一种齐墩果酸衍生物及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种齐墩果酸衍生物及其组合物,尤其是从黄花败酱中提取获得。本发明同时涉及该齐墩果酸衍生物及其组合物的制备方法。
背景技术
齐墩果酸是天然五环三萜类化合物,广泛分布于中药植物如女贞子、连翘和人参等中。齐墩果酸具有消炎、抗肿瘤和抗高血脂等多方面的药理作用,在中国已作为常用保肝药物,用于治疗急性化学性肝损伤、慢性肝硬化和肝纤维化。但由于其难溶于水,细胞透过率低及严重的肝脏首过效应,从而导致极低的口服生物利用度,使其口服疗效受到影响。从天然植物中寻找能提高其疗效的齐墩果酸衍生物,是目前该类药物的方向之一。
败酱科败酱属植物为多年生直立草本,地下根茎有强烈腐臭,故名“败酱”。全属约20种,主产于亚洲东部至中部和北美洲西北部。我国败酱属植物有10种,3个亚种和2个变种,全国各地均产,资源丰富。该属植物作为传统中药材的主要有败酱草和墓头回。败酱草正品为黄花败酱和白花败酱的干燥全草;墓头回药材为异叶败酱或糙叶败酱的根茎或全草。败酱始载《神农本草经》,历代本草均有记载。苦、辛、微寒。具有清热解毒,利湿排脓,活血化瘀,镇心安神等功能。败酱科植物中含有多种化学成分,主要含三萜皂苷类,包括齐墩果酸、常春藤、乌苏酸型皂苷,此外还发现环烯醚萜苷类、香豆素和黄酮类化合物,以及挥发油和有机酸等。其中萜类、黄酮、β-谷甾醇和异戊酸为各属所共有。败酱属植物具有广泛的药理及生物活性,主要表现为镇静、抑菌、抗病毒、保肝利胆、抗肿瘤等多方面,常用于治疗肝炎、肠炎、痢疾、产后瘀血腹痛、痈肿疔疮、神经衰弱等症。参见李廷芳、楼凤昌等著“败酱属植物的研究概况”一文(天然产物研究与开发,2001,13(3):71-75)等。
败酱属植物资源十分丰富,近年来败酱属植物的药效得到人们重视,如李洪源报道败酱草中含有抗呼吸道合胞病毒物质(中国专利申请号03100182.3),金英姬和韩荣福报道黄柏皮和败酱复方药物组合物可用于治疗丙型肝炎(中国专利申请号98801129.8),刘剑和胡松谋报道黄花败酱挥发油和渗漉提取液治疗中枢神经镇静效果显著(中国专利申请号201110024222.3)。但由于败酱化学成分的现有研究基础薄弱,现有技术仅限于制备工艺和药理活性的研究,对提取物中的成份组成并不确定,因而实际生产中难以获得组成稳定、工艺可控性好的产品。
黄花败酱等在民间用于治疗肝炎等疾病,为了寻找其中的抗肝炎及保肝利胆活性成分,以便更好的开发和利用这一药用植物资源,发明人对黄花败酱进行了系统的化学成分研究,分离鉴定了其中的32种主要成份。并对其中部分提取物和单体化合物进行了抗炎和抗肿瘤活性研究,从而完成了本发明。
发明内容
本发明提供一种如式(I)所示齐墩果酸衍生物及其组合物,
式中,R1为H或木糖、鼠李糖、阿拉伯糖和葡萄糖基中的1-4个,R2为H或鼠李糖和葡萄糖基中的1-3个。
具体地,该衍生物为,3-O-β-D-吡喃木糖(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃木糖齐墩果酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖酯苷(P25)、3-O-β-D-吡喃葡萄糖(1→4)-β-D-吡喃木糖(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃木糖齐墩果酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖酯苷(P26)、3-O-β-D-吡喃葡萄糖(1→4)-β-D-吡喃木糖(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖齐墩果酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖酯苷(P27)、3-O-β-D-吡喃木糖(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃木糖齐墩果酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖酯苷(P1)、3-O-β-D-吡喃葡萄糖(1→4)-β-D-吡喃木糖(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃木糖齐墩果酸28-β-D-吡喃葡萄糖酯苷(P2)中的任意一种以上。
