CN111001189A - 一种利用混合模式琼脂糖凝胶介质对甘草中有效组分的捕获与分离方法 - Google Patents
一种利用混合模式琼脂糖凝胶介质对甘草中有效组分的捕获与分离方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种利用混合模式琼脂糖凝胶介质对甘草中有效组分的捕获与分离方法,其特征在于利用同时具有离子交换和疏水两种配基的混合模式琼脂糖凝胶介质对甘草中的酸性皂苷类物质和黄酮类物质进行捕获与分离,通过吸附模式,对以上两类物质在琼脂糖凝胶介质中进行有效的吸附,并通过洗脱液pH的改变,实现酸性皂苷类物质和黄酮类物质的有效分离;本发明对于甘草中甘草苷和甘草酸类物质的捕获与分离方法,其结果大致可以达到:对于甘草苷类物质纯度为65%~95%,收率在80%~98%(以甘草苷为标准品计算);对于甘草酸类物质纯度为60%~95%,收率在75%~95%(以甘草酸铵为标准品计算),纯度及收率较高,对于天然产物的组分分离过程与中药提取与纯化过程,具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及化学工程领域,具体来说就是一种利用混合模式琼脂糖凝胶介质 对甘草中有效组分的捕获与分离方法。
背景技术
甘草(学名Glycyrrhiza uralensis Fisch),别名:国老、甜草、乌拉尔甘草、 甜根子。豆科、甘草属多年生草本,根与根状茎粗壮,是一种补益中草药。
作为中药使用时,甘草一般指豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、胀果甘草Glycyrrhiza inflata Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根和根茎。药材性状根呈圆柱形,长25~100厘米,直径0.6~3.5厘米。外皮松紧不一,表 面红棕色或灰棕色。根茎呈圆柱形,表面有芽痕,断面中部有髓。气微,味甜而 特殊。功能主治清热解毒、祛痰止咳、脘腹等。孙思邈《千金方》中记载,“甘 草解百药毒,如汤沃雪。有中乌头、巴豆毒,甘草入腹即定,验如反掌。方称大 豆汁解百药毒,予每试之不效,加入甘草为甘豆汤,其验乃奇也。”近年来的医 学研究表明,甘草及其提取物具有抗肿瘤、抗炎、抗免疫、抗病毒、抗菌、抗心 律失常、抗氧化衰老、抗抑郁以及肾上腺皮质激素样作用,并且是中医治疗糖尿病最常用的中药之一。
现代研究表明,甘草中的主要成分比较复杂,主要有三萜类、黄酮类两大类 成分物质,此外还含有黄酮类、香豆素类、木质素类、多糖和少量生物碱等。甘 草中三萜皂苷类物质的含量较高,根据不同种属、不同产地之间的差异,甘草中 的成分比例略有不同,但一般在5%-11%之间,是甘草中最重要的成分之一。其 中,最主要的成分为甘草酸,造成甘草的甜味的主要成分甘草甜素(glycyrrhizin) 即三萜皂苷甘草酸(glycyrrhizic acid)的钾盐和钙盐,此外,还含有甘草次酸(glycyrrhetic acid),甘草次酸甲酯(glycyrrhetinicacid methyl ester),甘草内酯 (glabrolide),以及系列的甘草皂苷(licorice-saponin)A3、B2、C2等。黄酮类 化合物同样为甘草属植物中数量较多的一类化合物,到目前已从中分离得到了近 300种黄酮类化合物,其结构类型几乎包含了所有的黄酮亚型。其中,甘草苷是甘草中重要的单体活性成分,在乌拉尔甘草、胀果甘草、光果甘草三种主要的甘 草亚种中,甘草苷的含量占黄酮总含量的70%以上。
