CN102391346B - 一种齐墩果烷皂苷类化合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及从红花七叶树中提取分离的齐墩果烷皂苷类新化合物红花七叶皂苷A和红花七叶皂苷B及其用途。它们的化学结构通式如下：

Description

一种齐墩果烷皂苷类化合物及其用途

技术领域

本发明涉及医药技术领域，是一种从红花七叶树(AesculuspaviaL.)中提取分离的齐墩果烷皂苷类新化合物红花七叶皂苷A和红花七叶皂苷B及其用途。

背景技术

红花七叶树(Aesculuscarnea)为七叶树科七叶树属的落叶乔木。常用于角膜云翳、虹膜睫状体炎、眩晕、皮肤风热瘙痒的治疗，是民间常用的跌打伤药。已从红花七叶树中提取分离到齐墩果烷皂苷类化合物Bakkenolide-Va、Bakkenolide-V_b，它们具有抗细胞毒性活性(详见：MelekFR,MiyaseT,AbdelKhalikSM,El-GindiMR.NewfurostanolsaponinsfromSmilaxasperaL.andtheirinvitrocytotoxicity.Fitoterapia.2003；63:401.)，但至今未见从红花七叶树中提取分离到齐墩果烷皂苷类化合物红花七叶皂苷A和红花七叶皂苷B的报道。

发明内容

本发明提供一种从红花七叶树的提取物中分离到的新的齐墩果烷皂苷类化合物红花七叶皂苷A和红花七叶皂苷B，它们的化学结构通式如下：

其中，R基团表示＝O或-OH，

当R表示＝O时，为化合物红花七叶皂苷A:；

当R表示-OH时，为化合物红花七叶皂苷B:。

本发明化合物的制备方法如下：

1、制备提取物浸膏

将红花七叶树药材按常规用65～85％乙醇水溶液渗漉提取，将渗漉液减压浓缩至无醇味，按常规依次用石油醚、二氯甲烷萃取，将二氯甲烷萃取液减压浓缩，得提取物浸膏：

2、分离纯化

将上述提取物浸膏按常规经反复硅胶柱层析，用氯仿：甲醇＝30:1～1:1的洗脱液进行梯度洗脱，分别收集30:1；20:1；10:1；和1:1部分的洗脱液，共得到四个部分的洗脱液，取第四部分的洗脱液(洗脱液浓度为1:1)经SephadexLH-20及高效液相分离纯化，高效液相洗脱液为甲醇：水＝35:100，最后用薄层板(G254)检测纯度，展开剂为正丁醇：乙酸乙酯：乙酸＝4:2:0.1,得到化合物1(保留时间为17.2min)和化合物2(保留时间为16.3min)，经结构鉴定，依次命名为红花七叶皂苷A和红花七叶皂苷B。

药理和药效学实验表明，本发明化合物红花七叶皂苷A和B均具有抑制肿瘤生长、增强免疫细胞功能，防治肝病、心脑血管病、糖尿病。这些疾病包括恶性肿瘤、免疫功能低下、脂肪肝、肝损伤、肝纤维化、肝硬化、冠心病、心肌梗塞、心肌缺血、脑缺血、脑梗塞、脑中风、糖尿病、高胰岛素血症、胰岛素抵抗力症、肥胖症、糖尿病不耐受症、高血脂症。因此可用于制备治疗恶性肿瘤、提高机体免疫力、防治肝病、心脑血管病及糖尿病的药物。

本发明化合物红花七叶皂苷A和红花七叶皂苷B制备方法简单，成本低廉。本发明为治疗恶性肿瘤、提高机体免疫力、防治肝病、心脑血管病、代谢性疾病提供了新的药物来源。

具体实施方式

现结合实施例对本发明作详细描述。

实施例1.制备化合物红花七叶皂苷A和红花七叶皂苷B

1.制备提取物浸膏

取红花七叶树药材20kg，按常规用75％乙醇水溶液渗漉提取6次，合并渗漉液，减压浓缩至无醇味，得到的混悬液依次用石油醚、二氯甲烷各萃取3次，分别合并石油醚萃取液和二氯甲烷萃取液，将二氯甲烷萃取液减压浓缩，得提取物浸膏200g；

