合：醇沉剂，明胶，高岭土，各种树脂，聚乙二醇，聚乙三醇，壳聚糖以及天然澄清剂成品如101果汁澄清剂、ZTC+1天然澄清剂等。

(3)浓缩：包括常压或减压条件下的薄膜蒸发、旋转蒸发及煎煮浓缩等。

(4)干燥：包括真空干燥、喷雾干燥、冷冻干燥等。

当采用溶剂萃取法进行制备时，一般先将提取物混悬于水中，然后用低极性的酯类、烷烃类或醚类溶剂(如石油醚、乙醚、己烷、汽油、乙酸乙酯等)萃取除去脂溶性杂质，然后用合适极性的溶剂，如氯仿、乙酸乙酯、丙酮、正丁醇等，或是这些溶剂的混合物，萃取获得其中的总黄酮和总皂苷成分，得甘草总黄酮和总皂苷提取物。

当采用大孔吸附树脂法进行制备时，所用的大孔树脂可以是非极性、弱极性、中等极性、弱碱性或弱酸性等任意一种类型，如D101、D4020、HPD400、AB-8、S-8、HZ-806等，其中优选的为弱极性或中等极性的树脂，如AB-8、HPD400、D101等。所用的洗脱剂为水和含水的乙醇、甲醇、丙酮等，其中优选的为0～100％的乙醇。

优选的甘草总黄酮和总皂苷提取物树脂纯化工艺为：选用AB-8、HPD400等中等极性或弱极性大孔吸附树脂作为纯化用树脂，甘草提取物上样液浓度为0.02～0.5g/ml(以生药量计)，吸附流速3～9BV/h，树脂柱径高比1∶5～1∶10，上样量为0.2～1.5g/mL(以生药量计)，0％乙醇洗脱1～4倍树脂体积进行除杂，除杂流速为3～8BV/h，用40～90％乙醇洗脱3～6倍树脂体积，洗脱流速为5～9BV/h。醇洗脱液回收溶剂，蒸干，得甘草总黄酮和总皂苷提取物。

当采用铅盐沉淀法进行制备时，所用的铅盐试剂为醋酸铅或碱式醋酸铅，所用的脱铅剂为H2S、磷酸盐及硫酸盐等。

当采用超临界流体萃取法进行制备时，可以对甘草原材料直接进行萃取，也可以对上述任一方法和步骤所获得的产物进行萃取。萃取时可以使用或不使用以下任一种类溶剂及溶剂混合物：水、醇类、酮类及酯类溶剂。

当采用柱色谱法进行制备时，其处理的对象可以是上述提取步骤所获得的产物，也可以是经上述溶剂提取法、溶剂萃取法、大孔吸附树脂法、铅盐沉淀法或超临界流体萃取法初步纯化后的产物。所用的固定相可以是硅胶、聚酰胺、氧化铝、葡聚糖(Sephadex系列或Sephadex LH-20系列)、C-8、C-18、活性炭、纤维素等，所用的洗脱液因固定相的不同而不同，一般是由水、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、石油醚等组成的混合溶剂。

优选的甘草总黄酮和总皂苷提取物柱色谱纯化工艺为：选用聚酰胺作为纯化用吸附剂，上样液浓度为2～20mg/ml(以树脂富集物量计)，吸附流速3～9BV/h，聚酰胺柱径高比1∶5～1∶10，上样量为10～50mg/mL(以树脂富集物量计)。0～20％乙醇洗脱2～5倍柱体积进行除杂，除杂流速为3～8BV/h。除杂液回收溶剂，蒸干，得甘草总皂苷。用40～90％乙醇洗脱3～7倍柱体积，洗脱流速为5～9BV/h。醇洗液回收溶剂，蒸干，得甘草总黄酮。

当采用液-液逆流萃取法进行制备时，其处理的对象可以是上述提取步骤的产物，也可以是经上述溶剂提取法、溶剂萃取法、大孔吸附树脂法、铅盐沉淀法或超临界流体萃取法初步纯化后的产物。一般先将提取物混悬于水中，然后用低极性的酯类、烷烃类或醚类溶剂(如石油醚、乙醚、己烷、汽油、乙酸乙酯等)萃取除去脂溶性杂质，然后用合适极性的溶剂，如氯仿、乙酸乙酯、丙酮、正丁醇等，或是这些溶剂的混合物，萃取获得其中的总黄酮和总皂苷成分，得甘草总黄酮和总皂苷提取物。