自古以来,我国就有以水煎煮甘草,并在中药古籍中有大量记载。《伤寒类 要》,“甘草二两。水三升,煮一半,服七合。日一服。”《伤寒论》,“用甘草二 两(蜜水炙),水二升,煮一升半,服五合,日二服。”现代研究表明,水、水/ 乙醇均可有效的将甘草中的有效成分提取出来。同时,近年来,微波法、超声提 取、有机溶剂萃取等方法也见诸报道。同时,甘草昔纯化的方法也有很多,如大 孔树脂、硅胶柱层析、模拟移动床色谱法纯化等。
琼脂糖是线性的多聚物,基本结构是1,3连结的β-D-半乳糖和1,4连结的 3,6-内醚-L-半乳糖交替连接起来的长链,它是一种来源于红藻的多糖,因为有特 殊的凝胶性质。琼脂糖在水中一般加热到90℃以上溶解,温度下降到35-40℃时 形成良好的半固体状的凝胶,这是它具有多种用途的主要特征和基础。琼脂糖凝 胶介质因其具有多孔性、亲水性及电中性等特点,且多糖链上带有多个羟基,可 被修饰上不同的官能团。琼脂糖凝胶介质广泛用于凝胶过滤介质、离子交换介质、 疏水层析介质、亲和层析介质及金属螯合层析介质,用于不同物质的分离和分析。 它对分离介质的优势在于它的生物相容性好、柱载量高可达90%的孔容,可直 接用于填充柱、选择性强、化学稳定性好交联结构可在pH值为1-14范围内保持 稳定、操作简便灵活、微球交联后可耐较高流速和反压、适用于多种蛋白质的分 离纯化。其中,三乙胺基胺衍生化的琼脂糖凝胶介质是一种弱阴离子交换模式的 凝胶填料,与目前一般的氨基衍生化弱阴离子交换模式填料相比,其在分子结构 上胺基的修饰量更大,同时由于氨基之间具有相对固定的位置关系,因此相邻的 氨基可以相互协同,起到与目标纯化物具有更加稳定的结合关系的特点,因此是 纯化分离领域一种重要的离子交换模式填料介质。
琼脂糖凝胶介质一般被认为主要用来做生物大分子的纯化使用,但随着小分 子分离纯化领域对填料生物安全性要求的日益提高。琼脂糖凝胶介质因其在生物 大分子纯化领域的优良表现,也是利用其来对小分子成分进行分离的主要原因。
目前,利用琼脂糖凝胶填料对甘草中有效组分进行捕获与分离,尚属于一个 全新的领域,相关的方法还有待进一步的开发与完善。利用甘草苷与酸性三萜类 物质甘草酸在极性与电荷情况的差异,使其在混合模式的琼脂糖凝胶介质上可进 行有效的吸附于分离,从而实现甘草中主要有效组分中成分的分别捕获于分离。
发明内容
本发明提供一种利用混合模式琼脂糖凝胶介质对甘草中有效组分的捕获与 分离方法,力求进一步的扩大琼脂糖凝胶介质在中药提取与纯化过程中的参与度 与关键性,既有效扩大了琼脂糖凝胶介质的使用范围,有为中药健康产业的安全 性与规范化建设提供了有力的技术支持。
本发明中所涉及的一种利用混合模式琼脂糖凝胶介质对甘草中有效组分的 捕获与分离方法,将包含以下一些步骤,分别为介质的选择、甘草提取物溶液的 配制、样品在介质上的吸附捕获、酸性洗脱条件下洗脱、碱性洗脱条件下的洗脱、 洗脱液的后处理及分析。
其中样品在介质上的吸附捕获、酸性洗脱条件下洗脱、碱性洗脱条件下的洗 脱这三个步骤,根据操作环境与操作条件的不同,分别可以分为常压静态操作过 程和中低压操作过程。
具体的操作步骤如下:
(1)介质的选择:选择混合模式的琼脂糖凝胶介质;这里所谓的混合模式, 是指离子交换与疏水作用同时存在的工作模式,相较于单纯的离子交换模式与单 纯的疏水模式,混合模式中待分离物质与介质之间的相互作用更加复杂,同时, 也有更多的吸附捕获位点供与待分离相互作用,因此混合模式的琼脂糖凝胶介质 虽然很多,但是具体形式与结构的选择是成功进行甘草中有效组分的捕获与分离 的重要步骤之一;本发明中所采用的混合模式琼脂糖凝胶介质是指琼脂糖凝胶介 质上分别载有具有离子交换和疏水性质的配基,离子交换性质的配基为伯胺基、 仲胺基、叔胺基等,疏水性质的配基为碳数为1~8的烷基配基以及离子交换配基 与琼脂糖链连接的碳数为1~4的基团;一般的,我们选择的是瑞典Bio-works公 司生产的TREN型混合模式琼脂糖凝胶介质或GE公司生产的Capto core 700型 混合模式琼脂糖凝胶介质作为选用的琼脂糖凝胶介质;
