CN105012327B - 甾体皂苷rce-4在制备预防或治疗肿瘤的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从吉祥草中分离制备的甾体皂苷RCE‑4在制备预防或治疗肿瘤的药物中的用途。本发明所分离得到的RCE‑4对正常细胞具有较弱的细胞毒性，而对人肝癌细胞H₂₂和HepG2具有较强的细胞毒性；对H₂₂荷腹水瘤和实体瘤小鼠均具有显著的抗肿瘤作用，而且对液血液常规指标、血液生化指标和组织形态学均没有显著性的副作用；与当前的临床上使用的抗癌药相比，具有效果相当，但毒副作用小的优势。

Description

甾体皂苷RCE-4在制备预防或治疗肿瘤的药物中的用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种具有抗肿瘤活性化合物甾体皂苷RCE-4在制备预防或治疗肿瘤的药物中的用途。

背景技术

吉祥草(Reineckia carnea(Andr.)Kunth.)为百合科铃兰族吉祥草属单种属多年生常绿草本植物，又名观音草、松寿兰、小叶万年青、竹根七、蛇尾七等。其性味甘平，具有润肺止咳、理血、解毒、补肾接骨、祛风除湿的功效，主要用于肺结核、咳嗽咯血、慢性支气管炎、哮喘，风湿性关节炎，外用治跌打损伤、骨折等疾病的治疗，被土家、苗家民间看着是“神圣的草”。据分析其主要化学成分包括：甾体皂苷类、黄酮类、三萜类、脂肪酸类、生物碱、神经酰胺、环醇、烷烃及Ca、Fe、Cu、Zn、Mn、Mg、Na、K等金属元素。是一种很具有开发价值的少数民族的草药资源。

当前恶性肿瘤成为了严重威胁人口健康的重大疾病。当前全球每年恶性肿瘤死亡人数约为700万人，到2030年每年因癌症死亡的人数将可能达到1700万。据世界卫生组织统计，目前全球平均每8个死亡病例中就有1人死于癌症，这比艾滋病、结核病和疟疾导致的死亡人数总和还要高。而且，每年全球还有超过1200万人被确诊患上癌症。其中中国癌症死亡人数占全球24％，且成低龄化趋势。手术、放疗和化疗仍然是临床上肿瘤治疗的主要手段，其中化疗为其重要手段之一，然后其高额的费用和严重的毒副作用，成为了限制其临床应用的瓶颈。近年来，来源于少数民族的许多草药，由于其抗肿瘤疗效确切、毒副作用小、在民间临床用药历史悠久等多方面综合优势，而成为了治疗肿瘤活性先导化合物的宝库。

发明内容

本发明发明人经过广泛深入的研究，从土家、苗家民间草药吉祥草中分离制备得到的甾体皂苷成分：(1β,3β,5β,25S)-螺甾烷-1,3-二醇1-[α-L-鼠李糖-(1→2)-β-D-木吡喃糖苷]，即25(S)-5β-spirostan-1β,3β-diol1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-xylopyranoside(RCE-4)，并且经研究发现该成分对H22和HepG2肝癌细胞及对荷H22瘤昆明小鼠均具有较好的抗肿瘤作用，通过与治疗肝癌的阳性药卡培他滨比较，与其抗肿瘤效果类似，但未见有明显的毒副作用。目前还未见有此化合物的制备分离及治疗肝癌相关的报道。

本发明的一个目的是提供一种从吉祥草中制备分离甾体皂苷RCE-4方法。本发明方法包括吉祥草样品的提取及RCE-4的分离和纯化。

本发明具体地是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种分离制备甾体皂苷RCE-4的方法，包括下面步骤：

a)用溶剂提取吉祥草，过滤，浓缩；

b)将a)步得到的浓缩产物用水溶解，用乙酸乙酯萃取一段时间，优选超声萃取1～4小时；

c)将b)步萃取得到的乙酸乙酯萃取物浓缩，用氯仿-甲醇梯度洗脱分离，收集馏分1-16，将所得的其中馏分15经凝胶色谱分离纯化。

甾体皂苷RCE-4为针状晶体，呈白色。化学名称为：(1β,3β,5β,25S)-螺甾烷-1,3-二醇1-[α-L-鼠李糖-(1→2)-β-D-木吡喃糖苷]，是一种螺旋甾烷醇皂苷，分子式为C38H62O12。溶解之后为无色透明液体。其分子结构如下式所示：