该甘草总黄酮和总皂苷提取物可以单独或与其它任何中西药物或食物按任意比例配伍，用于制备药物或功能性食品，所制得的药物或功能性食品可以是胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒剂、口服液、糖浆、冲剂、酒剂、注射剂、膏剂、散剂、饮料等。

本发明质量控制方法可包括以下含量测定方法中的一种或几种：

1.总黄酮

精密称取甘草苷对照品适量(约3mg)，置10mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密吸取新橙皮苷对照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，置具塞、带刻度、装有300mg镁粉的试管中，加50％乙醇至4.5mL，将试管置于15℃水浴中，每隔两分钟滴加浓盐酸0.2mL，并轻轻振摇，直至镁粉完全反应，用浓盐酸定容至7mL，摇匀，放入37℃水浴中保温一小时，取出冷却，于539nm波长处测定吸光度。以甘草苷对照品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

精密称取甘草总黄酮提取物样品各3份，每份5mg，置25mL量瓶中，加50％乙醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取上述样品溶液2.0mL，甘草苷对照品溶液0.2mL、0.8mL，置具塞、带刻度、装有300mg镁粉的试管中，加50％乙醇至4.5mL，将试管置于15℃水浴中，每隔两分钟滴加浓盐酸0.2mL，并轻轻振摇，直至镁粉完全反应，用浓盐酸定容至7mL，摇匀，放入37℃水浴中保温一小时，取出冷却，于539nm波长处测定吸光度，外标两点法计算含量。

2.甘草苷

色谱条件：色谱柱：Hypersil C₁₈柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈-0.5％冰醋酸水溶液(1∶4)；流速：1.0mL/min；检测波长：276nm；柱温：室温。

标准曲线绘制：分别精密吸取甘草苷对照品溶液(浓度为0.045μg/μL)0、2、4、6、8、10μL注入液相色谱仪，测定各色谱峰峰面积，以对照品进样量(μg)为横坐标，色谱峰峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

含量测定：精密称取3批甘草总黄酮提取物样品各3份，每份约11.8mg，置25mL量瓶中，加50％乙醇超声溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为甘草苷含量测定的供试品溶液。精密吸取上述供试品溶液2.5μL，注入液相色谱仪，测定各色谱峰峰面积，计算含量。

3.总皂苷

精密称取甘草酸单铵盐对照品适量(约5mg)，置5mL量瓶中，加80％乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密吸取甘草酸单铵盐对照品溶液0.04ml、0.08ml、0.12ml、0.16ml、0.20ml置10ml量瓶中，分别精密加入80％乙醇0.50ml和4.5％香草醛0.5ml；于冰浴中，加入78％硫酸溶液5.0ml，摇匀；然后将其置于60℃水浴中加热20分钟，冷却至室温，于540nm波长处测定吸光度。以甘草酸单铵盐对照品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

精密称取甘草总皂苷提取物样品各3份，每份40mg，置25mL量瓶中，加50％乙醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取上述样品溶液0.1mL，甘草酸单铵盐对照品溶液0.04mL、0.16mL，置10ml量瓶中，分别精密加入80％乙醇0.50ml和4.5％香草醛0.5ml；于冰浴中，加入78％硫酸溶液5.0ml，摇匀；然后将其置于60℃水浴中加热20分钟，冷却至室温，于540nm波长处测定吸光度。外标两点法计算含量。

4.甘草酸

色谱条件：色谱柱：Hypersil C₁₈柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：甲醇-0.2mol/L醋酸铵溶液-冰醋酸(67∶33∶1)；流速：1.0mL/min；检测波长：254nm；柱温：室温。

标准曲线绘制：分别精密吸取甘草酸单铵盐对照品溶液(浓度为0.27μg/μL)0、2、4、6、8、10μL注入液相色谱仪，测定各色谱峰峰面积，以对照品进样量(μg)为横坐标，色谱峰峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

含量测定：精密称取3批甘草总皂苷提取物样品各3份，每份约20mg，置25mL量瓶中，加50％乙醇超声溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为甘草酸含量测定的供试品溶液。精密吸取上述供试品溶液5.0μL，注入液相色谱仪，测定各色谱峰峰面积，计算含量。