2.分离纯化

将上述提取物浸膏200g经反复硅胶柱(100目硅胶)层析，用氯仿：甲醇＝30:1～1:1为洗脱液进行梯度洗脱，分别收集浓度为30:1；20:1；10:1；1:1部分的洗脱液，取第四部分的洗脱液(洗脱液浓度为1:1)经SephadexLH-20及高效液相分离纯化，高效液相洗脱液为甲醇：水＝35:100，最后用薄层板(G254)检测纯度，展开剂为正丁醇：乙酸乙酯：乙酸＝4:2:0.1,得到保留时间为17.2min的红花七叶皂苷A31mg和保留时间为16.3min的红花七叶皂苷B43mg。

结构鉴定：

1.红花七叶皂苷A

白色粉末，m.p.：252-253℃，分子式为C₅₅H₉₂O₂₁，HR-FAB-MSm/z:1112.4866[M+Na]⁺(Calcd.forC₅₅H₉₂O₂₁Na,1112.4839)，确定化合物分子量为1087。UV(MeOH)显示化合物无明显紫外吸收。核磁共振数据见表1、表2。

由表1、表2中的H谱与C谱可以推断该化合物为五环三萜皂苷类化合物。

¹H-NMR(C₅D₅N，δ，ppm)中，显示该化合物有8个甲基取代，化学位移分别为1.03、1.07、1.25、1.49、1.68、1.73、1.79和2.09。相对应碳的化学位移分别为23.5、33.1、17.7、27.5、18.3、19.5、18.2和65.3。两个为双重峰：1.73、1.79(d，2×CH3)；5.55(s，1H)推测可能是双键上的氢；5.08、5.95、6.32、6.67推测可能是糖上的端基质子；3.5-4.5的氢可能是糖上的氢信号。从¹³C-NMR谱和DEPT谱中可知该化合物中含有9个季碳、26个-CH、12个-CH₂、8个-CH₃，结合其分子量可确定该化合物的分子式为：C₅₅H₉₂O₂₁。从¹³C-NMR(C₅D₅N，δ，ppm)谱中可以看出，该化合物中有2个羰基(172.3，208.7)；有一组双键(125.3，140.9)；95.4、102.4、102.6、和104.5为糖上的端基碳信号。该化合物用三氟乙酸水解后，衍生得糖腈乙酸酯衍生物，采用GC-MS分析，经与标准糖腈乙酸酯衍生物对照，结构显示红花七叶皂苷A中存在D-葡萄糖糖和L-鼠李糖，组成比例为2:2。

综合以上信息可以推断该化合物为五环三萜皂苷类，其苷元为齐墩果烷型，且连有四个糖。

依据HMQC谱可以对红花七叶皂苷A的碳氢作进一步的归属。

在HMBC谱中，172.3的羰基碳和6.32(H，d)的糖端基氢耦合，仲碳80.8与糖的端基氢6.67(H，s)耦合表明母核3位、28位上连有糖链。碳信号65.1与5.08、61.0与5.95分别耦合，表明化合物一糖链的链接顺序是鼠李糖→葡萄糖→葡萄糖。对比参考文献(ZhangJJ,XuLY.LiShiZhenMedicineandMateriaMedicaResearch2006；17:480.)及化合物的¹³C-NMR和¹H-NMR谱，可以确定化合物中所含糖为2分子β-D-葡萄糖和2分子α-L-鼠李糖。

对比齐墩果酸的¹³C-NMR谱数据，化合物的¹³C-NMR谱和参考文献(ZhangJJ,XuLY.LiShiZhenMedicineandMateriaMedicaResearch2006；17:480.)报道的数据基本一致，故确定化合物的苷元结构为：16、23-羧基-齐墩果酸。

综合以上分析，确定该化合物为一新化合物，命名为红花七叶皂苷A。

2.红花七叶皂苷B

白色粉末，m.p.：249-250℃，分子式为C₅₅H₉₀O₂₁，HR-FAB-MSm/z:1110.3876[M+Na]⁺(Calcd.forC₅₅H₉₀O₂₁Na,1110.3891).确定化合物分子量为1089。UV(MeOH)显示化合物无明显紫外吸收。核磁共振数据见表1、表2。

