CN101570561A - 一种新型青葙皂苷类化合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药技术领域，是一种从青葙(Celosia argentea L.)中提取的青葙皂苷类新化合物青葙苷C和青葙苷D，化学结构式如图，其中，基团R为L－吡喃鼠李糖基(1→2)－D－吡喃夫糖基或D－吡喃葡萄糖基(1→4)－L－吡喃鼠李糖基－D－吡喃夫糖基。经动物实验，其具有防治肝病、心脑血管病、代谢性疾病、痴呆、抑郁或焦虑活性，本发明化合物制备方法简单，成本低廉，活性显著，本发明为防治肝病、心脑血管病、代谢性疾病、痴呆、抑郁或焦虑的药物提供了新的化合物。

Description

一种新型青葙皂苷类化合物及其用途

技术领域

本发明涉及医药技术领域，是一种从青葙(Celosia argentea L.)中提取的青葙皂苷类新化合物青葙苷C和青葙苷D及其在制备防治肝病、心脑血管病、代谢性疾病、痴呆、抑郁或焦虑药物中的应用。

背景技术

青葙子(Semen Celosiae)为苋科(Amaranthcea)青葙(Celosia argentea L.)的干燥成熟种子。味苦，性微寒，有清肝、明目、祛风热、降血压、抗炎之功效。常用于目赤肿痛、角膜炎、角膜云翳、虹膜睫状体炎、眩晕、皮肤风热瘙痒、疥癣的治疗。本发明人已将青葙中的青葙皂苷成分青葙苷A、青葙苷B及其用途申请了专利(专利号：ZL200610026789.3)，但至今未见有青葙苷C和青葙苷D的相关报道。

发明内容

本发明提供一种从青葙中分离到的具有防治肝病、心脑血管病、代谢性疾病、痴呆、抑郁或焦虑活性的新的青葙皂苷类化合物青葙苷C和青葙苷D，其化学结构式如下：

其中，基团R为L-吡喃鼠李糖基(1→2)-D-吡喃夫糖基或D-吡喃葡萄糖基(1→4)-L-吡喃鼠李糖基-D-吡喃夫糖基。

本发明化合物制备方法如下：

1.制备青葙总皂苷：

将青葙干燥成熟的种子青葙子粉碎后用含水乙醇按常规渗漉提取，提取液减压浓缩得浓缩液，浓缩液通过D101大孔树脂柱，依次用水、30％乙醇、60％乙醇和95％乙醇梯度洗脱。收集30％和60％的乙醇洗脱液并分别减压浓缩、干燥，得青葙总皂苷I和青葙总皂苷II，合并之即得青葙总皂苷；

2.分离提纯：

将青葙总皂苷进行反复硅胶柱层析，并用Sephadex LH-20或反向硅胶纯化，分别得青葙苷C和青葙苷D。

经药理和药效学实验，本发明化合物青葙苷C和青葙苷D具有防治肝病、心脑血管病、代谢性疾病、痴呆、抑郁或焦虑活性。这些疾病包括脂肪肝、肝损伤、肝纤维化、肝硬化、冠心病、心肌梗塞、心肌缺血、脑缺血、脑梗塞、脑中风、糖尿病、高胰岛素血症、胰岛素抵抗力症、肥胖症、糖尿病不耐受症、高血脂症。

本发明化合物制备方法简单，成本低廉，活性显著，本发明为防治肝病、心脑血管病、代谢性疾病、痴呆、抑郁或焦虑的药物提供了新的化合物。

具体实施方式

实施例1.制备青葙苷C和青葙苷D

将安徽亳州的青葙子50kg，粉碎后按常规用50％乙醇渗漉提取，提取液减压浓缩得浓缩液，浓缩液通过D101大孔树脂柱，依次用水、30％乙醇、60％乙醇和95％乙醇梯度洗脱，收集60％的乙醇洗脱液并减压浓缩、干燥，将其进行三次硅胶柱层析，以二氯甲烷-甲醇-水(9∶1∶0.1～7∶3∶0.3)溶剂系统洗脱，再用反相柱ODS-C₁₈和Sephadex LH-20纯化，分别得到青葙苷C 25mg与青葙苷D 43mg。

结构鉴定

1.青葙苷C

白色粉末，m.p.：245～247℃，ESI-MS：m/z 797.67[M]^-，确定化合物分子量为798。UV(MeOH)显示化合物无明显紫外吸收。核磁共振数据见表1

表1青葙苷C、D的¹H、¹³C-NMR数据(C₅D₅N+D₂O，δ，ppm)

