CN104170821B

CN104170821B - Hederagenin-3-O-arabinopyranoside抗植物病原菌的应用

Info

Publication number: CN104170821B
Application number: CN201410224698.5A
Authority: CN
Inventors: 林丽萍; 李英
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2014-05-22
Filing date: 2014-05-22
Publication date: 2016-05-18
Anticipated expiration: 2034-05-22
Also published as: CN104170821A

Abstract

本发明涉及到Hederagenin-3-O-arabinopyranoside(常春藤皂苷元-3-O-阿拉伯糖)的应用。本发明采用化学提取分离手段得到Hederagenin-3-O-arabinopyranoside，再结合其理化性质和MS、NMR等现代光谱技术鉴定化合物的结构，对该化合物进行了抗植物病原菌活性试验，结果表明Hederagenin-3-O-arabinopyranoside对立枯丝核菌Rhizoctonia？solani？Kühn和串珠镰孢菌Fusarium？moniliforme？Sheld有较好的抑制作用，可以作为制备生物农药的抑菌剂成分进一步研究。

Description

Hederagenin-3-O-arabinopyranoside抗植物病原菌的应用

技术领域

本发明涉及到Hederagenin-3-O-arabinopyranoside(常春藤皂苷元-3-O-阿拉伯糖)在抗植物病原菌方面的应用，属于农业领域。

背景技术

植物病原菌是导致植物病害的主要原因之一，每年农作物因遭受病害造成的减产为总产量的12％左右。目前防治植物病害的主要手段为化学农药。化学农药因其品种多、见效快、使用方便、价格低廉等特点在农药市场中占据主导地位，但存在着在使用中产生了环境污染、人畜中毒、农药残留等问题。当前，开发生物活性高、对非靶标生物安全、环境相容性好的生物农药已成为发展的新趋势。部分研究表明植物提取物对植物病原菌有较好的抑制作用，植物源杀菌剂具有低残留、低毒、与环境和谐、对非靶标生物相对安全等优点，所以从植物中寻找具有杀菌、抑菌活性物质，是新型天然植物源杀菌剂研制的一条非常重要的途径。

植物病原菌的种类很多，其中立枯丝核菌(RhizoctoniasolaniKühn)是一种重要的植物病原真菌，寄主范围广，可为害43科263种植物(彭绍裘等，1986)。该菌除了为害水稻引起纹枯病外，还能侵害其它禾谷类作物以及蔬菜、花卉等经济作物，引起诸如立枯、猝倒、叶枯、鞘枯等多种症状，对作物的为害极大。此外，串珠镰孢菌FusariummoniliformeSheld.是镰孢菌属FusariumLink中最重要的植物病原菌之一，可侵染多种作物引起严重病害，特别是在禾谷类作物上，如玉米穗腐病、小麦赤霉病、水稻恶苗病、高粱穗腐病等(White1999；Parryetal.1995；Nyvalletal.1999；Frederiksen&Odvody2000；Leslieetal.2005)。在谷物储藏期间，它还可以引起谷物霉变，产生多种真菌毒素污染谷物，如镰孢菌酸(fusaricacid)、镰孢菌素(fusarins)、赤霉素(gibberellins)、串珠菌素(monilifomin)及伏马菌素(fumonisins)，进而危害人和动物引起中毒症状(Nelson1992；Nelsonetal.1994；Summerelletal.2001)。同时，这类镰孢菌也和其他镰孢菌一样可以引起人体多种疾病，侵染人的眼、鼻、耳、皮肤、肝、肺、骨髓等，危害免疫力缺乏人群的身体健康，特别是白血病、HIV患者，甚至导致死亡(Nelsonetal.1994)。因而，研究这两种植物病原菌的杀菌剂无论是在病理上还是在经济上都具有极其重要的意义。

Hederagenin-3-O-arabinopyranoside是一种皂苷类化合物，据文献报道存在于罂粟莲花(Anemoclemaglaucifolium)、红毛七(CaulophyllumrobustumMaxim)、白头翁(Pulsatillachinensis)等植物中。本发明首次从冬青科植物中分离得到Hederagenin-3-O-arabinopyranoside，并首次进行了抗植物病原菌药理试验。结果显示Hederagenin-3-O-arabinopyranoside对立枯丝核菌RhizoctoniasolaniKühn和串珠镰孢菌FusariummoniliformeSheld有较好的抑制作用。