由表1、2的H谱与C谱可以推断该化合物为五环三萜皂苷类化合物。

该化合物用三氟乙酸水解后，采用GC-MS分析，结构显示该皂苷的糖部位存在β-D-葡萄糖和α-L-鼠李糖。

通过与苷A的谱图比较，发现两个皂苷的相应碳的位移相差不多，糖链都一样，只是该皂苷母核少了一个羰基碳。

综合以上分析，确定该化合物为一新化合物，命名为红花七叶皂苷B。

表1红花七叶皂苷A、B的¹H-NMR数据(C₅D₅N，δ，ppm)

表2红花七叶皂苷A、B的¹³C-NMR数据(C₅D₅N，δ，ppm)

Position	1	2	Position	1	2
						1	38.9	38.7	28-O-Glc1-1	95.4	95.5
2	26.3	26.2	2	73.5	73.4
						3	80.8	80.7	3	78.6	78.6
4	43.4	43.5	4	70.5	70.7
						5	47.6	47.7	5	77.8	77.5
6	17.9	17.8	6	69.1	68.9
						7	33.2	33.0	Glc2-1	104.5	104.0
8	40.6	40.3	2	75.2	75.4
						9	46.3	45.1	3	76.3	76.4
10	37.5	37.5	4	78.0	78.1
						11	24.3	24.1	5	76.7	76.4
12	125.3	123.0	6	61.0	61.5
						13	140.9	144.2	Rha1-1	102.4	101.9
14	48.5	42.3	2	72.4	72.2
						15	46.3	36.1	3	72.3	72.3
16	208.7	73.8	4	73.6	73.6
						17	59.7	49.6	5	70.2	70.0
18	47.3	41.4	6	18.2	18.5
						19	46.3	47.0	3-O-Rha-1	102.6	102.3
20	30.9	30.9	2	72.4	72.5
						21	35.2	36.1	3	72.8	72.9
22	27.1	32.3	4	74.2	74.0
						23	63.5	63.6	5	71.0	71.2
24	65.3	66.4	6	19.5	19.5
						25	18.3	18.5
26	17.7	17.6
						27	27.5	27.1
28	172.3	175.9

29	33.1	33.1
						30	23.5	24.7

药理药效试验

一、抗肿瘤活性实验

(一)体外抗肿瘤活性

1细胞培养

人胃癌细胞株(BCG-823)，人膀胱癌细胞株(EJ)，人肝癌细胞株(Hepg2)，人宫颈癌细胞株(Hela)，由中国人民解放军301总医院肿瘤科提供。

将BCG-823、Hela、Hepg2、EJ均培养于含10％小牛血清、青霉素100IU/ml及链霉素100μg/ml的RPMI1640培养基中，每3天换液1次，每5天传代1次。细胞均置于37℃、饱和湿度、体积分数为5％CO₂的培养箱中，取对数生长期细胞用于实验。

2体外抗肿瘤活性筛选

实验分4组，即红花七叶皂苷A、红花七叶皂苷B、顺铂实验组和空白对照组，将红花七叶皂苷A、红花七叶皂苷B和顺铂分别用蒸馏水各配制成浓度为1μmol/L、3μmol/L和5μmol/L溶液，其中，顺铂为阳性对照药。将上述各对数生长期细胞稀释成1×10⁴个/ml，分别按0.1ml/孔接种于96孔培养板，然后分别按分组加入不同浓度的红花七叶皂苷A、红花七叶皂苷B或顺铂(浓度见表3、4),每浓度平行3孔，空白对照组加等体积蒸馏水，置37℃5％CO₂培养箱培养96h，然后离心(1000r/min，20min)，弃上清液，每孔加0.2ml新鲜配制的含0.2mg/mlMTF的无血清培养基，37℃继续培养4h，再离心，倾出血清后，用0.2mlDMSO溶解沉淀，用微型超声震荡器震荡5min混匀，在PerkinElmer1420-012型酶标仪上以波长570nm，参比波长450nm测定光密度D值，重复3次，按下式计算红花七叶皂苷A、红花七叶皂苷B或顺铂对肿瘤细胞生长的抑制率：