由表1的H谱与C谱可以推断该化合物为五环三萜皂苷类化合物。

在HMBC谱中，184的羰基碳和82.3的仲碳都与2.10(3H，s)的甲基氢耦合，表明该甲基和羰基都连在4位的季碳上。1.67、1.94(d，2×CH3)的甲基氢都与糖上的碳信号相关，表明化合物中含有两个甲基五碳醛糖。6.29(1H，d，J＝7.8Hz)的糖端基氢和75.5.0的碳有相关，表明该化合物中的两个糖是1→2位连接；6.02(d，J＝8.2Hz)的糖端基氢和178的羰基碳有相关，表明化合物中的两个糖是连接在苷元的28位上。

对比齐墩果酸的13C-NMR谱数据，化合物的13C-NMR谱和参考文献报道的数据基本一致，故确定化合物的苷元结构为：23-羧基-齐墩果酸。

综合以上分析，确定化合物的结构为：23-羧基-28-O-[a-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-β-D-吡喃夫糖基]-齐墩果酸。为一新化合物，命名为青葙苷C。

2.青葙苷D

白色粉末，m.p.：239～241℃，FAB-MS：m/z 959.69[M]-，确定化合物分子量为960。UV(MeOH)显示化合物无明显紫外吸收。核磁共振数据见表1

由表1的H谱与C谱可以推断该化合物为五环三萜皂苷类化合物。

该化合物用三氟乙酸水解后，采用GC-MS分析，结构显示青葙苷D中存在D-夫糖、L-鼠李糖和D-葡萄糖。

在HMBC谱中，1.55、1.77(d，2×CH3)的甲基氢都与糖上的碳信号相关，表明青葙苷D中也含有两个甲基五碳醛糖，通过与青葙苷C的甲基五碳醛糖化学位移比较，推测青葙苷D中的这个两个甲基五碳醛糖与青葙苷C中的一样。50.9(1H，d)的糖端基氢和85.50的碳有相关，6.46(1H，d)的糖端基氢和74.3的碳相关，表明该化合物中的三个糖是1→2和1→4位连接；6.10(1H，d)的糖端基氢和178的碳有相关，表明化合物中的两个糖是连接在苷元的28位上。

综上所述，确定化合物的结构为：23-羧基-28-O-[β-D-吡喃葡萄糖基(1→4)-a-L-吡喃鼠李糖基-β-D-吡喃夫糖基]-齐墩果酸，为新化合物，命名为青葙苷D。

药理药效试验

一、本发明化合物对肝病的防治作用

药效学研究选用了四氯化碳(CCl4)诱导的小鼠急性肝损伤模型、大鼠慢性肝纤维化模型以及高脂饲料诱导的慢性脂肪肝动物模型。前两个模型是经典的筛选保肝及肝纤维化防治药物的模型，第三种模型是被大家公认的与人体高血脂症性脂肪肝机制相似，用于高脂血症脂肪肝研究和调血脂药物开发的经典模型。

(一)对四氯化碳引起的小鼠急性肝损伤的保护作用

1.试验动物和方法：

昆明种小鼠50只，分为5组，每组10只，分别为：正常对照组，模型对照组，阳性对照组(阳性对照药为联苯双酯，下同)，本发明药物组：青葙苷C(1#，下同)、青葙苷D(2#，下同)。将药物配成水溶液，按小鼠体重灌胃给药，阳性对照药联苯双酯和本发明化合物剂量分别为200mg/kg、2mg/Kg、2mg/Kg，灌胃体积为0.2ml/10g，连续口服给药3天。正常对照组和模型对照组灌胃等体积的蒸馏水。除正常对照组以外，其余各组在第3天给药后1h腹腔注射0.1％四氯化碳10ml/kg，18小时后各组摘眼球采血，离心血清测定天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和碱性磷酸酶(ALP)。结果见表2。

表2本发明化合物对四氯化碳引起肝损伤的保护作用血液生化指标

与模型对照组比较；**p＜0.01 ****p＜0.0001

由表2可见，青葙苷C和青葙苷D连续给药3天，能明显抑制四氯化碳引起的AST、ALT和ALP的升高，其作用与正常对照组接近，明显好于联苯双酯。

(二)对脂肪肝的治疗作用

1、实验动物及方法：

Wister大鼠70只，体重180-230g，随机分成两组，第一组10只，为正常组，给与正常饲料；其余动物分为第二组，给与高脂饲料60天后，处死其中10只，做肝脏病理切片，确定脂肪肝模型成立后，随机分为下列5组，①模型对照组：连续给与高脂饲料；②非处理组：动物改食普通饲料，③本发明药物组：动物改食普通饲料，给与药物1#-青葙苷C、2#-青葙苷D，剂量都为2mg/Kg/d，连续给药30天。