(2)甘草提取物溶液的配制:甘草提取物中甘草苷类物质可以与甘草酸类 物质以任意比例存在;对于溶液配制的过程,将待捕获与分离样品分散溶解在水、 甲醇、乙醇、水与甲醇任意比例混合的混合溶液、水与乙醇任意比例混合的混合 溶液中,配制溶液的浓度为0.01mg/mL至100mg/mL。
(3)样品在介质上的吸附捕获:根据操作环境与操作条件的不同,分别可 以分为常压静态操作过程和中低压操作过程;
常压静态操作过程是将待捕获与分离样品溶液滴加在SPE柱中介质的上表 面;之后用水淋洗介质,将SPE柱中介质上未紧密吸附的物质淋洗下来;
中低压操作过程是在蛋白纯化系统上完成的;一般选用GE公司的AKTA explorer、AKTA purifier、AKTA avant进行实施;将介质装填到色谱柱中或使用 预装柱;可以通过上样环上样或上样液直接通过纯化系统管路上样;其流速由软 件通过纯化系统内部的泵进行控制,流速为0.5mL/min~15mL/min;之后用水作 为流动相淋洗介质,将柱管中介质上未紧密吸附的物质淋洗下来,流速为 0.5mL/min~15mL/min。
(4)酸性洗脱条件下洗脱:根据操作环境与操作条件的不同,分别可以分 为常压静态操作过程和中低压操作过程;
常压静态操作过程:酸性洗脱条件下可以将甘草中甘草苷类物质从介质上洗 脱下来;甘草苷类物质可在pH为3~6,洗脱液中无机物的总离子浓度在 50mM~500mM的条件下被洗脱;其中,无机物为磷酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二 钠、氯化钠、盐酸、硫酸氢钠、碳酸氢钠中的一种或几种混合物;将洗脱液由 SPE柱顶端介质上方加入,在SPE柱下端接口收集洗脱液,称为洗脱液A,待 后处理与分析;洗脱流速为0.5mL/min~15mL/min。
中低压操作过程与常压静态操作过程相同。
(5)碱性洗脱条件下洗脱:根据操作环境与操作条件的不同,分别可以分 为常压静态操作过程和中低压操作过程;
常压静态操作过程:碱性洗脱条件下可以将甘草中甘草酸类物质从介质上洗 脱下来。甘草酸类物质可在pH为8~12,洗脱液中无机物的总离子浓度在 50mM~500mM的条件下被洗脱,无机物为磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸三钠、 氯化钠、氢氧化钠、碳酸钠中的一种或几种混合物。将洗脱液由SPE柱顶端介 质上方加入,在SPE柱下端接口收集洗脱液,称为洗脱液B,待后处理与分析; 洗脱流速为0.5mL/min~15mL/min。
中低压操作过程与常压静态操作过程相同。
(6)洗脱液的后处理及分析:将上述步骤中的酸性洗脱条件下的洗脱液A 与碱性洗脱条件下的洗脱液B分别合并、收集;经过浓缩、脱盐、冻干或浓缩、 脱盐、喷干处理,即可分别得到甘草苷与甘草酸类的组分物质的干粉样品,对样 品进行HPLC分析;其中浓缩利用旋转蒸发仪实现,脱盐经过脱盐柱的处理,冻 干或喷干经过相应的冻干机或喷干机实现;之后将得到的甘草苷与甘草酸类的组 分物质干粉配置成水溶液,进行HPLC分析,与甘草提取物溶液进行色谱峰面积 的比对,得到纯度与收率的相关数据;具体HPLC分析条件如下:
仪器:Waters 2695(2998PDA Detector)