甾体皂苷RCE-4分子结构

在本发明一种具体的实施方案中，用常用溶剂提取吉祥草的根茎。吉祥草优选为洁净、干燥的粉碎形式；提取溶剂可以为水、乙醇或其混合物，优选60～95％乙醇，例如75％乙醇；采用回流提取方式，优选在40～70℃例如65℃条件下常压回流提取；或者过滤采用中药提取领域常用的过滤方法，浓缩可以在40～70℃条件下，通过旋转蒸发进行浓缩。

本发明发明人发现，将提取得到的浓缩物用水溶解后，只有用乙酸乙酯萃取一段时间，最后才能得到目标产物；采用其他溶剂例如石油醚或丁醇萃取将得不到该产物。超声萃取可以缩短萃取时间，例如1～4小时。

将上述萃取得到的乙酸乙酯萃取物浓缩和分离才能得到目标产物。本发明采用氯仿-甲醇梯度洗脱分离，收集馏分1-16，将所得的其中馏分15经凝胶色谱分离纯化后得到目标产物。这里，浓缩可以采用本领域常用的浓缩方法，例如旋转蒸发。梯度洗脱优选恒梯度，不仅操作简便，而且简单快速、高效地分离目标产物。

本发明发明人发现，只有第15个馏分才能分离得到目标产物。吉祥草中的化学成分通过各种柱色谱色谱分离后得到的皂苷成分中仍然含有一些色素成分；采用凝胶色谱法除色素比大孔树脂吸附法和活性炭吸附法更有效。

按照本发明一种具体的实施方案，其中步骤c)的分离条件为下面一种或多种：

l)将上述得到的乙酸乙酯萃取物进行层析分离；

m)氯仿-甲醇洗脱梯度为恒梯度15:1；和

n)凝胶为葡聚糖凝胶，优选羟丙基葡聚糖凝胶。

按照本发明一种具体的实施方案，其中步骤c)中所述的色谱分离纯化后还包括一重结晶步骤，纯化得到更纯的无色针状结晶。

按照本发明一种具体的实施方案，其中步骤b)中用乙酸乙酯萃取之前用石油醚萃取，残余物再用乙酸乙酯萃取。这样可以提高最终产物甾体皂苷RCE-4的产率。

按照本发明一种具体的实施方案，其中步骤a)中所述的溶剂为95％乙醇。

按照本发明一种具体的实施方案，其中步骤a)中还包括回收乙醇的步骤；优选地，过滤提取液后，在大约55℃条件下，回收乙醇。

按照本发明一种更具体的实施方案，

原料预处理：将吉祥草根茎洗净晒干，于40～60℃恒温鼓风箱中干燥至恒重；

吉祥草化学成分的提取：①回流提取：样品切成小片，以60～95％乙醇为溶剂，在40～70℃条件下常压回流提取，提取液过滤后，在40～70℃条件下，用旋转蒸发仪浓缩；②萃取：将浓缩所得的浸膏，用蒸馏水溶解，用乙酸乙酯超声萃取1～4小时；

吉祥草中RCE-4的分离纯化：将萃取得到乙酸乙酯浸膏用氯仿-甲醇梯度洗脱，收集流分，将所得的其中一流份15经Sephadex LH-20洗脱，即得。

本发明分离制备得到的RCE-4在H₂₂和HepG2人肝癌细胞上和荷H₂₂瘤昆明小鼠上进行实验，表明其具有抗肝癌的治疗作用。

本发明还从细胞和动物水平上也证明了RCE-4具有很好的治疗肝癌的作用。

本发明的另一个目的是提供所述的甾体皂苷RCE-4或含有它的药物组合物在制备预防或治疗肿瘤的药物中的用途。

按照本发明一种具体的实施方案，其中所述肿瘤为食道癌、胃癌、结肠癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、子宫颈癌、阴茎癌、膀胱癌、胰腺癌、白血病、淋巴瘤、脑肿瘤、卵巢癌或子宫癌。

