CN105669793B - 齐墩果烷型三萜皂苷类化合物、其制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及从鸡冠花成熟的种子中提取分离的三种新的齐墩果烷型三萜皂苷类化合物，即青葙苷K、青葙苷L和青葙苷M以及这些化合物的制备方法，还涉及青葙苷K和青葙苷L在制备预防或治疗抗肝纤维化的药物中的用途。

Description

齐墩果烷型三萜皂苷类化合物、其制备方法及其应用

技术领域

本发明属于天然药物化学及医药技术领域，尤其涉及从鸡冠花(Celosiacristata L.)的成熟种子中提取分离得到了三种齐墩果烷型三萜皂苷类新化合物、这些化合物的制备方法及这些化合物在制备治疗抗肝纤维化药的药物中的应用。

背景技术

鸡冠花(Celosia cristata L.)，中文别名：鸡髻花、老来红、芦花鸡冠、笔鸡冠、小头鸡冠、凤尾鸡冠、大鸡公花、鸡角根、红鸡冠，为一年生苋科草本植物，夏秋季开花，花多为红色，呈鸡冠状，故称鸡冠花。鸡冠花子即鸡冠花的成熟种子，始载于《嘉佑本草》。《本草纲目》载“味甘，凉，无毒。治痔漏下血，赤白下痢，崩中，赤白带下，分赤白用”。祖国传统医学认为鸡冠花性凉，味甘涩，具有清热除湿、收敛涩肠、凉血止血、止泻止带之功效，适用于赤白痢疾、功能性子宫出血、痔漏下血、吐血、咯血、衄血、血淋、白带过多、崩漏、遗精、乳糜尿等病症；鸡冠花子可清肝明目，主治目赤肿痛，翳障等症。此外，鸡冠花还是一种可以食用的植物，元代李果编辑、明代李时珍参订、姚可成补辑的《食物本草》中记载了不少人们食用鸡冠花积累的经验方。现代药理学研究表明，鸡冠花子有止血、抗衰老、增强机体耐受力、防治动脉粥样硬化、预防骨质疏松和增强机体免疫力等作用，具有较高的药用价值。姜氏等研究了鸡冠花子对S180荷瘤鼠免疫器官的影响。结果表明，鸡冠花子提取物对S180肿瘤细胞的生长有抑制作用，可增加免疫器官的重量，而且不同剂量鸡冠花子提取物的抑瘤作用及增强免疫系统活性的能力也不同。李氏等研究了鸡冠花子黄酮类化合物对成骨细胞增殖和转化生长因子-β1(TGF-β1)的作用，从细胞水平探讨鸡冠花子黄酮类化合物在预防骨质疏松中的作用，该研究还显示，鸡冠花子黄酮类化合物具有促进大鼠成骨细胞矿化及成骨细胞胰岛素样生长因子-1(IGF-1)表达的作用，说明鸡冠花子黄酮类化合物可促进大鼠成骨细胞的代谢，在预防骨质疏松方面可能具有一定的作用。郭氏等分别以小鼠和家兔为研究对象，通过灌胃给药的方法，测定小鼠的出血时间(BT)及家兔凝血时间(CT)、血浆复钙时间(PRT)、凝血酶原时间(PT)、优球蛋白溶解时间(ELT)，结果表明给药后小鼠(断尾法)BT明显缩短(P＜0.01)，家兔(试管法)的CT、PRT、PT明显缩短(均P＜0.05)，而ELT明显延长(P＜0.01)，表明鸡冠花子“收涩止血”的作用与其促进凝血和抑制纤溶活性有关，同时其促凝血因子生成或抑制纤维系统亢进的作用，为鸡冠花子止血作用尤其在妇科出血病证上的应用提供了依据。有关鸡冠花子化学成分研究的报道显示，鸡冠花含有黄酮、酚酸、脂肪类和三萜皂苷等成分。

但是，到目前为止，没有一篇文献报道本发明所述的从鸡冠花成熟的种子中提取分离的三种新的齐墩果烷型三萜皂苷类化合物，即青葙苷K、青葙苷L和青葙苷M；也没有报道把该青葙苷K和青葙苷L用于制备预防和治疗抗肝纤维化药的药物。