肿瘤细胞生长抑制率(％)＝[1-D实验组/D空白对照组]×100％

以红花七叶皂苷A、红花七叶皂苷B或顺铂不同的浓度对数为横坐标，相应的细胞生长抑制率为纵坐标，求出直线回归方程，根据方程计算出半数抑制浓度(IC₅₀)。

3统计学处理两组间均数差异以SPSS11.5forwindows统计软件进行t检验。

4结果红花七叶皂苷A、B或顺铂对不同肿瘤细胞的抑制活性见表3和表4。

表3红花七叶皂苷A、红花七叶皂苷B或顺铂对肿瘤细胞株增殖的抑制作用(n＝3)

表4红花七叶皂苷A、红花七叶皂苷B或顺铂对人肿瘤细胞体外毒性

由表3、表4可见，红花七叶皂苷A或B对4种肿瘤细胞都有显著的抑制作用，抑制效果明显优于阳性对照药顺铂。

(二)对小鼠移植性肿瘤生长的作用

1.试验动物和材料：

顺铂注射液(Cisplatin，DDP)：由云南个旧生物药业有限公司生产；

小鼠肉瘤S₁₈₀，由上海市第六人民医院医学中心提供；

健康昆明种小鼠，18～22g,雄性，由中国人民解放军第二军医大学动物中心提供(下同)。

2.实验方法与结果

按常规将s₁₈₀瘤株复苏，用生理盐水稀释成浓度为1.0×10⁵个/ml细胞悬液；取昆明种小鼠10只，每只小鼠腹腔注射0.5mls₁₈₀细胞悬液，体内传代3次，无菌条件下抽取第3次传代接种后第7天小鼠的腹水，离心后弃去上清液，细胞沉淀用作s₁₈₀瘤源细胞，用生理盐水调至细胞浓度为1×10⁷个/ml备用；

取昆明种小鼠90只，其中80只每只小鼠右腋部皮下接种0.2mls₁₈₀细胞悬液，接种次日将荷瘤小鼠随机分为8组，每组10只，即红花七叶皂苷A和红花七叶皂苷B的低、中、高剂量组，阴性对照组(Ns)和阳性对照组，未接种瘤株的10只昆明种小鼠为正常对照组。除阳性对照组外，其余各组每日灌胃给药1次，红花七叶皂苷A或红花七叶皂苷B低、中、高剂量组给药剂量按体重依次为100mg/kg、200mg/kg、400mg/kg，阴性对照组给予等体积生理盐水，阳性对照组腹腔注射给药，给药剂量按体重为DDP1mg/kg，连续给药10天，正常对照组不给药，也不给予等体积生理盐水。每日观测体重和肿瘤生长情况，末次给药24h后颈椎脱臼处死小鼠，剥取瘤块、胸腺和脾脏并称重，按下列公式计算抑瘤率、胸腺指数和脾指数。肿瘤抑制率(％)＝[阴性对照组平均瘤重(C)-给药组平均瘤重(T)]/阴性对照组平均瘤重(C)×100％。

结果见表5。

表5红花七叶皂苷A、红花七叶皂苷B对小鼠肉瘤s₁₈₀的抑制作用(n＝10)

注：与阴性对照组比较，*p<0.01；与DDP组比较，^△p<0.01

由表5可见，红花七叶皂苷A或红花七叶皂苷B低、中、高剂量组对小鼠肉瘤s₁₈₀的生长均有一定的抑制作用，特别是高剂量组抑瘤效果更为显著。

二、本发明化合物对肝病的防治作用

本发明药效学研究选用了四氯化碳(CCl4)诱导的小鼠急性肝损伤模型、大鼠慢性肝纤维化模型以及高脂饲料诱导的慢性脂肪肝动物模型。前两个模型是经典的筛选保肝及肝纤维化防治药物的模型，第三种模型是被大家公认的与人体高血脂症性脂肪肝机制相似，用于高脂血症脂肪肝研究和调血脂药物开发的经典模型。

(一)对四氯化碳引起的小鼠急性肝损伤的保护作用

1.试验动物和方法：

昆明种小鼠50只，分为5组，每组10只，分别为：正常对照组；模型对照组；阳性对照组，阳性对照药为联苯双酯组，给药剂量为200mg/Kg；红花七叶皂苷A组和红花七叶皂苷B组：口服给药，给药体积为0.2ml/10g，给药剂量均为2mg/Kg，连续给药3天，正常对照组和模型对照组给予等体积生理盐水，除正常对照组外，其余各组第3天给药后1h按体重10ml/kg腹腔注射0.1％四氯化碳，18小时后摘眼球采血，按常规离心取血清，测定天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和碱性磷酸酶(ALP)。