此外,该衍生物及其组合物还包括,齐墩果酸(P8)、齐墩果酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖酯苷(P19)、3-O-β-D-吡喃木糖齐墩果酸28-β-D-吡喃葡萄糖酯苷(P20)、3-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃木糖齐墩果酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖酯苷(P21)、齐墩果酸3-O-β-D-吡喃木糖苷(P22)、齐墩果酸3-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃木糖苷(P23)、3-O-β-D-吡喃木糖(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖齐墩果酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖酯苷(P24)、3-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖常春藤皂苷元28-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖酯苷(P28)、3-O-β-D-吡喃木糖(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖常春藤皂苷元28-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖酯苷(P29)中的任意一种以上。
另一方面,该衍生物及其组合物还可包括式(II)所示成份,
式(II)中,R1为H或木糖、鼠李糖和葡萄糖基中的1-2个,R2和R3为H、OH或-O-取代基,R4为H或OH。具体成份为,3β,12α-二羟基-齐墩果烷-13,28-内酯(P18)、3-O-β-D-吡喃木糖-11α,12α-环氧齐墩果烷-13,28-内酯(P3)、3-O-β-D-吡喃木糖(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃木糖-11α,12α-环氧齐墩果烷-13,28-内酯(P4)、3-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃木糖-12β,30-二羟基-齐墩果烷-13,28-内酯(P5)、3-O-β-D-吡喃木糖(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃木糖-12β,30-二羟基-齐墩果烷-13,28-内酯(P6)、3-O-β-D-吡喃木糖(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖-13,28-二羟基-齐墩果烷-28,13β-内酯(P7)中的任意一种以上。
本发明所述齐墩果酸衍生物及其组合物的制备方法由以下步骤组成:
(1)选取败酱属植物,采用水、醇或含水-醇混合溶媒进行提取,浓缩,过滤,浓缩液加适量水稀释,过滤,得败酱水溶液;
(2)由(1)所得黄花败酱水溶液,采用预处理好的大孔树脂进行吸附,先用水洗,再用30-95%乙醇洗脱,收集30-95%洗脱液,浓缩,干燥,得败酱提取物。
(3)由(2)所得黄花败酱提取物,采用常规硅胶、反相硅胶等柱层析填料和制备技术,获得所述齐墩果酸衍生物。
其中,所述制备方法步骤(1)中所述败酱属植物优选为黄花败酱,所述醇为甲醇或乙醇,所述含水-醇混合溶媒优选50-80%乙醇。
所述制备方法步骤(2)中所述大孔树脂优选弱极性大孔树脂,所述洗脱溶剂优选30-75%乙醇。
所述制备方法步骤(3)中所述制备技术为本领域专业人员所公知,可参考具体实施例获得。
本发明通过采用大孔树脂、常压硅胶柱色谱、减压柱色谱、中压柱色谱、凝胶柱色谱、半制备高效液相色谱等现代分离技术,从黄花败酱药材中分离鉴定了32个化合物,包括26个三萜类化合物,其中有7个新皂苷P1-P7,包括具有30-羟基取代的齐墩果烷-28,13β-内酯新型苷元类皂苷3个,具有11α,12α-环氧结构的齐墩果烷-28,13β-内酯类皂苷2个,具有新型糖链取代的3-O-β-D-吡喃木糖(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃木糖齐墩果酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖酯苷等皂苷2个;10个化合物为首次从该属植物中分离得到,包括P12、P15、P16、P17、P18、P20、P21、P25、P26、P27;9个已知皂苷类化合物,包括P8(齐墩果酸)、P13、P14、P19、P22、P23、P24、P28、P29。此外,还分离得到及其它类已知成份6个。详见实施例3。
本发明同时对所述齐墩果酸衍生物及其组合物进行了抗肿瘤、抗炎活性筛选。研究结果:(1)二甲苯致小鼠急性耳肿胀试验结果表明,黄花败酱提取物灌药给药(100,200mg/kg)具有较强的抗炎作用;(2)体外抗肿瘤试验结果表明,化合物P4对人肝癌HepG-2细胞株具有一定的抗肿瘤作用(IC50为28.5μmol/L)。结果表明,所述齐墩果酸衍生物组合物均具有较好的抗炎活性,可以根据使用需要应用于不同的功能食品和药品中。
本发明内容是通过大量创造性实验研究完成的,以下述具体实施例进行说明。
具体实施方式
本发明所述的黄酮碳苷组合物是按如下实施例所表示的方法制造,所涉及到的方法是本领域的技术人员能够掌握和运用的技术手段。但以下实施例不得理解为任何意义上的对本发明权利要求的限制。
实施例1:黄花败酱的提取