按照本发明一种具体的实施方案，其中所述肿瘤为肝癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、子宫颈癌。

按照本发明一种具体的实施方案，其中所述肿瘤为肝癌。

按照本发明一种具体的实施方案，其中所述药物包含自噬抑制剂(优选6-氨基-3-甲基嘌呤3-MA)；任选地还含有其他抗癌药物活性成分和/或载体、稀释剂或赋形剂。

按照本发明一种具体的实施方案，其中所述药物中RCE-4浓度在2～4μM之间，优选4μM。

本发明的有益效果

本发明提供了一种从土家、苗家族民间草药---吉祥草中分离制备RCE-4的方法，研究显示RCE-4对正常细胞如猴肾细胞、犬肾细胞的细胞毒性较小，但是对人肝癌细胞(H₂₂和HepG2)具有很显著的生长抑制作用，并且呈时间依赖性和剂量依赖性；可抑制荷H₂₂腹水瘤小鼠抑制腹水的生成及存活时间；可显著抑制荷H₂₂实体瘤小鼠瘤体积和瘤重，对小鼠的血液常规指标、血液生化指标和免疫系统和组织形态学均没有显著性的副作用，而阳性药卡培他滨尽管其抑瘤效果略强于RCE-4，但是它是以高剂量、强副作用见长，因此，与其相比较具有毒副作用小、疗效较好的优势，值得开发应用。

附图说明

图1为吉祥草提取步骤流程图，

图2为吉祥草萃取步骤图，

图3为吉祥草中RCE-4的分离步骤流程图，

图4吉祥草乙酸乙酯部位分离流程图

图5为吉祥草正丁醇部位分离流程图，

图6吉祥草正丁醇部位WQ-F系列分离流程图，

图7RCE-4对marc-145和MDCK细胞毒活性的影响，

图8RCE-4对H22和HepG2人肝癌细胞细胞毒活性的影响，

图9RCE-4对H22荷腹水瘤小鼠生存时间的影响，

图10RCE-4对H22实体瘤小鼠移植瘤组织形态学的影响(A:模型组，B：RCE-4低剂量组，C：RCE-4中剂量组，D：RCE-4高剂量组，E：卡培他滨组，HE染色)，

图11RCE-4对H22实体瘤小鼠主要脏器组织形态学的影响(A:脑，B：心，C：肝，D：肾，E：肾上腺，F：脾，G：胃，H：十二指肠，I：大肠，J：小肠，HE染色)，

图12RCE-4和3-MA对Caski细胞增殖的影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，这些实施例仅是对本发明的举例说明而已，无论如何不能解释为对本发明范围的限制。

实施例1

吉祥草中一种具有抗肿瘤活性化合物RCE-4，具体通过以下方法制备：

1)吉祥草预处理

吉祥草根茎洗净晒干，取0.005kg保存，剩下的于48℃恒温鼓风箱中干燥至恒重，净重4.0kg。

2)吉祥草回流提取

样品切成小段，以95％乙醇为溶剂，在65℃条件下常压回流提取，提取液过滤后，在55℃条件下，用旋转蒸发仪浓缩，随后在通风橱中挥干至无醇味，得深浸膏，称重得浸膏1.4kg(见图1)。

3)吉祥草浸膏的萃取

加入1升蒸馏水溶解上述2)所得浸膏，依次用萃取剂石油醚、乙酸乙酯、水饱和的正丁醇萃取。每次加入2L萃取剂与浸膏水溶液混匀，超声萃取2小时待两相分层后，利用虹吸法原理将上层的萃取液吸出，在旋转蒸发仪上浓缩并回收萃取液，回收后的溶剂继续用于萃取。合并同一种萃取溶剂的萃取物，于通风橱中挥干溶剂，最后得各浸膏(见图2)。称重得各浸膏量：石油醚部分重130g，乙酸乙酯部分重112g；正丁醇部分重550g。