发明内容

本发明的目的在于提供从鸡冠花成熟的种子中提取分离的三种新的齐墩果烷型三萜皂苷类化合物，即青葙苷K、青葙苷L和青葙苷M；同时，发现青葙苷K和青葙苷L具有抗肝纤维化的活性，具有制备保肝护肝药物的用途，从而完成本发明。

因此，本发明的目的之一是提供三种齐墩果烷型三萜皂苷类化合物，即青葙苷K、青葙苷L和青葙苷M。

其中，青葙苷K具有式(1)所示的化学结构；青葙苷L具有式(2)所示的化学结构；青葙苷M具有式(3)所示的化学结构。

式(1)

式(2)

式(3)。

本发明所述的青葙苷K或青葙苷L或青葙苷M是从苋科植物鸡冠花子Celosiacristata L.提取得到。

本发明的另一目的是提供青葙苷K、青葙苷M和青葙苷M的制备方法，所述方法包括：回流提取鸡冠花种子粗粉，减压浓缩得到总浸膏，总浸膏用水分散后，采用有机溶剂萃取得到萃取物，萃取物经分离得到所述青葙苷K、青葙苷L和青葙苷M。

在优选实施方式中，本发明所述的方法包括：

鸡冠花子5kg粉碎后，用5倍量60％乙醇加热回流提取3次，每次2h，过滤，提取液减压浓缩至浸膏，用适量水分散后依次以等体积石油醚、乙酸乙酯和正丁醇分别萃取4次，减压回收得各相萃取浸膏分别为62g、8g和40g；

正丁醇相浸膏40g经MCI微孔树脂柱以乙醇-水(0:100-100:0)梯度洗脱，分别收集20:80，40:60，60:40和80:20四个部分的洗脱液；取第3部分洗脱液(60:40)经过C-18反相硅胶柱层析以乙腈-水(32:68)洗脱，洗脱液薄层色谱检视后，得到3个组分；将第3组分经过Sephadex LH-20凝胶色谱柱层析(甲醇:水＝80:20)及高效液相色谱分离纯化得到所述青葙苷K、青葙苷L和青葙苷M。

所述色谱分离条件为：高效液相色谱仪：安捷伦1260Infinity系统；色谱柱：(YMC-Pack ODS-A,10×250mm,5μm)；洗脱剂：乙腈-水(33:67)，流速2ml/min，检测波长：203nm。

本发明的另一目的是提供一种药物组合物，其包含作为活性成分的本发明所述青葙苷K或所述青葙苷L，以及一或多种药学上可接受的载体。

在本发明的另一方面，本发明的包含所述青葙苷K或所述青葙苷L的药物组合物可被制成片剂、胶囊、颗粒剂、口服液等任意一种药学上可接受的剂型，用于临床治疗。

本发明的进一步目的还在于提供所述青葙苷K或所述青葙苷L或所述药物组合物在制备预防或治疗抗肝纤维化的药物中的应用。

本发明的青葙苷K、L和M结构新颖，制备方法简单，成本低廉，为开发保肝护肝药物提供了先导化合物。

附图说明

图1为本发明的青葙苷K的化学结构式，其中碳原子用数字编号；

图2为本发明的青葙苷L的化学结构式，其中碳原子用数字编号：

图3为本发明的青葙苷M的化学结构式，其中碳原子用数字编号；

图4为本发明的青葙苷K的HMBC、¹H-¹H COSY关键信号；

图5为本发明的青葙苷L的HMBC、¹H-¹H COSY关键信号；

图6为本发明的青葙苷M的HMBC、¹H-¹H COSY关键信号；

图7为青葙苷K、L和M对肝星状细胞活力的影响比较图；

图8为青葙苷K、L和M对肝星状细胞I型胶原的影响比较图；

图9为青葙苷K、L和M对肝星状细胞TGFβ1蛋白水平的影响比较图。

具体实施方式

以下将结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。应理解的是，本发明不应被解释为限制至所述具体实施例或受到所述具体实施例的限制。

1、提取物的制备

鸡冠花子药材于2013年9月采集自江苏省宿迁市，经上海中医药大学生药学周秀佳教授鉴定为苋科青葙属植物鸡冠花(Celosia cristata L.)的成熟种子，标本保存于上海交通大学附属第六人民医院南院中心实验室(标本编号2013091212)。