色谱柱:Tnature C18、4.6*250mm,5μm
检测波长:234nm
流速:1mL/min
柱温:30℃
进样体积:10μL
梯度条件:
对于发明中得到的甘草苷与甘草酸类的组分物质,其组成与含量的分析,皆 可以通过HPLC分析来完成,并可通过计算得到纯度与收率的数据。经HPLC 分析与计算,甘草苷类组分物质的纯度可以达到65%~95%,收率在80%~98%(以 甘草苷为标准品计算);甘草苷类组分物质的纯度可以达到60%~95%,收率在 75%~95%。
本发明的有益效果在于:
1)相比于传统的富集纯化甘草中有效成分组分的方法,本发明所涉及的方 法仅仅利用洗脱液pH的改变便可在一种分离介质上实现甘草苷类组分与甘草酸 类组分的捕获与分离;这一方法操作条件较为宽松,有很大的灵活性,并极大的 减少了操作流程,简化了操作手续;
2)本发明对于甘草中甘草苷和甘草酸类物质的捕获与分离方法,其结果大 致可以达到:对于甘草苷类物质纯度为65%~95%,收率在80%~98%(以甘草苷 为标准品计算);对于甘草酸类物质纯度为60%~95%,收率在75%~95%(以甘 草酸铵为标准品计算),纯度及收率较高。
附图说明
图1:甘草苷的标准HPLC谱图;
图2:甘草酸铵的标准HPLC谱图;
图3:AKTA pure纯化系统下的洗脱曲线;
图4:酸性洗脱与碱性洗脱过程下洗脱液的HPLC分析结果及其与甘草提取 物原液的对比;
图5:经冻干处理的甘草苷(左边)和甘草酸(右边)粉末的图片。
具体实施方式
下面结合实施例,对本发明作更为详细的描述:
实施例1:
样品为甘草水提物,经澄清过滤处理后喷干成粉末。使用时将提取物粉末配 置为25mg/mL的水溶液,过0.45μm膜后待用。用Bio-works公司的TREN混合 模式琼脂糖凝胶介质45mL装柱,进行捕获与分离。具体操作过程如下:
上样液:25mg/mL甘草提取物溶液
上样量:400mL
装填柱:TREN(45mL)
洗脱液:A:磷酸盐缓冲液溶液(pH=5),B:磷酸盐缓冲液(pH=10)
流速:10mL/min
实验步骤:
平衡预装柱,平衡完成后进样,进样后用纯化水淋洗,淋洗后洗脱液A洗 脱,洗脱后用水淋洗,洗脱液B洗脱,无峰后碱洗脱,至无峰结束。280nm检 测出峰时流出液保留。
实施例2:
样品为甘草、黄连两物质60%乙醇水溶液提取物,经澄清过滤处理后喷干成 粉末。使用时将提取物粉末配置为30mg/mL的水溶液,过0.45μm膜后待用。用 GE公司的Captocore 700混合模式琼脂糖凝胶介质5mL装柱,进行捕获与分离。
具体操作过程如下:
上样液:30mg/mL甘草、黄连提取物溶液溶液
上样量:50mL
装填柱:Capto core 700 5mL预装柱
洗脱液:A:磷酸盐缓冲液溶液(pH=5),B:磷酸盐缓冲液(pH=10)
流速:5mL/min
实验步骤:
平衡预装柱,平衡完成后进样,进样后用纯化水淋洗,淋洗后洗脱液A洗 脱,洗脱后用水淋洗,洗脱液B洗脱,无峰后碱洗脱,至无峰结束。280nm检 测出峰时流出液保留。
实施例3:
样品为甘草苷类粗提物,其中甘草苷类含量为40%,经澄清过滤处理后喷干 成粉末。使用时将提取物粉末配置为25mg/mL的乙醇溶液,过0.45μm膜后待用。 取用Bio-works公司的TREN混合模式琼脂糖凝胶介质5mL,进行捕获与分离。 将TREN介质置于甘草苷类粗提物乙醇溶液中,充分混合后在摇床上放置8小 时,静置,将琼脂糖凝胶介质过滤,并装填如SPE 5mL空柱管中。
洗脱液:A:磷酸盐缓冲液溶液(pH=5),B:磷酸盐缓冲液(pH=10)
实验步骤:
平衡填料,平衡完成后用纯化水淋洗,淋洗后洗脱液A洗脱,洗脱3个柱 体积后后用水淋洗,洗脱液B洗脱,洗脱3个柱体积后用碱洗脱并再生。
实施例4:
样品为甘草酸类粗提物,其中甘草酸类含量为20%,经澄清过滤处理后喷干 成粉末。使用时将提取物粉末配置为25mg/mL的水溶液,过0.45μm膜后待用。 用Bio-works公司的TREN混合模式琼脂糖凝胶介质45mL装柱,进行捕获与分 离。具体操作过程如下:
上样液:25mg/mL甘草提取物溶液
上样量:400mL
装填柱:TREN(45mL)
洗脱液:A:磷酸盐缓冲液溶液(pH=5),B:磷酸盐缓冲液(pH=10)
流速:10mL/min
实验步骤:
平衡预装柱,平衡完成后进样,进样后用纯化水淋洗,淋洗后洗脱液A洗 脱,洗脱后用水淋洗,洗脱液B洗脱,无峰后碱洗脱,至无峰结束。280nm检 测出峰时流出液保留。
实施例5:
甘草的HPLC分析
甘草的HPLC分析方法:
仪器:Waters 2695(2998PDA Detector)
色谱柱:Tnature C18(4.6*250mm,5μm part No:T01190510525serial No:30613614414030)
检测波长:234nm
流速:1mL/min
柱温:30℃
进样体积:10μL
梯度条件:
利用实施例5中所提供的方法,经HPLC分析与计算实施例1至4的相关甘 草苷类与甘草酸类组分物质的纯度与收率如下表所示:
通过四个实施例,可以看出,对于甘草中甘草苷和甘草酸类物质的捕获与分 离方法,其结果大致可以达到:对于甘草苷类物质纯度为65%~95%,收率在 80%~98%(以甘草苷为标准品计算);对于甘草酸类物质纯度为60%~95%,收 率在75%~95%(以甘草酸铵为标准品计算)。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管参照前 述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以 对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同 替换。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均 应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种利用混合模式琼脂糖凝胶介质对甘草中有效组分的捕获与分离方法,将包含以下一些步骤:介质的选择、甘草提取物溶液的配制、样品在介质上的吸附捕获、酸性洗脱条件下洗脱、碱性洗脱条件下洗脱、洗脱液的后处理及分析;
其特征在于,
所述样品在介质上的吸附捕获、酸性洗脱条件下洗脱、碱性洗脱条件下的洗脱这三个步骤,根据操作环境与操作条件的不同,分别可以分为常压静态操作过程和中低压操作过程;
具体的操作步骤如下:
(1)介质的选择:选择混合模式的琼脂糖凝胶介质;所述混合模式,是指离子交换与疏水作用同时存在的工作模式;本发明中所采用的混合模式琼脂糖凝胶介质是指琼脂糖凝胶介质上分别载有具有离子交换和疏水性质的配基;所述琼脂糖凝胶介质包括瑞典Bio-works公司生产的TREN型混合模式琼脂糖凝胶介质或GE公司生产的Capto core 700型混合模式琼脂糖凝胶介质;
(2)甘草提取物溶液的配制:将甘草提取物溶液分散溶解在任意比例的水、甲醇、乙醇混合溶液中,配制溶液的浓度为0.01mg/mL-100mg/mL;
(3)样品在介质上的吸附捕获:根据操作环境与操作条件的不同,分别可以分为常压静态操作过程和中低压操作过程;