4)吉祥草中一种具有抗肿瘤活性化合物RCE-4的分离：

将上述3)得到的乙酸乙酯部位浸膏(70克)进行硅胶柱层析，采用氯仿-甲醇＝15：1梯度洗脱，共得十六个组分，其中5、10、15主斑点明显，5号和10号组分经甲醇重结晶得白色针状结晶WQ-E-4(β-胡萝卜苷)和WQ-E(RCE-2)。然后将15号组分经Sephadex LH-20(甲醇装柱或者氯仿甲醇1:1均可)得白色针状结晶，经鉴定为WQ-E-5(RCE-4)。16号组分经氯仿-甲醇硅胶柱层析，馏分一经丙酮重结晶的白色针状结晶WQ-E-2；馏分二经Sephadex LH-20(氯甲1:1)得白色针状结晶WQ-E-3。(见图3)

上述的色谱分离后的结晶WQ-E-5(RCE-4)再用乙醇重结晶纯化，得到更纯的白色针状结晶。

根据其理化性质、现代波普学技术鉴定为RCE-4，核磁鉴定，无色针状结晶，分子式：C₃₈H₆₂O₁₂。¹H-NMR(400MHz,C₅D₅N)δ0.85(3H,s,H-18)，1.34(3H,s,H-19)，1.15(3H,s,H-21),1.08(3H,d,J＝6.5Hz,H-27)，1.76(3H,d,J＝6.1Hz,CH₃-Rha),6.63(1H,s),5.11(1H,d,J＝7.3Hz)；¹³C-NMR(100MHz,C₅D₅N)δ:75.9(C-1),27.3(C-2),67.3(C-3),34.2(C-4),31.8(C-5),26.4(C-6),26.4(C-7),35.6(C-8),42.0(C-9),39.4(C-10),21.4(C-11),40.3(C-12),40.7(C-13),56.4(C-14),32.2(C-15),81.3(C-16),62.9(C-17),16.7(C-18),19.4(C-19),42.5(C-20),14.9(C-21),109.7(C-22),26.3(C-23),26.2(C-24),27.3(C-25),65.1(C-26),16.3(C-27),98.1(xyl,C-1),76.9(xyl,C-2),79.2(xyl,C-3),71.6(xyl,C-4),67.4(xyl,C-5),101.9(rha,C-1),72.0(rha,C-2),72.2(rha,C-3),74.5(rha,C-4),69.9(rha,C-5),18.8(rha,C-6)。

化合物WQ-E-5的结构鉴定为:(1β,3β,5β,25S)-螺甾烷-1,3-二醇1-[α-L-鼠李糖-(1→2)-β-D-木吡喃糖苷]。

化合物WQ-E-3的结构鉴定为:(22S)-胆固醇-1β，3β，16β，22-四醇-1-O-β-D-吡喃鼠李糖基-16-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。NMR数据为：

¹³C-NMR(100MHz,C₅D₅N)δ:71.9(C-1),25.6(C-2),66.8(C-3),27.9(C-4),87.6(C-5),31.2(C-6),24.1(C-7),34.2(C-8),43.8(C-9),42.8(C-10),20.9(C-11),39.6(C-12),40.3(C-13),55.8(C-14),26.4(C-15),80.9(C-16),62.1(C-17),15.5(C-18),13.3C-19),42.1(C-20),15.0(C-21),109.7(C-22),25.4(C-23),23.8(C-24),27.1(C-25),64.7(C-26),16.1(C-27),95.6(glu,C-1),74.4(glu,C-2),77.1(glu,C-3),70.0(glu,C-4),76.8(glu,C-5),61.1(glu,C-6)。

化合物WQ-E鉴定为(25S)-螺甾烷-1β，3β,5β,26-四醇-5-O-β-D-葡萄糖苷。无色针状结晶，分子式：C33H54O10,ESI-MS m/z:633[M+Na]+。NMR数据为：

¹H-NMR(500MHz,CD₃OD)δ:1.1(3H,s,H-18),0.80(3H,s,H-19),1.16(3H,d,J＝7.6Hz,H-21),1.06(3H,d,J＝6.5Hz,H-27)，4.95(1H,d,J＝7.8Hz)；¹³C-NMR(125MHz,CD₃OD)δ:71.9(C-1),25.6(C-2),66.8(C-3),27.9(C-4),87.6(C-5),31.2(C-6),24.1(C-7),34.2(C-8),43.8(C-9),42.8(C-10),20.9(C-11),39.6(C-12),40.3(C-13),55.8(C-14),26.4(C-15),80.9(C-16),62.1(C-17),15.5(C-18),13.3C-19),42.1(C-20),15.0(C-21),109.7(C-22),25.4(C-23),23.8(C-24),27.1(C-25),64.7(C-26),16.1(C-27),95.6(glu,C-1),74.4(glu,C-2),77.1(glu,C-3),70.0(glu,C-4),76.8(glu,C-5),61.1(glu,C-6)。