2.实验结果结果见表6。

表6红花七叶皂苷A、B对四氯化碳引起肝损伤的保护作用血液生化指标

与模型对照组比较：*p<0.05，**p<0.01

由表6可见，与正常对照组相比，四氯化碳造模后，小鼠的血清AST、ALT和ALP明显升高，但与模型对照组相比，本发明红花七叶皂苷A组或红花七叶皂苷B组的AST、ALT和ALP值明显低于模型对照组，有非常显著的差异，说明红花七叶皂苷A或红花七叶皂苷B对化学性肝损伤有保护作用。

(二)对脂肪肝的治疗作用

脂肪肝是一种常见病，多发病，常见于肥胖症、酒精性肝病、肝炎、糖尿病及高血脂症等患者。脂肪肝是多种肝毒性损伤的早期表现，可形成脂肪性肝炎和肝纤维化，甚至肝硬化。然而，目前尚缺乏有效防治脂肪肝的药物。经实验，本发明化合物红花七叶皂苷A或B可有效防治脂肪肝。

1.实验动物及方法：

Wister大鼠60只，体重180-230g，随机取10只，为正常对照组，喂食正常饲料；其余50只喂食高脂饲料，60天后，处死其中10只，做肝脏病理切片，确定脂肪肝模型成立后，其余40只随机分为4组，每组10只，1)模型对照组：连续给予高脂饲料；2)非处理组：动物改食普通饲料；3)红花七叶皂苷A组：给药剂量为2mg/Kg/d，连续给药30天，30天中改食普通饲料；4)红花七叶皂苷B组：给药剂量为2mg/Kg/d，连续给药30天，30天中改食普通饲料。

2.观察指标：

a体重：分别在0、30、60、90天时称重；

b血液生化指标：分别在0、60、90天测血清ALT、AST、血清总胆固醇，甘油三酯；

c病理学检查：第90天处死大鼠，按常规取肝脏，做石蜡切片、HE染色，观察脂肪肝及炎症坏死程度。

3.实验结果：

结果见表7、表8、表9。

表7各实验组动物血清中血脂的变化

与模型对照组比较，**P＜0.01

表8各实验组动物血清转氨酶含量的变化

与模型对照组比较，**P＜0.01

表9各实验组动物肝脏脂肪变性的程度(％)

由表7、表8、表9可见，本发明化合物红花七叶皂苷A或B可明显降低血清中的胆固醇及甘油三酯，有效缓解高脂饲料引起的脂肪肝变性，改善因脂肪变性而导致的肝功能损害。

(三)对四氯化碳(CCl₄)诱发的大鼠慢性肝纤维化的治疗作用

1、实验动物及方法：

雄性Wister大鼠100只，随机分为5组，每组20只，分别为正常对照组，模型对照组，阳性对照组，红花七叶皂苷A组(1#)，红花七叶皂苷B组(2#)。除正常对照组外，其余各组动物均每周皮下注射10％的CCl₄(5ml/Kg)2次(间隔3天)，共12周；从开始注射CCl₄起，每天灌胃给药1次，共12周，给药剂量：阳性对照组，联苯双酯160mg/Kg/d；1#为红花七叶皂苷A8mg/Kg/d；2#组为红花七叶皂苷B8mg/Kg/d；正常对照组为等体积的生理盐水。