2、观察指标：

a体重：分别在0、30、60、90天时称重

b血液生化指标：血清ALT、AST、血清总胆固醇，甘油三酯

c病理学检查：石蜡切片、HE染色，观察脂肪肝及炎症坏死程度。

结果见表3、表4、表5。

表3各实验组动物血清中血脂的变化

与模型对照组比较，^**P＜0.01

表4各实验组动物血清转氨酶含量的变化

与模型对照组比较，^**P＜0.01

表5各实验组动物肝脏脂肪变性的程度(％)

由表3、4、5可见，给药30天，青葙苷C和青葙苷D可明显降低血清中的胆固醇及甘油三酯，有效缓解高脂饲料引起的脂肪肝变性，改善因脂肪变性而导致的肝功能损害。

(三)对四氯化碳(CCl4)诱发的大鼠慢性肝纤维化的作用

1、实验动物及方法：

雄性Wister大鼠100只，随机分为5组，每组20只，分别为正常对照组，模型对照组，阳性对照组，本发明药物组：青葙苷C(1#)和青葙苷D(2#)。除正常对照组外，其余各组动物均每周皮下注射10％的CCl4(5ml/Kg)2次，共12周；从开始注射CCl4起，每天按药物剂量给药1次，共12周，给药方式：灌胃给药，给药剂量：阳性药物联苯双酯160mg/Kg/d，本发明药物1#-青葙苷C和2#-青葙苷D，均为2mg/Kg/d。

2、观察指标：

a.给药12周后，按ELSA试剂盒方法测定血清中天冬氨酸氨基转氨酶(AST)、丙氨酸氨基转氨酶(ALT)、血清总蛋白(TP)、微量白蛋白(ALB)的含量；

b.取肝组织，按ELSA试剂盒方法测定羟脯氨酸(HP)、)、III型胶原前肽(PIIIP)、)、IV型胶原(CIV)的含量；

c..取肝组织，HE染色，作病理组织学检查，计算胶原容积积分(CVF)。结果见表6、表7、表8。

与模型对照组比较，^**P＜0.01

表7本发明化合物对CCl₄所致的大鼠慢性肝损伤后肝纤维化的影响

与模型对照组比较，^**P＜0.01

表8本发明化合物对CCl₄所致的大鼠慢性肝损伤后胶原容积积分的影响

与模型对照组比较，^**P＜0.01

由表6、7、8可见，本发明化合物对CCl4所致的大鼠慢性肝纤维化有明显治疗作用，效果接近甚至好于阳性对照组。

二、本发明化合物的心脑血管活性

(一)对异丙肾上腺素(ISO)所至大鼠心肌缺血的治疗作用

1、实验动物与方法

健康雌性SD大鼠32只，随机分为4组，每组8只，分别为正常对照组、模型对照组和本发明药物组。正常对照组和模型对照组分别预先灌胃等体积生理盐水，药物1#、2#组分别灌胃，青葙苷C和青葙苷D剂量均为2mg/Kg/d，连续给药三天。模型对照组和阳性药物组第二天和第三天给药1h后皮下注射ISO(1ml/Kg体重)，正常对照组皮下注射等容量的生理盐水，分别记录最后一次给受试药物前及第2次给与ISO后30min的心电图，测量J点值，计算给与ISO后各组大鼠J点位移的绝对值。大鼠腹主动脉采血，肝素抗凝后离心分离血浆，分光光度法测定血浆中乳酸脱氢酶(LDH)活性单位。各给药组统计结果和模型组比较进行t-检验。LDH计算公式如下；

结果见表9、表10。

表9本发明化合物对ISO所致大鼠心肌缺血J点位移的影响(n＝8)

与模型对照组比较，^*p＜0.05，^**p＜0.01，

表10本发明化合物对ISO大鼠LDH活性单位的影响(n＝8)

与模型对照组比较，^*p＜0.05，^**p＜0.01，

由表9、10可见，青葙苷C和青葙苷D对ISO引起的大鼠心肌缺血有显著的抑制作用，并可减轻缺血心肌的损伤，因此对心肌有明显的缺血保护作用。

(二)本发明化合物对大鼠冠状动脉结扎所致急性心肌缺血的保护作用

1、实验动物与方法

取体重200g左右的健康SD大鼠40只，雌雄各半，按体重随机平均分成4组：模型对照组(生理盐水10ml/kg)，阳性对照组(普萘洛尔8mg/Kg)，本发明药物1#、2#组(剂量均为2mg/Kg/d)。所有样品经灌胃给药，给药体积为10ml/kg，每天1次，连续2天。