化合物WQ-E-4鉴定为胡萝卜苷，无色针晶(甲醇),mp291～292℃。分子式：C35H60O6,ESI-MS m/z:599[M+Na]+,NMR数据为：¹³C-NMR(100MHz,C₅D₅N)δ:37.8(C-1),30.1(C-2),78.6(C-3),40.0(C-4),141.0(C-5),122.2(C-6),32.5(C-7),32.1(C-8),50.8(C-9),37.1(C-10),21.5(C-11),28.8(C-12),42.8(C-13),56.9(C-14),24.6(C-15),40.5(C-16),56.6(C-17),12.2(C-18),19.5(C-19),36.6(C-20),19.6(C-21),34.4(C-22),26.5(C-23),46.3(C-24),29.6(C-25),20.5(C-26),19.7(C-27),23.5(C-28),12.3(C-29),101.1(glu,C-1),74.5(glu,C-2),78.1(glu,C-3),71.5(glu,C-4),78.8(glu,C-5),62.7(glu,C-6)。

化合物WQ-E-2的结构可鉴定为：(25S，5β)-螺甾烷-1β，3β，14β-三醇-1-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-β-D-吡喃木糖苷，白色针状结晶，分子式C38H62O13,正离子ESI-MS显示准分子离子峰ESI-MS m/z:749.5[M+Na]+。NMR数据为：¹³C-NMR(100MHz,C₅D₅N)δ:76.1(C-1),27.1(C-2),67.3(C-3),34.1(C-4),31.8(C-5),26.4(C-6),20.8(C-7),39.6(C-8),34.5(C-9),39.6(C-10),21.4(C-11),32.6(C-12),45.1(C-13),87.3(C-14),39.9(C-15),82.0(C-16),59.7(C-17),20.5(C-18),19.3(C-19),42.5(C-20),15.2(C-21),110.1(C-22),26.5(C-23),26.2(C-24),27.6(C-25),65.1(C-26),16.3(C-27),98.1(xyl,C-1),76.9(xyl,C-2),79.2(xyl,C-3),71.6(xyl,C-4),67.4(xyl,C-5),101.9(rha,C-1),72.0(rha,C-2),72.2(rha,C-3),74.5(rha,C-4),69.9(rha,C-5),18.8(rha,C-6)。

经核磁鉴定，WQ-E-5、WQ-E-4(β-胡萝卜苷)、WQ-E(RCE-2)、WQ-E-2和WQ-E-3结构分别为：

本发明发明人采用HPLC法对吉祥草中活性化合物RCE-4进行了含量测定，并比较采用了95％乙醇、乙酸乙酯、氯仿：甲醇(15:1)混合溶剂作提取溶剂时得提取率，结果发现采用氯仿：甲醇(15:1)混合溶剂作提取溶剂时，RCE-4的提取率最高，高达0.1229％，该方法简便准确，重现性好，可以作为吉祥草中RCE-4的含量测定方法并为吉祥草药材质量标准建立奠定基础。

表从吉祥草根茎中分离得到的化合物

正丁醇部分(550g)，经大孔吸附树脂，水：乙醇系统洗脱，除去大部分色素，再经过反向C18硅胶柱层析(乙腈：水梯度洗脱)、硅胶柱层析(氯仿：甲醇梯度洗脱)、制备型高效液相分离纯化等手段，共分离出17个化合物，分别为化合物WQ-5、WQ-6、WQ-7、WQ-2、WQ-4、WQ-10、WQ-13、WQ-14、WQ-1、WQ-15、WQ-F-9、WQ-F-4、WQ-F-5、WQ-F-6、WQ-F-12、WQ-F-13、WQ-F-15。具体分离流程见图5和图6。