2、观察指标：

a.给药12周后，按ELSA试剂盒方法测定血清中天冬氨酸氨基转氨酶(AST)、丙氨酸氨基转氨酶(ALT)、血清总蛋白(TP)、微量白蛋白(ALB)的含量；

b.给药12周后，取肝组织，按ELSA试剂盒方法测定羟脯氨酸(HP)、Ⅲ型胶原前肽(PⅢP)、Ⅳ型胶原(CⅣ)的含量；

c.取给药12周后的肝组织，HE染色，作病理组织学检查，计算胶原容积积分(CVF)。结果见表10、表11、表12。

表10本发明化合物对CCl₄₄所致的大鼠慢性肝损伤后肝功能的影响

与模型对照组比较，**P＜0.01

表11本发明化合物对CCl₄所致的大鼠慢性肝损伤后肝纤维化的影响

与模型对照组比较，**P＜0.01

表12本发明化合物对CCl₄所致的大鼠慢性肝损伤后胶原容积积分的影响

与模型对照组比较，**P＜0.01

由表10、11、12可见，本发明化合物对CCl₄所致的大鼠慢性肝纤维化等肝损伤有明显治疗作用。

三、本发明化合物的心脑血管活性

(一)对异丙肾上腺素(ISO)所至大鼠心肌缺血的治疗作用

1、实验动物与方法

健康雌性SD大鼠40只，随机平均分为4组，分别为正常对照组、模型对照组、红花七叶皂苷A组(1#)、红花七叶皂苷B组(2#)。正常对照组和模型对照组分别灌胃等体积生理盐水，药物组分别灌胃红花七叶皂苷A组(1#)、红花七叶皂苷B(2#)，灌胃剂量均为8mg/Kg/d，连续给药三天。模型对照组和药物组分别于第二天和第三天灌胃给药后1h按体重皮下注射ISO1ml/Kg，正常对照组皮下注射等容量的生理盐水，分别记录第三天给受试药物前和第二次给予ISO后30min的心电图，测量J点值，计算给予ISO后各组大鼠J点位移的绝对值。测完心电图以后对大鼠腹主动脉采血，肝素抗凝后离心分离血浆，分光光度法测定血浆中乳酸脱氢酶(LDH)活性单位。各给药组统计结果和模型组比较进行t-检验。LDH计算公式如下：

结果见表13、表14。

表13本发明化合物对ISO所致大鼠心肌缺血J点位移的影响(n＝10)

与模型对照组比较，*p<0.05，**p<0.01,

表14本发明化合物对ISO大鼠LDH活性单位的影响(n＝10)

与模型对照组比较，*p<0.05，**p<0.01,

由表13、14可见，红花七叶皂苷A或红花七叶皂苷B对ISO引起的大鼠心肌缺血有显著的抑制作用，并可减轻缺血心肌的损伤，因此对心肌缺血有明显的保护作用。

(二)本发明化合物对大鼠冠状动脉结扎所致急性心肌缺血的保护作用

1、实验动物与方法

取体重200g左右的健康SD大鼠40只，雌雄各半，随机平均分成4组：模型对照组(生理盐水10ml/kg/d)，阳性对照组(普萘洛尔8mg/Kg/d)，本发明药物组(剂量均为8mg/Kg/d)。所有样品经灌胃给药，给药体积为10ml/kg，每天1次，连续2天。

于末次给药后1h，腹腔注射12％水合氯醛3ml/kg进行麻醉，记录正常心电图，胸部去毛、消毒，沿左锁骨中线纵行切开皮肤约2cm，在第4和第5肋间钝性分离肌层，打开胸腔，剪开心包，轻压右侧胸廓，挤出心脏，在右侧圆锥与左心耳之间冠状静脉处结扎左冠状动脉后，把心脏放回胸腔，充分排出胸腔内空气，缝合关闭胸腔，呼吸机辅助呼吸，频率20次/分，潮气量5ml。于结扎后即刻，1h,24h,48h分别描记一段心电图，并于24h、48h分别灌胃药物1#至6#及生理盐水，给药剂量8mg/Kg/d，阳性对照组灌胃普萘洛尔8mg/Kg/d，模型对照组灌胃等体积生理盐水。

在冠脉结扎50h后，大鼠再次麻醉，迅速取出心脏，用生理盐水冲洗，除去血污，剔除血管、脂肪等非心肌组织，用吸水纸吸去水分，称全心湿重。沿冠状沟切除心房，留下心室，称重，顺房室沟从心尖到心基部平行将心室肌横切成厚约0.1cm的心肌片4片，用生理盐水冲洗干净，将心肌片放在0.1％的N-BT溶液中，在37℃水浴条件下染色15min，染色后立即用水冲洗去多余的染料。梗死区不着色，非梗死区被N-BT溶液染成蓝色。剪去梗死心肌，称湿重，以梗死区湿重占全心湿重的百分比表示心肌梗死范围，结果见表15。