鸡冠花子5kg粉碎后，用5倍量60％乙醇加热回流提取3次，每次2h，过滤，提取液减压浓缩至浸膏，用适量水分散后依次以等体积石油醚、乙酸乙酯和正丁醇分别萃取4次，减压回收得各相萃取浸膏分别为62g、8g和40g。

2、化合物的分离纯化

正丁醇相浸膏40g经MCI微孔树脂柱以乙醇-水(0:100-100:0)梯度洗脱，分别收集20:80，40:60，60:40和80:20四个部分的洗脱液。取第3部分洗脱液(60:40)经过C-18反相硅胶柱层析以乙腈-水(32:68)洗脱，洗脱液薄层色谱检视后，得到3个组分。将第3组分经过Sephadex LH-20凝胶色谱柱层析(甲醇:水＝80:20)及高效液相色谱分离纯化，色谱分离条件如下：高效液相色谱仪：安捷伦1260Infinity系统；色谱柱：(YMC-Pack ODS-A,10×250mm,5μm)；洗脱剂：乙腈-水(33:67)，流速2ml/min，检测波长：203nm。最终得到青葙苷K(18mg)、青葙苷L(15mg)和青葙苷M(10mg)。上述比例均为体积比。

3、结构鉴定(结合表1、表2和图4-6)

青葙苷K

白色无定型粉末，(c 0.25,CH₃OH)；熔点：280～282℃；HR-ESI-MS:m/z965.4713[M+Na]⁺(计算值C₄₇H₇₄O₁₉Na 965.4722)，确定分子式为C₄₇H₇₄O₁₉，不饱和度为11。

¹H NMR谱显示7个甲基单峰信号:δ_H 1.45(3H,s)，1.36(3H,s)，1.30(3H,s)，1.26(3H,s)，1.11(3H,s)，0.88(3H,s)，0.85(3H,s)；1个三萜母核的环内双键烯氢信号δ_H 5.40(1H,t,J＝3.7Hz)；三个糖的端基质子信号δ_H 6.29(1H,d,J＝8.1Hz)，5.31(1H,d,J＝7.4Hz),5.02(1H,d,J＝7.1Hz)，从偶合常数判断均为β-糖苷键。¹³C NMR和DEPT谱显示11个季碳、18个-CH、11个-CH₂、7个-CH₃。从¹³C NMR中显示2个羧基(δ_c176.4,172.4)，分别为苷化成酯羧基和葡萄糖醛酸羧基信号，一组双键(δ_c144.0,123.0)，3个糖的端基碳(δ_c106.4,106.1,95.7)。在HMBC谱中δ_H 5.31与δ_c 42.2(C-14)，48.4(C-9)相关，表明双键位置在12(13)位，提示为齐墩果烷型三萜皂苷。对比已知化合物青葙苷H的氢谱和碳谱数据，可知二者的核磁数据很相似，该化合物少一个醛基碳，多一个甲基碳，一个亚甲基碳，多一个甲基碳。HMBC谱中δ_H1.36(H-24)，1.30(H-23)与δ_c 89.7(C-3)相关提示3位碳附近连有2个甲基；δ_H4.63(H-2)与δ_c37.0(C-10)的相关信号提示2位连有羟基；δ_H6.29(H-Glc-1”'),3.16(H-18),2.06(H-16β),1.79(H-16α)与δ_c176.4(C-28)相关，以及Glc-1”'的低场位移δ_H 6.28(+1)提示葡萄糖连在28位羧基；δ_H3.36(H-3)与δ_c106.1(C-GlcA-1')、δ_H5.31(H-GlcA-1')与δ_c86.1(C-GlcA-3')、δ_H4.33(H-GlcA-3')与δ_c106.4(C-Xyl-1”)相关，提示木糖通过3位糖苷键与葡萄糖醛酸连接(图4)。通过详细的HSQC、HMBC、¹H-¹H COSY谱分析对化合物的碳氢信号进行了全归属(表1和表2)。综合以上分析，确定了该化合物的结构为2-羟基-3-O-[β-D-吡喃木糖基(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基]-28-O-β-D-吡喃葡萄糖基齐墩果酸，经检索该化合物为新化合物，命名为青葙苷K(Celosin K)。