对比实施例1

采用与上述实施例1相同的方法，区别仅仅在于第3)步吉祥草浸膏的萃取过程中，加入1升蒸馏水溶解上述2)所得浸膏后，分别用萃取剂石油醚和水饱和的正丁醇萃取。结果，萃取液中没有得到最终产物甾体皂苷RCE-4。

吉祥草化学成分复杂，目前认为其主要药效成分是甾体皂苷，人们在研究中发现，甾体皂苷的苷元不同，或是糖链不同，其药理活性存在较大差异。本发明发明人对从吉祥草中分离得到的化合物RCE-4进行了体外抗肿瘤活性研究，发现其对Caski、SH-SY5Y、HepG2、A549等肿瘤细胞均有明显的抑制作用，其中对Caski细胞(人宫颈癌细胞)具有最好的细胞毒性，IC50值为3.71μM。

实验例1

下面结合具体的实验例，具体说明本发明实施例1得到的RCE-4在细胞水平上的抗肝癌应用。

RCE-4对正常细胞猴肾细胞(marc-145)、犬肾细胞(MDCK)和人肝癌细胞H₂₂和HepG2的细胞毒活性的影响。

试验方法

1)细胞培养

marc-145和MDCK细胞用DMEM-F12培养基培养，于CO₂孵箱中5％CO₂、37℃以及饱和湿度下培养。细胞单层长到80％时，用含EDTA的0.25％的胰蛋白酶消化，传代。

H₂₂和HepG2人肝癌细胞用RPMI-1640培养液培养，于CO₂孵箱中5％CO2、37℃以及饱和湿度下培养。细胞单层长到80％时，用0.25％的胰蛋白酶消化，传代。

2)3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)比色法试验

收集对数生长期的正常细胞和肿瘤细胞，调整细胞悬液浓度并以1×10⁵的细胞浓度种96孔板，每孔加入100μL，四周用PBS封，于5％CO₂，37℃孵育12h，将甾体皂苷RCE-4的储备液用培养基稀释配制成6个浓度梯度(50、25、12.5、6.25、3.13、1.62μM)，每孔加入浓度梯度的药物100μL，体系变为200μl，每个浓度设置6个复孔，并设置空白对照(含细胞的培养液+MTT+二甲基亚砜(DMSO))、阳性药物孔(含细胞的培养液+25μg/ml丝裂霉素+MTT+DMSO)及调零孔(培养液+MTT+DMSO)。5％CO₂，37℃培养48小时，然后加入MTT(5mg/mL)20μL，继续培养4小时后终止培养，取出96孔板，小心移走孔内液体，每孔加入150μL DMSO，震荡摇匀10分钟，使结晶物充分溶解。酶标仪490nm波长下测其OD值，并计算抑制率。

计算公式：抑制率＝(1-药物孔OD/空白孔OD)×100％。

3)统计分析

所有实验结果用均数±标准差()表示，采用SPSS 13.0统计软件对实验数据进行处理，分析方法采用方差分析，以P﹤0.05为显著性差异。

RCE-4对正常细胞marc-145和MDCK细胞毒活性的影响

由图7MTT试验表明，RCE-4对marc-145和MDCK细胞显示较小的细胞毒性，其IC₅₀分别为26.29和19.49μM。实验结果表明，RCE-4对正常细胞具有较弱的细胞毒性。

RCE-4对H₂₂和HepG2人肝癌细胞细胞毒活性的影响

由图8试验结果可知，RCE-4对人肝癌细胞H₂₂和HepG2均有很明显的抑制作用，其作用24小时的IC₅₀分别为3.721μM，12.034μM。

实验例2

下面结合具体的实施例，具体说明本发明实施例1的RCE-4在动物水平上的抗肝癌应用。

RCE-4对荷H₂₂瘤小鼠的抗肿瘤活性的影响。

RCE-4对荷H₂₂腹水瘤小鼠的抗肿瘤试验

试验方法

1)实验材料

雌性昆明小白鼠(18～22g)，购自三峡大学实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK(鄂)2011-0012。H22肿瘤细胞株，购自武汉大学中国典型培养物保藏中心，由三峡大学天然产物研究与利用湖北省重点实验室传代保藏。