表15本发明化合物对冠状动脉结扎致大鼠急性心肌缺血模型缺血范围的影响(n＝10)

与模型对照组比较，**p<0.01

由表15可见，红花七叶皂苷A或红花七叶皂苷B能够非常显著地降低心肌缺血引起的组织坏死，效果与阳性对照药普萘洛尔接近，说明本发明化合物对心肌缺血组织有明显的保护作用。

(三)本发明化合物对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用

1.试验动物与方法：

取雄性SD大鼠共40只，随机分成5组，每组8只，第1组为假手术组，第2组为模型组(注射等体积生理盐水)，第3组为阳性对照组，阳性药物为尼莫通注射液(德国拜耳公司生产)，给药剂量8mg/Kg/d，第4、5组为红花七叶皂苷A、B组，给药剂量都为8mg/Kg/d。给药时间为脑缺血再灌注损伤模型造模成功1小时后尾静脉注射。

参照LongaEZ报道的线栓模型制备脑缺血再灌注损伤模型(LongaEZ,etal:Reversablemiddlecerebralarteryocclusionwithoutcraniectomyinrat.Stroke,1989,20:84)。缺血2小时再灌注24小时后断头取脑，TTC染色，留取样本进行脑梗塞体积测定(详见张均田主编：现代药理实验方法学，第1241页，北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998年10月第1版)。

结果见表16。

表16本发明化合物对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用

与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01

由表16可见，红花七叶皂苷A或红花七叶皂苷B对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤有较强保护作用。

四、本发明化合物对代谢病的防治作用

1、实验动物与方法：

取体重为180–240g的大鼠90只，雌雄各半，随机留取10只作为正常对照组，其余为实验组。实验组大鼠禁食12后，以左下腹腔一次性注射链尿佐菌素(STZ，美国公司)65mg/Kg(溶于PH4.5、0.1mmol/L枸橼酸盐缓冲液)，正常对照组注射等容积的枸橼酸盐缓冲液，注射48小时后，凡血糖浓度>13mmol/L的尿糖呈强阳性者，并出现多饮、多食、多尿者为糖尿病模型，取患糖尿病的大鼠30只，随机分为3组，糖尿病模型组、红花七叶皂苷A组(1#)和红花七叶皂苷B治疗组(2#)，每组10只。正常对照组和模型对照组喂食普通饲料，除自由饮水外，每天以蒸馏水灌胃(2ml/d)；1#组、2#组分别灌胃红花七叶皂苷A(1#)、红花七叶皂苷B(2#)，每只大鼠灌胃剂量均为8mg/Kg/d，连续灌胃4周，期间标准饲料和饮水不受限制，4周之后，全血血糖测定。方法：尾部静脉采血20μL，用血糖试纸通过血糖仪测定。

结果见表17。

表17本发明化合物对实验性糖尿病血糖的影响

与模型对照组比较，**P<0.01

由表17可见，红花七叶皂苷A或红花七叶皂苷B有明显的降血糖作用。

上述各实验结果表明，本发明化合物红花七叶皂苷A或红花七叶皂苷B均具有抑制肿瘤生长、增强免疫细胞功能，防治肝病、心脑血管病、糖尿病。这些疾病包括恶性肿瘤、免疫功能低下、脂肪肝、肝损伤、肝纤维化、肝硬化、冠心病、心肌梗塞、心肌缺血、脑缺血、脑梗塞、脑中风、糖尿病、高胰岛素血症、胰岛素抵抗力症、肥胖症、糖尿病不耐受症、高血脂症。因此可用于制备治疗恶性肿瘤、提高机体免疫力、防治肝病、心脑血管病及糖尿病的药物。

Claims (2)

1.齐墩果烷皂苷类化合物红花七叶皂苷A和红花七叶皂苷B，它们的化学结构通式如下：

其中，R基团表示＝O或-OH，

当R表示＝O时，为化合物红花七叶皂苷A；

当R表示-OH时，为化合物红花七叶皂苷B。

2.权利要求1所述齐墩果烷皂苷类化合物红花七叶皂苷A或红花七叶皂苷B在制备治疗恶性肿瘤、提高机体免疫力、防治肝病、心脑血管病或糖尿病药物中的应用。