于末次给药后1h，腹腔注射12％水合氯醛3ml/kg进行麻醉，记录正常心电图，胸部去毛、消毒，沿左锁骨中线纵行切开皮肤约2cm，在第4或第5肋间钝性分离肌层，打开胸腔，剪开心包，轻压右侧胸廓，挤出心脏，在右侧圆锥与左心耳之间冠状静脉处结扎左冠状动脉后，把心脏放回胸腔，充分排出胸腔内空气，缝合关闭胸腔，呼吸机辅助呼吸，频率20次/分，潮气量5ml。结扎后即刻，1h，24h，48h分别描记一段心电图，并于24h、48h分别口服灌胃药物1#、2#及生理盐水，药量同前。

在冠脉结扎50h后，大鼠再次麻醉，迅速取出心脏，用生理盐水冲洗，除去血污，剔除血管、脂肪等非心肌组织，用吸水纸吸去水分，称全心湿重。沿冠状沟切除心房，留下心室，称重，顺房室沟从心尖到心基部平行将心室肌横切成厚约0.1cm的心肌片4片，用生理盐水冲洗干净，将心肌片放在0.1％的N-BT溶液中，在37℃水浴条件下染色15min，染色后立即用水冲洗去多余的染料。梗死区不着色，非梗死区被N-BT溶液染成蓝色。剪去梗死心肌，称湿重，以梗死区湿重占全心湿重的百分比表示心肌梗死范围，结果见表11。

与模型对照组比较，^**p＜0.01

由表11可见，青葙苷C和青葙苷D能够非常显著的降低心肌缺血引起的组织坏死，对缺血组织有明显的保护作用，效果与普萘洛尔接近。

(三)本发明化合物对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用

1.试验动物与方法：

取雄性SD大鼠共40只，随机分成5组，每组8只，第1组为假手术组，第2组为模型组(注射等体积生理盐水)，第3组为阳性药物尼莫通注射液组(德国拜耳公司生产)，给药剂量2mg/Kg/d，第4、5组为1#、2#组，给药剂量都为2mg/Kg/d。给药时间为缺血1小时后尾静脉注射。

参照Longa EZ报道的线栓模型制备脑缺血再灌注损伤模型(Longa EZ，et al：Reversable middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rat.Stroke，1989，20：84)。缺血2小时再灌注24小时后断头取脑，TTC染色，留取样本进行脑梗塞体积测定(详见  张均田主编：现代药理实验方法学，第1241页，北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998年10月第1版)。

结果见表12。

与模型组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01

由表12可见，青葙苷C和青葙苷D对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤有较强保护作用。

三、本发明化合物对代谢病的防治作用

1、实验动物与方法：

取体重为180～240g的大鼠50只，雌雄各半，随机留取10只作为正常对照组，其余为实验组。实验组大鼠禁食12后，以左下腹腔一次性注射链尿佐菌素(STZ，美国公司)65mg/Kg(溶于PH4.5、0.1mmol/L枸橼酸盐缓冲液)，对照组注射等容积的枸橼酸盐缓冲液，注射48小时后，凡血糖浓度＞13mmol/L的尿糖呈强阳性者，并出现多饮、多食、多尿者为糖尿病模型，糖尿病大鼠再随机分为3组，每组10只，糖尿病模型组、本发明化合物1#、2#治疗组，对照组和模型组喂饲普通饲料，除自由饮水外，每天以蒸馏水灌胃(2ml/d)。本发明化合物1#、2#组，每只大鼠按剂量灌胃4周，期间标准饲料和饮水不受限制，4周之后，以戊巴比妥麻醉，心脏取血检测有关生化指标：①全血血糖测定：尾部采血20μL，用血糖试纸通过血糖仪测定。②测定LPO，采用TBA法。③SOD采用黄嘌呤氧化酶法。