具体实施方式

实施例1：甘草总黄酮和总皂苷提取物制备工艺

取甘草饮片2kg，50％乙醇8L回流提取3次，每次提取1小时，减压回收溶剂，得提取物，加水分散溶解，使上样液浓度为0.14g/ml(以生药量计)，通过6L AB-8大孔吸附树脂，吸附流速3BV/h，树脂柱径高比1∶8，上样量为0.2g/mL(以生药量计)，水洗脱3倍树脂体积进行除杂，除杂流速为3BV/h，用50％乙醇洗脱5倍树脂体积，洗脱流速为3BV/h。将醇洗脱液回收溶剂，蒸干，加水稀释至上样液浓度为5mg/ml(以树脂富集物量计)，通过5L聚酰胺，吸附流速3BV/h，聚酰胺柱径高比1∶8，上样量为20mg/mL(以树脂富集物量计)。水洗脱3倍柱体积进行除杂，除杂流速为3BV/h。除杂液回收溶剂，蒸干，得甘草总皂苷提取物。用70％乙醇洗脱5倍柱体积，洗脱流速为3BV/h。醇洗脱液回收溶剂，蒸干，得甘草总黄酮提取物。测定甘草总皂苷提取物中总皂苷含量为50％，甘草酸含量为39％；甘草总黄酮提取物中总黄酮含量为65％，甘草苷含量为35％。

实施例2：甘草总黄酮和总皂苷提取物制备工艺

取甘草饮片5kg，30％乙醇10L回流提取2次，每次提取1.5小时，减压回收溶剂，得提取物，加水分散溶解，使上样液浓度为0.3g/ml(以生药量计)，通过3L AB-8大孔吸附树脂，吸附流速2BV/h，树脂柱径高比1∶6，上样量为0.4g/mL(以生药量计)，水洗脱4倍树脂体积进行除杂，除杂流速为4BV/h，用70％乙醇洗脱4倍树脂体积，洗脱流速为3BV/h。将醇洗脱液回收溶剂，蒸干，加水稀释至上样液浓度为10mg/ml(以树脂富集物量计)，通过8L聚酰胺，吸附流速2BV/h，聚酰胺柱径高比1∶8，上样量为10mg/mL(以树脂富集物量计)。水洗脱3倍柱体积进行除杂，除杂流速为3BV/h。除杂液回收溶剂，蒸干，得甘草总皂苷提取物。用50％乙醇洗脱5倍柱体积，洗脱流速为3BV/h。醇洗脱液回收溶剂，蒸干，得甘草总黄酮提取物。测定甘草总皂苷提取物中总皂苷含量为52％，甘草酸含量为35％；甘草总黄酮提取物中总黄酮含量为63％，甘草苷含量为33％。

实施例3：甘草总黄酮和总皂苷提取物制备工艺

取甘草饮片10kg，70％乙醇12L回流提取2次，每次提取1小时，减压回收溶剂，得提取物，加水分散溶解，使上样液浓度为0.3g/ml(以生药量计)，通过10L AB-8大孔吸附树脂，吸附流速2BV/h，树脂柱径高比1∶6，上样量为0.1g/mL(以生药量计)，水洗脱3倍树脂体积进行除杂，除杂流速为3BV/h，用50％乙醇洗脱4倍树脂体积，洗脱流速为3BV/h。将醇洗脱液回收溶剂，蒸干，加水稀释至上样液浓度为7.5mg/ml(以树脂富集物量计)，通过5L聚酰胺，吸附流速2BV/h，聚酰胺柱径高比1∶8，上样量为20mg/mL(以树脂富集物量计)。水洗脱4倍柱体积进行除杂，除杂流速为3BV/h。除杂液回收溶剂，蒸干，得甘草总皂苷提取物。用90％乙醇洗脱4倍柱体积，洗脱流速为3BV/h。醇洗脱液回收溶剂，蒸干，得甘草总黄酮提取物。测定甘草总皂苷提取物中总皂苷含量为40％，甘草酸含量为30％；甘草总黄酮提取物中总黄酮含量为66％，甘草苷含量为34％。

实施例4：甘草总黄酮片的制备

甘草总黄酮提取物              100g

淀粉                          100g

上述组分混合均匀，加滑石粉适量，压制成1000片。

实施例5：甘草总皂苷片的制备

甘草总皂苷提取物              100g

淀粉                          100g

上述组分混合均匀，加滑石粉适量，压制成1000片。

Claims (14)

1、一种甘草总黄酮提取物，其特征在于该提取物由中药甘草中提取获得，并含有以下主要成分：甘草苷、甘草素、异甘草苷、异甘草素及其衍生物等。

2、一种甘草总皂苷提取物，其特征在于该提取物由中药甘草中提取获得，并含有以下主要成分：甘草酸、甘草次酸及其衍生物等。

3、如权利要求1、2所述的甘草总黄酮和总皂苷提取物，其特征在于甘草为市售甘草或豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fish.、胀果甘草Glycyrrhiza inflata Bat.或光果甘草Giycyrrhiza glabra L.的全部植株或任何部位，如根、根茎、茎、叶、花穗、果实等，还包括经过炮制的各种炮制品，如“炙甘草”等。