青葙苷L

白色无定型粉末，(c 0.20,CH₃OH)；熔点：281～282℃；HR-ESI-MS:m/z981.4667[M+Na]⁺(计算值C₄₇H₇₄O₂₀Na 981.4671)，确定分子式为C₄₇H₇₄O₂₀，不饱和度为11。

¹H NMR谱显示6个甲基单峰信号:δ_H 1.54(3H,s)，1.32(3H,s)，1.21(3H,s)，1.13(3H,s)，0.86(3H,s)，0.84(3H,s)；1个三萜母核的环内双键烯氢信号δ_H 5.38(1H,t,J＝3.7Hz)；三个糖的端基质子信号δ_H 6.28(1H,d,J＝8.1Hz)，5.26(1H,d,J＝7.7Hz)，5.24(1H,d,J＝7.6Hz)，从偶合常数判断均为β-糖苷键。¹³C NMR和DEPT谱显示11个季碳、18个-CH、12个-CH₂、6个-CH₃。从¹³C NMR中显示2个羰基(δ_c176.4,172.5)；一组双键(δ_c144.1,123.0)；3个糖的端基碳(δ_c 105.7,106.1,95.7)；在HMBC谱中δ_H 5.38与δ_c42.2(C-14),48.5(C-9)相关，表明双键位置在12(13)位，提示为齐墩果烷型三萜皂苷。对比已知化合物青葙苷H的氢谱和碳谱数据，可知二者的谱图很相似，该化合物少一个醛基碳，多一个亚甲基碳，从分子式的元素组成来看该化合物的氢原子数目多出2个，由此可以推测青葙苷H可能为该化合物的23-OH氧化为-CHO的产物。2D-NMR谱的分析证实了这个推测：HMBC谱中δ_H 3.65(H-23α)与δ_c 82.7(C-3)、42.9(C-4)、47.5(C-5)、14.9(C-24)相关，表明23位连有羟基；δ_H 6.28(H-Glc-1”')、3.14(H-18)、2.02(H-16β)与δ_c176.4(C-28)相关，以及Glc-1”'的低场位移δ_H6.28(+1)提示葡萄糖连在28位羧基；δ_H 4.42(H-GlcA-4')、4.52(H-GlcA-5')与δ_c172.5(C-GlcA-6')，提示另一葡萄糖单元为葡萄糖醛酸形式即C-6为羧基；δ_H 5.26(H-GlcA-1')与δ_c82.7(C-3)相关，提示葡萄糖醛酸单元与C-3相连；δ_H 5.24(H-Xyl-1”)与δ_c86.3(C-GlcA-3')、67.3(C-Xyl-5”)相关，提示木糖单元与葡萄糖醛酸3位碳(C-GlcA-3')相连(图5)。通过详细的HSQC、HMBC、¹H-¹H COSY谱分析(对碳氢信号进行了全归属(表1和表2)。综合以上分析，确定了该化合物的结构为2,23-二羟基-3-O-[β-D-吡喃木糖基(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基]-28-O-β-D-吡喃葡萄糖基齐墩果酸，经检索该化合物为新化合物，命名为青葙苷L(Celosin L)。

青葙苷M

白色无定型粉末，(c 0.18,CH₃OH)；熔点：281～283℃；HR-ESI-MS:m/z1011.4771[M+Na]⁺(计算值C₄₈H₇₆O₂₁Na 1011.4777)，确定分子式为C₄₈H₇₆O₂₁，不饱和度为11。