结果见表13、表14、表15。

与模型组比较，^**P＜0.01

表14本发明化合物对实验性糖尿病大鼠全血LPO含量的影响

表15本发明化合物对实验性糖尿病大鼠血浆SOD活性的影响

与模型组比较，^**P＜0.01

由表13、14、15可见，青葙苷C和青葙苷D降血糖作用可能与其具有抗氧化活性成分抑制自由基的产生和加快自由基的清除有关。

四、本发明化合物对痴呆的治疗作用

1.MORRIS水迷宫法

1.1动物和方法

MORRIS水迷宫实验：SD大鼠(由第二军医大学实验动物中心提供)50只，随机分成5组，分别为空白组、模型组、阳性对照组及1#、2#药物组。其中空白组与模型组以0.5％的羧甲基纤维素钠灌胃，阳性对照组灌胃给予Hup A 4mg/kg，本发明药物组按20mg/kg灌胃给药，每天2次，共8天。每天第一次给药后1小时，开始进行MORRIS水迷宫训练。实验前一天让大鼠自由游泳2分钟以适应周围环境，从第一天开始，每天训练4次，每次随机选择一个入水点，将大鼠面向池壁放入水中，观察并记录大鼠寻找并爬上平台的路线图及所需时间(潜伏期)。4次训练大鼠分别从四个不同的入水点入水，如果大鼠在120秒内未找到平台，需将其引至平台。这时潜伏期记为120秒，每次训练间隔60秒，连续7天。第8天末次给药后1小时，空白组大鼠腹腔注射生理盐水1ml/kg，其余各组大鼠腹腔注射氢溴酸东莨菪碱2mg/kg。每只大鼠注射结束后25min由一固定入水点面向池壁被投入水中，观察并记录其寻找平台路线及找到平台的时间(潜伏期)。

避暗实验：SD大鼠50只，按前述分组方法随机分成5组，其中空白对照组与模型组以0.5％的羧甲基纤维素钠灌胃，对照组灌胃给予Hup A 4mg/kg，本发明药物组按20mg/kg灌胃给药，每天2次，共8天。第8天末次给药后1小时开始训练，除空白对照组外，每组大鼠于训练前25min腹腔注射氢溴酸东莨菪碱2.0mg/kg，空白组为生理盐水1.0ml/kg。训练时将大鼠先放入箱内适应3min，然后接通电源，将动物背向洞口置于避暗箱明室，观察动物首次进入暗室的时间(潜伏期)和5min内进入暗室的总次数(犯错次数)。第9天重复避暗实验操作并记录潜伏期及犯错误数作为记忆指标，结果见表16和表17。

表16各组大鼠寻找平台的潜伏期

^*P＜0.05，^**P＜0.01与模型组比较

表17各组大鼠犯错次数及潜伏期比较

与模型组比较，^**P＜0.05，^***P＜0.01

由表16、17可见，青葙苷C和青葙苷D能明显改善痴呆大鼠的学习记忆功能，对痴呆具有一定的预防和治疗作用。

五、本发明化合物的抗抑郁或焦虑活性

1、实验动物与方法

按张均田主编的《现代药理实验方法》(上册)第104页的方法进行。将小鼠(昆明种，雄性，20-23克)放入水深10厘米，水温25±1℃的量筒(20厘米高，14厘米直径)中游泳，使其产生恐惧心理，5分钟后取出，32℃下将毛烘干。24小时内分别给实验动物灌胃给药，再将小鼠放入上述环境中，测定小鼠在6分钟的后4分钟内保持游泳不动的时间，以不动时间的缩短作为判断药物抗抑郁作用的标准。本实验每组小鼠10只。①空白对照组，给予与药物实验组等量的生理盐水；②阳性对照组，给予药物氟西酊，剂量为6mg/Kg；③本发明1#、2#、剂量都为2mg/Kg，各组给药时间均为小鼠毛烘干后的24小时内的相同时间。给药途径分为三次灌胃给药，在最后一次灌胃给药60分钟后进行强迫游泳实验，结果见表18。

表18皂苷类化合物对小鼠强迫游泳实验行为的影响结果

与空白对照组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01

由表18可见，青葙苷C和青葙苷D均能显著减少小鼠强迫游泳不动时间，表明本发明化合物均具有显著的抗抑郁活性，效果接近甚至优于氟西酊。

上述各实验表明，本发明化合物具有防治肝病、心脑血管病、代谢性疾病、痴呆、抑郁或焦虑活性，所以可用于制备防治肝病、心脑血管病、代谢性疾病、痴呆、抑郁或焦虑的药物。

Claims (2)

1.一种青葙皂苷类化合物，其特征在于化学结构式如下；

其中，基团R为L-吡喃鼠李糖基(1→2)-D-吡喃夫糖基或D-吡喃葡萄糖基(1→4)-L-吡喃鼠李糖基-D-吡喃夫糖基。

2.权利要求1所述青葙皂苷类化合物在制备防治肝病、心脑血管病、代谢性疾病、痴呆、抑郁或焦虑药物中的应用。