4、如权利要求1所述的甘草总黄酮提取物，其特征在于上述总黄酮类成分含量总和以重量计为5～100％。

5、如权利要求2所述的甘草总皂苷提取物，其特征在于上述总皂苷类成分含量总和以重量计为5～100％。

6、如权利要求1所述的甘草总黄酮提取物，其特征在于各黄酮类成分中甘草苷的含量占总黄酮含量以重量计为5～100％。

7、如权利要求2所述的甘草总皂苷提取物，其特征在于各皂苷类成分中甘草酸的含量占总皂苷含量以重量计为5～100％。

8、如权利要求1～7所述的甘草总黄酮和总皂苷提取物，其特征在于采用溶剂提取法、溶剂萃取法、大孔吸附树脂法、铅盐沉淀法、超临界流体萃取法、柱色谱法、液-液逆流分配色谱法等任意一种方法，或这些方法的任意组合进行制备。

9、如权利要求8所述的甘草总黄酮和总皂苷提取物制备方法，其特征在于，在使用这些方法进行制备时，包括以下一个或几个步骤：

提取：所用溶剂可以是水或任意一种醇类、酮类及酯类溶剂，或这些溶剂按一定比例组成的混合溶剂，或由这些溶剂与酸、碱、盐配成的酸性或碱性溶剂；提取方法可以是煎煮、加热回流、超声提取、冷浸、渗漉、微波提取、高压提取等；

过滤：包括离心、抽滤、超滤、压滤等方法，使用或不使用以下任一种澄清剂或其组合：醇沉剂，明胶，高岭土，各种树脂，聚乙二醇，聚乙三醇，壳聚糖以及天然澄清剂成品如101果汁澄清剂、ZTC+1天然澄清剂等；

浓缩：包括常压或减压条件下的薄膜蒸发、旋转蒸发及煎煮浓缩等；

干燥：包括真空干燥、喷雾干燥、冷冻干燥等。

10、如权利要求9所述的甘草总黄酮和总皂苷提取物制备方法，其特征在于当使用大孔吸附树脂法时，所用的大孔树脂可以是非极性、弱极性、中等极性、弱碱性或弱酸性等任何一种类型，如D101、D4020、HPD400、AB-8、S-8、HZ-806等，其中优选的为弱极性或中等极性的树脂，如AB-8、HPD400、D101等，所用的洗脱剂为水和含水的乙醇、甲醇、丙酮等。

11、如权利要求9所述的甘草总黄酮和总皂苷提取物制备方法，其特征在于当使用柱色谱法时，所用的固定相可以是硅胶、聚酰胺、氧化铝、葡聚糖(Sephadex系列或Sephadex LH-20系列)、C-8、C-18、活性炭、纤维素等，其中优选的为聚酰胺，所用的洗脱剂为水和含水的乙醇。

12、如权利要求9所述的甘草总黄酮和总皂苷提取物制备方法，其特征在于：选用AB-8、HPD400等中等极性或弱极性大孔吸附树脂作为纯化用树脂，上样液浓度为0.02～0.5g/ml(以生药量计)，吸附流速3～9BV/h，树脂柱径高比1∶5～1∶10，上样量为0.2～1.5g/mL(以生药量计)，水洗脱1～4倍树脂体积进行除杂，除杂流速为3～8BV/h，用40～90％乙醇洗脱3～6倍树脂体积，洗脱流速为5～9BV/h。

13、如权利要求9所述的甘草总黄酮和总皂苷提取物制备方法，其特征在于：选用聚酰胺作为纯化用吸附剂，上样液浓度为2～20mg/ml(以树脂富集物量计)，吸附流速3～9BV/h，聚酰胺柱径高比1∶5～1∶10，上样量为10～50mg/mL(以树脂富集物量计)，0～20％乙醇洗脱2～5倍柱体积进行除杂，除杂流速为3～8BV/h，除杂液回收溶剂，蒸干，得甘草总皂苷，用40～90％乙醇洗脱3～7倍柱体积，洗脱流速为5～9BV/h。

14、如权利要求1～7所述的提取物的应用，其特征在于，该提取物可以单独或与其它任何中西药物或食物按任意比例配伍，用于制备药物或功能性食品，所制得的药物或功能性食品可以是胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒剂、口服液、糖浆、冲剂、酒剂、注射剂、膏剂、散剂、饮料等。