¹H NMR谱显示6个甲基单峰信号:δ_H 1.95(3H,s)，1.52(3H,s)，1.20(3H,s)，1.12(3H,s)，0.86(3H,s)，0.84(3H,s)；1个三萜母核的环内双键烯氢信号δ_H 5.38(1H,t,J＝3.7Hz)；三个糖的端基质子信号δ_H 6.29(1H,d,J＝8.1Hz)，5.15(1H,d,J＝7.9Hz)，5.03(1H,d,J＝7.8Hz)，从偶合常数判断均为β-糖苷键；¹³C NMR和DEPT谱显示11个季碳、18个-CH、12个-CH₂、6个-CH₃。从¹³C NMR中显示2个羰基(δ_c176.4,172.5)；一组双键(δ_c144.1,122.8)；3个糖的端基碳(δ_c 105.1,104.8,95.7)；在HMBC谱中δ_H 5.38与δ_c42.2(C-14)，48.5(C-9)相关，表明双键位置在12(13)位，提示为齐墩果烷型三萜皂苷。通过与前述化合物青葙苷L的氢谱、碳谱相比，该化合物其中一个羧基碳化学位移差别较大(δ_c172.5→δ_c180.6)，从分子式的元素组成来较青葙苷L多出一个CH₂O单元，结合两个化合物的氢谱碳谱数据，该化合物多出一个CH信号但并未发现甲氧基信号，而最大的可能是糖的结构发生变化，由此可以推测该化合物与青葙苷L相比较其中一个五碳糖变为六碳糖。通过与已知化合物青葙苷H和青葙苷I的氢谱、碳谱数据比较，推测该化合物具有与青葙苷I相同的苷元结构，并且28位的羧基同青葙苷H一样由β-D-吡喃葡萄糖取代。HMBC谱中，δ_H 4.64(H-3)与δ_c105.1(C-Glc-1')、52.8(C-4)、180.6(C-23)、14.1(C-24)相关，δ_H1.95(H-24)与δ_c180.6(C-23)相关，验证羧基在23位；δ_H 6.28(H-Glc-1”')、3.14(H-18)、2.02(H-16β)与δ_c176.4(C-28)相关，以及Glc-1”'的低场位移δ_H 6.28(+1)提示葡萄糖连在较强吸电子基团(28位羧基)；δ_H 5.03(H-Glc-1')与δ_c86.0(C-3)相关，提示一个葡萄糖单元与C-3相连；δ_H 5.15(H-Glc-1”)与δ_c80.7(C-Glc-4')相关，提示另第二个葡萄糖单元连接在第一个葡萄糖单元的4位碳(C-Glc-4')(图6)。通过详细的HSQC、HMBC、¹H-¹H COSY谱分析对碳氢信号进行了全归属(表1和表2)。综合以上分析，确定了该化合物的结构为2-羟基-3-O-[β-D-吡喃葡萄糖基(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]-28-O-β-D-吡喃葡萄糖基齐墩果-23,28-二酸，经检索该化合物为新化合物，命名为青葙苷(Celosin M)。

表1青葙苷K、青葙苷L和青葙苷M苷元部分的¹H,¹³C NMR数据(C₅D₅N；δ,ppm；J,Hz)

表2青葙苷K、青葙苷L和青葙苷M糖部分的¹H,¹³C NMR数据(C5D5N；δ,ppm；J,Hz)

4.生物活性

4.1实验材料

PBS，DMEM培养基，Medium199，胎牛血清(FBS)，胰蛋白酶-EDTA溶液，P/S购自Gibco，肝素购自赛诺菲，胰岛素购自诺和诺德，DNaseI，Collagenase B购自Roche，Histodenz，MTT，硫代乙酰胺(TAA)Sigma，Ⅰ型胶原，TGFβ1等ELISA kit和抗体购自R&D，CTG细胞活力试剂购自Promega，PCR试剂购自Invitrogen。

生物安全柜(Thermo)，二氧化碳培养箱(Thermo)，倒置显微镜(徕卡)，酶标仪(BioRad)，PCR(Bio-Rad)，动物麻醉机(Matrix)，96孔板购自Costar。

SD大鼠，雄性，400g左右用于肝星状细胞分离，200g左右用于TAA诱导肝纤维化模型。购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，饲养于上海中医药大学实验动物中心SPF级动物房；实验动物生产许可证编号：SCXK(沪)2007-0005；实验动物使用许可证编号：SYXK(沪)2009-0069。