毛冬青为冬青科(Aquffoliaceae)冬青属植物毛冬青IlexpubescensHook.etAm.的干燥根，是我国南方常用中药，在《广西中草药》、《浙江民间常用中草药》、《新编中医学概要》和《广西实用中草药新选》中均有记载，曾收载于1997版《中国药典》。毛冬青性平，味微苦甘，无毒，具有清热解毒，活血通络之功效。分布于广东、广西、安徽、福建、浙江、江西、台湾等地。夏、秋采，切片晒干。

查阅文献可知，自1983年以来许多学者对毛冬青的化学成分进行了研究，发现其主要成分是五环三萜皂苷类化合物，也是其活性成分。目前对毛冬青药理的研究主要集中在心血管方面，对抗植物病原菌的活性研究未见报道。所以本发明首次对从毛冬青中分离到的Hederagenin-3-O-arabinopyranoside进行11种植物病原菌的抑制活性筛选，为制备生物农药提供一定的药物基础。

发明内容

本发明的目的是研究化合物Hederagenin-3-O-arabinopyranoside(常春藤皂苷元-3-O-阿拉伯糖)在抑制抗植物病原菌方面的应用。

本发明是基于发明人的实验研究而完成的。研究分两大部分：

Hederagenin-3-O-arabinopyranoside的制备；

Hederagenin-3-O-arabinopyranoside在抑制植物病原菌中的应用。

本发明通过下述技术方案实现：

一、Hederagenin-3-O-arabinopyranoside的制备

称取毛冬青干燥根，采用70％～75％乙醇回流提取，提取时间2～4h，合并提取液，减压浓缩得总浸膏；称取总浸膏，加入蒸馏水(1.5L/kg～3L/kg)，制成悬浮液，再依次用石油醚、正丁醇萃取，得到正丁醇萃取部位；正丁醇萃取部位减压浓缩真空干燥，水溶解上大孔树脂柱，分别用水、30％甲醇、50％甲醇、95％甲醇进行梯度洗脱，减压浓缩真空干燥得到50％甲醇洗脱部位；取50％甲醇洗脱部位，硅胶(100～200目)拌样后硅胶柱层析(200～300目)，依次用二氯甲烷-甲醇(20∶1)、二氯甲烷-甲醇(10∶1)、二氯甲烷-甲醇(5∶1)、甲醇进行梯度洗脱，薄层色谱跟踪，合并相同馏份，Hederagenin-3-O-arabinopyranoside存在于二氯甲烷-甲醇(5∶1)洗脱部位，以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂反复经硅胶柱层析，得到Hederagenin-3-O-arabinopyranoside纯品。

称取毛冬青茎叶，采用70％～75％乙醇回流提取，提取时间2～4h，合并提取液，回收20％～80％的溶剂，静置沉淀，过滤，得到沉淀部分；沉淀部分水溶解上大孔树脂柱，分别用水、30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、95％甲醇进行梯度洗脱，减压浓缩真空干燥得到70％甲醇洗脱部位；取70％甲醇洗脱部位，硅胶(100～200目)拌样后硅胶柱层析(200～300目)，依次用二氯甲烷-甲醇(20∶1)、二氯甲烷-甲醇(10∶1)、二氯甲烷-甲醇(5∶1)、甲醇进行梯度洗脱，薄层色谱跟踪，合并相同馏份，Hederagenin-3-O-arabinopyranoside存在于二氯甲烷-甲醇(10∶1)洗脱部位，以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂反复经硅胶柱层析，得到Hederagenin-3-O-arabinopyranoside纯品。

二、Hederagenin-3-O-arabinopyranoside抗植物病原菌试验

将11种植物病原菌(4种细菌和7种真菌)分别活化并转接培养数天，制备成麦氏标准0.5的菌液。在96孔板中分别加入菌液和Hederagenin-3-O-arabinopyranoside，使Hederagenin-3-O-arabinopyranoside终浓度为20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml，设3个平行重复。35℃摇床培养数小时，肉眼观察抑制菌生长的最低浓度即最小抑制浓度(MIC)。结果显示表明Hederagenin-3-O-arabinopyranoside对立枯丝核菌RhizoctoniasolaniKühn和串珠镰孢菌FusariummoniliformeSheld有抑制作用，MCI分别是33.1μM，66.2μM。