常压静态操作过程是将待捕获与分离样品溶液滴加在SPE柱中介质的上表面;之后用水淋洗介质,将SPE柱中介质上未紧密吸附的物质淋洗下来;
中低压操作过程是在蛋白纯化系统上完成的;选用GE公司的AKTA explorer、AKTApurifier、AKTA avant,将介质装填到色谱柱中或使用预装柱;通过上样环上样或上样液直接通过纯化系统管路上样;其流速由软件通过纯化系统内部的泵进行控制,流速为0.5mL/min~15mL/min;之后用水作为流动相淋洗介质,将柱管中介质上未紧密吸附的物质淋洗下来,流速为0.5mL/min~15mL/min;
(4)酸性洗脱条件下洗脱:根据操作环境与操作条件的不同,分别可以分为常压静态操作过程和中低压操作过程;
常压静态操作过程:酸性洗脱条件下可以将甘草中甘草苷类物质从介质上洗脱下来;甘草苷类物质可在pH为3~6,洗脱液中无机物的总离子浓度在50mM~500mM的条件下被洗脱;将洗脱液由SPE柱顶端介质上方加入,在SPE柱下端接口收集洗脱液,称为洗脱液A,待后处理与分析;洗脱流速为0.5mL/min~15mL/min;中低压操作过程与常压静态操作过程相同;
(5)碱性洗脱条件下洗脱:根据操作环境与操作条件的不同,分别可以分为常压静态操作过程和中低压操作过程;
常压静态操作过程:碱性洗脱条件下可以将甘草中甘草酸类物质从介质上洗脱下来,甘草酸类物质可在pH为8~12,洗脱液中无机物的总离子浓度在50mM~500mM的条件下被洗脱,将洗脱液由SPE柱顶端介质上方加入,在SPE柱下端接口收集洗脱液,称为洗脱液B,待后处理与分析;洗脱流速为0.5mL/min~15mL/min;中低压操作过程与常压静态操作过程相同;
(6)洗脱液的后处理及分析:将上述步骤中的酸性洗脱条件下的洗脱液A与碱性洗脱条件下的洗脱液B分别合并、收集;经过浓缩、脱盐、冻干或浓缩、脱盐、喷干处理,即可分别得到甘草苷与甘草酸类的组分物质的干粉样品,对样品进行HPLC分析;将得到的甘草苷与甘草酸类的组分物质干粉配置成水溶液,进行HPLC分析,与甘草提取物溶液进行色谱峰面积的比对,得到纯度与收率的相关数据。
2.根据权利要求1所述一种利用混合模式琼脂糖凝胶介质对甘草中有效组分的捕获与分离方法,其特征在于,步骤(1)所述离子交换性质的配基为伯胺基、仲胺基、叔胺基;疏水性质的配基为碳数为1~8的烷基配基以及离子交换配基与琼脂糖链连接的碳数为1~4的基团。
3.根据权利要求1所述一种利用混合模式琼脂糖凝胶介质对甘草中有效组分的捕获与分离方法,其特征在于,步骤(4)所述无机物为磷酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、盐酸、硫酸氢钠、碳酸氢钠中的一种或几种混合物。
4.根据权利要求1所述一种利用混合模式琼脂糖凝胶介质对甘草中有效组分的捕获与分离方法,其特征在于,步骤(5)所述无机物为磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸三钠、氯化钠、氢氧化钠、碳酸钠中的一种或几种混合物。
5.根据权利要求1所述一种利用混合模式琼脂糖凝胶介质对甘草中有效组分的捕获与分离方法,其特征在于,步骤(5)所述浓缩利用旋转蒸发仪实现,脱盐经过脱盐柱的处理,冻干或喷干经过冻干机或喷干机实现。
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- 2018-12-25 CN CN201811596234.1A patent/CN111001189B/zh active Active
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