2)细胞培养和动物模型的建立

H₂₂细胞培养于含10％新生小牛血清、10⁵U/L青霉素、100mg/L链霉素的RPMI-1640培养基中,置于37℃、CO₂体积分数为5％的饱和湿度条件下培养，待H₂₂细胞贴壁生长，取对数生长期细胞，制备单细胞悬液，调整密度至5×10⁶个/mL，腹腔注射0.2mL/只。将接种7天后生长良好的H₂₂小鼠，颈椎脱臼处死，腹部皮肤消毒后，剥开腹部皮肤，用无菌注射器抽取乳白色的浓稠腹水，放入无菌容器内，置冰块中保存。另取少量腹水，置于加有肝素的试管中，用于观察细胞形态及细胞计数，肿瘤细胞数为97％以上方可使用。腹水用无菌生理盐水1:4稀释，使肿瘤细胞数为5×10⁶个/mL。肿瘤细胞混悬液应为乳白色半透明状态，若有血性腹水不可使用，每只小鼠腹部注射0.2mL腹水。

3)分组及给药

雌性昆明小白鼠(18～22g)30只，小鼠腹腔接种H₂₂肿瘤细胞24h后随机分为组，每组6只。分别为模型组，RCE-4组(50、100、200mg/kg)，空白对照组灌胃给予相应体积的0.5％羧甲基纤维素钠溶液，每天1次，连续2周。

4)RCE-4对荷H₂₂腹水瘤小鼠生命延长率的影响

每组6只小鼠，从接种日开始计算，观察小鼠毛色、活动度，测量各试验组小鼠的腹围并称重；记录各组小鼠的存活时间，绘制生存曲线。腹水型肿瘤疗效以生命延长率[生命延长率(％)＝[(给药组平均生存天数-模型组平均生存天数)/模型组平均生存天数]表示。

5)统计分析

所有实验结果用均数±标准差()表示，所有数据分析在SPSS13.0统计软件包上进行，以单因素方差分析进行多组间差异的比较，以Dunnett-t检验比较两组间均数的差异；P<0.05认为差异有统计学差异。

试验结果

1)RCE-4对荷H₂₂腹水瘤小鼠一般情况的影响

3组给RCE-4试验小鼠在给药期间及观察期内无毛色发暗、脱毛等改变，且大小便正常。

2)RCE-4对H₂₂荷腹水瘤小鼠体重的影响

表1 RCE-4对H₂₂荷腹水瘤小鼠体重的影响(n＝6)

与同时间点的正常组比较^#P＜0.05，^##P＜0.01；与同时间点的模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01。

由表1可见，模型组的体质量均明显增加，与正常组比较具有显著性差异(P＜0.01)；用RCE-4(50、100、200mg/kg)治疗后，对其体质量无显著影响，与模型比较无显著性差异(P＞0.05)。

3)RCE-4对H₂₂荷腹水瘤小鼠腹围的影响

表2 RCE-4对H22荷腹水瘤小鼠腹围的影响(n＝6)

与同时间点的正常组比较^#P＜0.05，^##P＜0.01；与同时间点的模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01。

由表2可见，模型组的腹围均明显增加，与正常组比较具有显著性差异(P＜0.01)；用RCE-4(50、100、200mg/kg)治疗后，均对腹围有较好的降低作用，其中RCE-4100和200mg/kg剂量组与模型组比较具有显著性差异(P＜0.05)。

4)RCE-4对H₂₂荷腹水瘤小鼠生存时间的影响

给药第5天时模型组，中剂量组分别死亡一只，其他组未见死亡；给药第6天时模型组死亡1只，其他组未见死亡；给药第7天时各组均未见死亡；给药第8天时模型组组，中剂量组各死亡1只，其他组未见死亡；给药第9天时，RCE-4高剂量组、模型组、中、低剂量组分别死亡1、2、1、3只；给药第10天时，RCE-4高剂量组、模型组、RCE-4中、低剂量组分别死亡2、1、3、3只；给药11天时，RCE-4高剂量组死亡3只(图9)。