干燥的黄花败酱全草5kg,经8倍量75%乙醇回流提取3次,每次8小时,合并提取液,200目筛滤过,所得滤液经减压浓缩回收甲醇,得流浸膏5kg。
实施例2:黄花败酱的大孔树脂精制
取实施例1中流浸膏1.0kg,用水稀释为2.0L,过滤,滤液加到预处理好的AB-8树脂柱上,分别用水,10%乙醇,50%,95%乙醇各3BV进行梯度洗脱,由50%乙醇洗脱部位得黄花败酱提取物(PT)62.3g,由95%乙醇洗脱部位得黄花败酱提取物12.1g。
实施例3:黄花败酱中单体化合物的分离
取实施例1流浸膏2.5kg,分散于蒸馏水中,用等体积的乙酸乙酯萃取6次,合并乙酸乙酯萃取液,减压浓缩,得乙酸乙酯部位(PE)浸膏81g;乙酸乙酯萃取后的水溶液浓缩到约5L,上样于HPD-450大孔树脂柱,用蒸馏水洗脱,再以80%乙醇洗脱,收集80%乙醇洗脱液,减压浓缩,得水部位(PM)浸膏44g。
乙酸乙酯部位浸膏经减压硅胶柱(硅胶H),以氯仿-甲醇系统溶剂梯度(100∶0~70∶30)洗脱,收集各馏分并以薄层板检测跟踪合并相似组分;经减压浓缩回收溶剂,制得11部分(PE1~11)。经反复硅胶柱(200-300目)层析、反相硅胶柱层析和半制备色谱分离,由PE1得到化合物P-37,P-30,P-32,P34,P33,P11,P16,P9;由PE 2得到化合物P12,P10,P17,P18;由PE3得到化合物P15,P36;由PE4得到化合物P13,P14,P35;由PE6得到新化合物P3;由PE7得到化合物P22;由PE8得到化合物P31;由PE9得到化合物P20,P23;由PE10得到化合物P19,新化合物P4,P21;由PE11得到新化合物P1。
水部位浸膏44g,经减压硅胶H柱,以氯仿-甲醇系统溶剂梯度(85∶15~0∶100)洗脱,收集各馏分,减压浓缩,合并为7个部分(PM1~7)。PM1经反相硅胶柱层析,MeOH-H2O(60∶40→100∶0)梯度洗脱,凝胶柱层析纯化,得新化合物P5,P29;同法,由PM2得化合物P6,P7;由PM3得化合物P24;PM4经反相硅胶柱层析,MeOH-H2O(80∶20→70∶30)梯度洗脱,pHPLC制备分离纯化,得化合物P2,P28;PM5经pHPLC制备分离纯化,得化合物P25;由PM6得化合物P27;由PM7经Sephadex LH-20柱层析纯化得到化合物P26。
结构鉴定:采用1D和2D-NMR、HRESIMS等波谱学技术,以及GC和化学分析方法,鉴定了新化合物P1-7的结构;通过NMR分析,和已知物数据对照,鉴定了已知化合物P8-P32的结构,其中P10、P12、P15、P16、P17、P18、P20、P21、P25、P26、P27等11个化合物为首次从该属植物中得到。鉴定化合物依次为:3-O-β-D-吡喃木糖(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃木糖齐墩果酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖酯苷(P1)、3-O-β-D-吡喃葡萄糖(1→4)-β-D-吡喃木糖(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃木糖齐墩果酸28-β-D-吡喃葡萄糖酯苷(P2)、3-O-β-D-吡喃木糖-11α,12α-环氧齐墩果烷-28,13β-内酯(P3)、3-O-β-D-吡喃木糖(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃木糖-11α,12α-环氧齐墩果烷-28,13β-内酯(P4)、3-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃木糖-12β,30-二羟基-齐墩果烷-28,13β-内酯(P5)、3-O-β-D-吡喃木糖(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃木糖-12β,30-二羟基-齐墩果烷-28,13β-内酯(P6)、3-O-β-D-吡喃木糖(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖-12β,30-二羟基-齐墩果烷-28,13β-内酯(P7)、齐墩果酸(P8)、东莨菪素(P9)、愈创木-6(7)-烯-4,10-二醇(P10)、麦角甾-6(7),22(23)-二烯-3β,5α,8α-三醇(P11)、3α-乌苏酸(P12)、2α-羟基乌苏酸(P13)、2α-羟基齐墩果酸(P14)、11-羰基-齐墩果酸(P15)、3,11-二羰基-齐墩果烷-12-烯-28-酸(P16)、29-羟基-3-羰基-齐墩果烷-12-烯-28-酸(P17)、3β,12α-二羟基-齐墩果烷-28,13β-内酯(P18)、齐墩果酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖酯苷(P19)、3-O-β-D-吡喃木糖齐墩果酸28-β-D-吡喃葡萄糖酯苷(P20)、3-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃木糖齐墩果酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖酯苷(P21)、齐墩果酸3-O-β-D-吡喃木糖苷(P22)、齐墩果酸3-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃木糖苷(P23)、3-O-β-D-吡喃木糖(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖齐墩果酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖酯苷(P24)、3-O-β-D-吡喃木糖(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃木糖齐墩果酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖酯苷(P25)、3-O-β-D-吡喃葡萄糖(1→4)-β-D-吡喃木糖(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃木糖齐墩果酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖酯苷(P26)、3-O-β-D-吡喃葡萄糖(1→4)-β-D-吡喃木糖(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖齐墩果酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖酯苷(P27)、3-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖常春藤皂苷元28-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖酯苷(P28)、3-O-β-D-吡喃木糖(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖常春藤皂苷元28-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖酯苷(P29)、β-谷甾醇(P30)、β-胡萝卜苷(P31)、豆甾醇(P32)。
新化合物P1-P7的HR-ESIMS谱图数据:P1给出m/z 1051.5448[M+Na]+(C52H84O20Na);P2给出m/z 1213.5976[M+Na]+(C58H94O25Na);P3给出m/z 625.3716[M+Na]+(C35H54O8Na);P4给出m/z 903.4593[M+Na]+(C46H72O16Na);P5给出m/z789.4399[M+Na]+(C41H66O13Na);P6给出m/z 921.4819[M+Na]+(C46H74O17Na);P7给出m/z 805.4342[M+Na]+(C41H66O14Na)。P1-P7的主要NMR归属数据见表1-3。
表1新化合物P1-P7苷元部分的13C NMR数据归属(125MHz,Pyridine-d5)
实施例1:黄花败酱提取物的抗炎作用考察
取实施例2和3黄花败酱提取物试药,取20-25g小鼠50只,随机分为PT组(200mg/kg)、PE组(100mg/kg)、PW组(100mg/kg)、齐墩果酸对照组(100mg/kg)和模型组五组,预灌药给药一周。最后一次灌药2小时后,用二甲苯25微升均匀涂于小鼠右耳,半小时后处死小鼠,用直径6mm打孔器,取小鼠的左右耳相同部位,用分析天平称重。取下的右耳减去左耳重量为肿胀度,计算对照组和给药组的均值与标准差,t检验比较组间差异显著性。按下式求出肿胀抑制率:
肿胀抑制率(%)=[1-给药组平均肿胀度/模型组平均肿胀度]×100%
结果:PT组(200mg/kg)、PE组(100mg/kg)、PW组(100mg/kg)、齐墩果酸对照组(100mg/kg)对二甲苯所致小鼠耳廓急性炎症均有较强的抑制作用,肿胀抑制率(%)依次为64.3、75.4、55.6、68.7;各组间比较无明显差异。
实验例2:齐墩果酸皂苷化合物的体外抗肿瘤作用考察
测试化合物P4,P6,P16,P17,P26,P38,均配制为80、40、20、10、5μmol/L。取对数生长期人肝癌HepG-2细胞株细胞,用胰酶消化后配制成浓度为1×106个/mL的细胞悬液,接种于96孔酶标板中,每孔100μl。24h后加含不同药物及相应溶媒对照的新鲜培养液,对照组以等体积溶媒替代样品的培养液,空白组加等体积的不含细胞的培养液,每孔50μl,每组设5个平行孔。在上述条件下培养48h,其后每孔加入5mg/mLMTT 10μl,继续培养4h后,每孔加50μl DMSO溶解,用微型振荡器振荡混匀后,于酶标仪上测定OD值,实验重复3次,取平均值,计算抑制率。
抑制率(%)=[(1-样品组OD值/对照组OD值)]×100%
结果:采用MTT法,对6个三萜类化合物进行了抗肝癌肿瘤细胞活性筛选,结果显示化合物P-4对肝癌细胞(HepG-2)有一定的抑制作用,其IC50为28.5μmol/L。其余化合物在测试剂量范围没有明显的抗肿瘤活性。