附图说明

附图是Hederagenin-3-O-arabinopyranoside的结构图。

具体实施方式

下面结合实施例和数据对本发明作进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1Hederagenin-3-O-arabinopyranoside的制备

称取毛冬青干燥根10kg，加入70％乙醇回流提取3次，3h/次；合并提取液，减压浓缩得总浸膏；称取总浸膏，加入蒸馏水(2L/kg)，制成悬浮液，依次用石油醚和正丁醇萃取，得到正丁醇萃取部位；正丁醇萃取部位减压浓缩真空干燥，水溶解上D101大孔树脂柱，分别用水、30％甲醇、50％甲醇和95％甲醇进行梯度洗脱，减压浓缩真空干燥得到50％甲醇洗脱部位；取50％甲醇洗脱部位，硅胶(100～200目)拌样后硅胶柱层析(200～300目)，依次用二氯甲烷-甲醇(20∶1)、二氯甲烷-甲醇(10∶1)、二氯甲烷-甲醇(5∶1)、甲醇进行梯度洗脱，等量收集，进行TLC点板，合并相同流份，Hederagenin-3-O-arabinopyranoside存在于二氯甲烷-甲醇(5∶1)洗脱部位，以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂反复经硅胶柱层析，得到Hederagenin-3-O-arabinopyranoside纯品。该纯品可以用于制备抗植物病原菌的药物。

实施例2Hederagenin-3-O-arabinopyranoside的制备

称取毛冬青茎叶10kg，采用70％乙醇回流提取，提取时间4h，合并提取液，回收20％～80％的溶剂，静置沉淀，过滤，得到沉淀部分；沉淀部分水溶解上大孔树脂柱，分别用水、30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、95％甲醇进行梯度洗脱，减压浓缩真空干燥得到70％甲醇洗脱部位；取70％甲醇洗脱部位，硅胶(100～200目)拌样后硅胶柱层析(200～300目)，依次用二氯甲烷-甲醇(20∶1)、二氯甲烷-甲醇(10∶1)、二氯甲烷-甲醇(5∶1)、甲醇进行梯度洗脱，薄层色谱跟踪，合并相同馏份，Hederagenin-3-O-arabinopyranoside存在于二氯甲烷-甲醇(10∶1)洗脱部位，以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂反复经硅胶柱层析，得到Hederagenin-3-O-arabinopyranoside纯品。该纯品可以用于制备抗植物病原菌的药物。

理化性质及光谱数据：该化合物为白色粉末，溶于甲醇、二甲基亚砜，ESI-MSm/z：637[M+Na]⁺，结合¹H-NMR谱信息，确定分子式为C₃₅H₅₆O₈。¹H-NMR谱(300MHz，MeOH)δ：5.30(1H，m，H-12)，4.29(1H，d，J＝7.5Hz，H-1′)，1.35(3H，s，H-27)，1.07(3H，s，H-26)，0.97(3H，s，H-30)，0.96(3H，s，H-25)，0.87(3H，s，H-29)，0.80(3H，s，H-24)。以上数据与文献报到的Hederagenin-3-O-arabinopyranoside(常春藤皂苷元-3-O-阿拉伯糖)波谱数据比较一致，故鉴定该化合物为Hederagenin-3-O-arabinopyranoside(常春藤皂苷元-3-O-阿拉伯糖)。

实施例3Hederagenin-3-O-arabinopyranoside抗植物病原菌试验

1.实验材料

细菌：枯草芽孢杆菌CICC10283、化脓链球菌ATCC19615、结核分枝杆菌CGMCC1.562、藤黄微球菌CMCC10240

真菌：新型隐球菌ACCC20337、立枯丝核菌RhizoctoniasolaniKühn、辣椒疫霉PhytophthoracapsiciLeonian、串珠镰孢菌FusariummoniliformeSheld、茄链格孢菌AlternariasolaniJonesetGrout、核盘菌SclerotiniasclerotiorumdeBary、稻瘟病菌CGMCC3.3283