4.2实验方法

4.2.1肝星状细胞的培养

选择400g左右SD大鼠，异氟烷麻醉，用改良的Friedman方法，以0.015％胶原酶I和1％链酶蛋白酶原位消化正常大鼠肝脏，Histodenz梯度离心，获取肝星状细胞。将细胞按1×10⁶/ml的浓度接种在培养瓶内，5％CO₂的潮湿环境内培养，24h内静置，48h后更换培养液，24h后第二次换液。15天后传第一代，以后每10天传一代。

4.2.2化合物对肝星状细胞活力的影响

接种2.5×10⁵/孔细胞加入96孔板内，每孔100μl，5％CO₂，37℃条件下培养过夜，之后分别加入青箱苷K、L、M(100，50，25，5μg/ml)，每个浓度设3个复孔，继续培养24h后弃掉培养液，冷却至室温。然后每孔加入100μl CTG，震荡2min，室温放置10min，酶标仪检测各孔激发光，计算样品对细胞的活力。

4.2.3化合物对肝星状细胞I型胶原和TGFβ1蛋白水平的影响

肝星状细胞于10％胎牛血清、100U/ml青链霉素的DMEM培养液，5％CO₂，37℃条件下培养。试验前将细胞悬液浓度调整为2.5×10⁶/ml，96孔板每孔加100μl调整后的细胞悬液，5％CO₂，37℃培养过夜。然后分别加入青箱苷K、L、M(100，50，25，5μg/ml)，每个浓度设3个复孔。继续培养48h，收集培养上清液，ELISA法测定培养上清Ⅰ型胶原和TGFβ1含量。

4.3统计学处理

组间数据差异以SPSS11.5统计软件进行t检验。

4.4结果

如图7所示，青葙苷K，青葙苷L可以显著抑制肝星状细胞的活力，且随着浓度的增加其抑制活性也随着增强。在浓度100μg/ml时，青葙苷K和青葙苷L作用的肝星状细胞的存活率分别为59.25％和44.97％。青葙苷M对肝星状细胞活力无明显影响。

由图8和图9可知，青葙苷K和L能够明显抑制肝星状细胞的胶原生成率及TGFβ1的表达，且随着浓度的增加有增强的趋势。青葙苷K在浓度为25，50和100μg/ml，青葙苷L在50和100μg/ml时，能够显著抑制星状细胞的生成率，在浓度为100μg/ml时，抑制率分别达到46.32％和36.97％。青葙苷K和L在浓度为25和50μg/ml时，可以显著抑制肝星状细胞TGFβ1的表达。青葙苷M对肝星状细胞I型胶原和TGFβ1的表达无明显影响。

上述一系列实验结果表明，本发明所涉及的化合物青葙苷K和L具有抗肝纤维化的活性，为保肝护肝药物的开发提供了先导化合物。

Claims (2)

1.一种制备青葙苷K、青葙苷L和青葙苷M的方法，所述方法包括：回流提取鸡冠花种子粗粉，减压浓缩得到总浸膏，总浸膏用水分散后，采用有机溶剂萃取得到萃取物，萃取物经分离得到所述青葙苷K、所述青葙苷L和所述青葙苷M：

所述青葙苷K具有式(1)所示的化学结构：

所述青葙苷具有式(2)所示的化学结构：

所述青葙苷M具有式(3)所示的化学结构:

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：鸡冠花子5kg粉碎后，用5倍量60％乙醇加热回流提取3次，每次2h，过滤，提取液减压浓缩至浸膏，用适量水分散后依次以等体积石油醚、乙酸乙酯和正丁醇分别萃取4次，减压回收得各相萃取浸膏分别为62g、8g和40g；

正丁醇相浸膏40g经MCI微孔树脂柱以乙醇-水0:100至100:0梯度洗脱，分别收集20:80，40:60，60:40和80:20四个部分的洗脱液；取第3部分洗脱液60:40经过C-18反相硅胶柱层析以乙腈-水32:68洗脱，洗脱液薄层色谱检视后，得到3个组分；将第3组分经过SephadexLH-20凝胶色谱柱层析及高效液相色谱分离纯化得到所述青葙苷K、所述青葙苷L和所述青葙苷M；

所述色谱分离条件为：高效液相色谱仪：安捷伦1260Infinity系统；色谱柱：YMC-PackODS-A,10×250mm,5μm；洗脱剂：乙腈-水33:67，流速2ml/min，检测波长：203nm。