培养基：MH培养基(上海士峰生物科技有限公司)，1640培养基(HyClone)，PDA

阳性对照：两性霉素B，制霉菌素

2.实验方法

细菌：用镊子夹取灭菌牙签挑取平板上的单菌落，置于灭菌的液体MH培养基中(4ml试管)，35℃摇床过夜培养，使菌种活化；接着转接80～500μl菌液至新的液体培养基中(转接量视菌体生长情况而定)，35℃摇床培养2～6h，将菌液先稀释至麦氏标准0.5，再用无菌水稀释20倍备用。

将预先配好的浓度均为1mg/ml的化合物加入到96孔板中，每孔2μl。用排枪取菌液加到96孔板中，药物终浓度为20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml，设3个平行重复。35℃摇床培养16～20h，肉眼观察抑制菌生长的最低浓度即最小抑制浓度(MIC)。

真菌：从真菌培养斜面上挑取菌体用点接法接到PDA平板上，置于28℃培养箱中培养数天，使菌种活化；接着收集孢子，用灭菌的0.9％生理盐水从平板上洗出孢子，用细胞筛过滤，稀释至麦氏标准0.5备用。

将预先配好的浓度均为1mg/ml的化合物加入到96孔板中，每孔2μl。取15μl孢子，加入含0.2％葡萄糖的1640培养基30ml，混合均匀，加入到96孔板中，药物终浓度为20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml，设3个平行重复。35℃摇床培养48～72h，肉眼观察抑制菌生长的最低浓度即最小抑制浓度(MIC)。

3.实验结果

以两性霉素B和制霉菌素为阳性对照，初步评价受试药物对植物病原菌的抑制作用，结果如下所示：

表1：受试药物对植物病原菌的抑制作用

注：数字表示MIC值，Hederagenin-3-O-arabinopyranoside对其余9种植物病原菌无抑制作用。

以上结果显示：Hederagenin-3-O-arabinopyranoside对立枯丝核菌RhizoctoniasolaniKühn和串珠镰孢菌FusariummoniliformeSheld有抑制作用，MCI分别是33.1μM，66.2μM。表明本发明的Hederagenin-3-O-arabinopyranoside具有抗植物病原菌作用。

Claims

1.化合物常春藤皂苷元-3-O-阿拉伯糖在制备抗串珠镰孢菌FusariummoniliformeSheld剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，常春藤皂苷元-3-O-阿拉伯糖是按下述方法制备得到的：

称取毛冬青干燥根，采用70％～75％乙醇回流提取，合并提取液，减压浓缩得总浸膏；称取总浸膏，加入1.5L/kg～3L/kg蒸馏水，制成悬浮液，再依次用石油醚、正丁醇萃取，得到正丁醇萃取部位；正丁醇萃取部位减压浓缩真空干燥，水溶解上大孔树脂柱，分别用水、30％甲醇、50％甲醇、95％甲醇进行梯度洗脱，减压浓缩真空干燥得到50％甲醇洗脱部位；取50％甲醇洗脱部位，100～200目的硅胶拌样后经200～300目的硅胶柱层析，依次用20∶1二氯甲烷-甲醇、10∶1二氯甲烷-甲醇、5∶1二氯甲烷-甲醇、甲醇进行梯度洗脱，薄层色谱跟踪，合并相同馏份，常春藤皂苷元-3-O-阿拉伯糖存在于5∶1二氯甲烷-甲醇洗脱部位，以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂反复经硅胶柱层析，得到常春藤皂苷元-3-O-阿拉伯糖纯品；

称取毛冬青茎叶，采用70％～75％乙醇回流提取，合并提取液，回收20％～80％的溶剂，静置沉淀，过滤，得到沉淀部分；沉淀部分水溶解上大孔树脂柱，分别用水、30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、95％甲醇进行梯度洗脱，减压浓缩真空干燥得到70％甲醇洗脱部位；取70％甲醇洗脱部位，100-200目硅胶拌样后经200～300目的硅胶柱层析，依次用20∶1二氯甲烷-甲醇、10∶1二氯甲烷-甲醇、5∶1二氯甲烷-甲醇、甲醇进行梯度洗脱，薄层色谱跟踪，合并相同馏份，常春藤皂苷元-3-O-阿拉伯糖存在于10∶1二氯甲烷-甲醇洗脱部位，以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂反复经硅胶柱层析，得到常春藤皂苷元-3-O-阿拉伯糖纯品。