试验结论

由RCE-4对H₂₂荷腹水瘤小鼠实验可知，RCE-4可抑制荷H₂₂腹水瘤小鼠抑制腹水的生成及存活时间。

实验例3

RCE-4对荷H₂₂实体瘤小鼠的抗肿瘤试验

试验方法

1)实验材料

雌性昆明小白鼠(18～22g)，购自三峡大学实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK(鄂)2011-0012。H₂₂肿瘤细胞株，购自武汉大学中国典型培养物保藏中心，由三峡大学天然产物研究与利用湖北省重点实验室传代保藏。

2)细胞培养和动物模型的建立

H₂₂细胞培养于含10％新生小牛血清、10⁵U/L青霉素、100mg/L链霉素的RPMI-1640培养基中,置于37℃、CO₂体积分数为5％的饱和湿度条件下培养，待H₂₂细胞贴壁生长，取对数生长期细胞，制备单细胞悬液，调整密度至5×10⁶个/mL，腹腔注射0.2mL/只。将接种7天后生长良好的H₂₂小鼠，颈椎脱臼处死，腹部皮肤消毒后，剥开腹部皮肤，用无菌注射器抽取乳白色的浓稠腹水，放入无菌容器内，置冰块中保存。另取少量腹水，置于加有肝素的试管中，用于观察细胞形态及细胞计数，肿瘤细胞数为97％以上方可使用。腹水用无菌生理盐水1:4稀释，使肿瘤细胞数为5×10⁶个/mL。肿瘤细胞混悬液应为乳白色半透明状态，若有血性腹水不可使用，每只小鼠于右侧后腿背部皮下注射0.2mL腹水，注射局部出现明显皮丘。待肿瘤长出后，每日测量肿瘤体积，7天后所有小鼠均出现大于100mm³的皮下结节，移植瘤模型建立成功。

3)实验分组

接种后约7天将实体瘤制作成功的小鼠随机分为5组：模型组，RCE-4(50、100、200mg/kg)组和阳性药卡培他滨组(755mg/kg)，每组灌胃给予相应的药物，每天1次，连续给药4周，另设未复制实体瘤的6只小鼠为正常组。

4)RCE-4对H₂₂荷实体瘤小鼠一般情况的影响

每天观察实验小鼠的饮食量、饮水量，每天观察小鼠的精神状态、活动力、反应、肿瘤生长情况、大便形态等。

5)RCE-4对H₂₂荷实体瘤小鼠体重的影响

每周测量2次小鼠体重。

6)RCE-4对H₂₂实体瘤小鼠瘤体积的影响

分组后第2天(d1)开始测量各组裸鼠移植瘤的长度(L)和宽度(W)，每3天测量1次，肿瘤体积(V)＝(L×W²)/2，以观测时间(d)作为横轴，瘤体积的均值(mm³)为纵轴绘制移植瘤生长曲线。

7)RCE-4对H₂₂实体瘤小鼠瘤重和抑瘤率的影响

停药后24h将小鼠，小鼠摘眼球取血，然后脱颈法处死，完整剥出瘤组织，观察各组瘤块情况及有无周围组织浸润，常规剖腹观察有无腹水及其它脏器转移，称瘤体重量，计算抑瘤率。抑瘤率＝[1-(治疗组瘤重/对照组瘤重)]×100％。

8)RCE-4对H₂₂实体瘤小鼠肿瘤组织形态学的影响

取瘤后，10％中性福尔马林液固定，石蜡包埋，4μm连续切片，HE染色，光镜下病理组织学观察各组小鼠移植瘤组织的形态学变化。

9)RCE-4对H₂₂实体瘤小鼠血液学指标的影响

停药后24h将小鼠，小鼠摘眼球取血，，用血细胞分析仪检测血液红细胞、白细胞及其分类、血小板，试管法测定凝血时间。

10)RCE-4对H₂₂实体瘤小鼠血液生化指标的影响

每只小鼠鼠剩余全血以3500r/min，离心10min，取血清，用全自动生化分析仪检测血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL)、总蛋白(TP)、血清白蛋白(ALB)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆固醇(CHOL)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、血糖(Glu)含量。

11)RCE-4对H₂₂实体瘤小鼠血液免疫学指标的影响

每只小鼠鼠剩余全血以3500r/min，离心10min，取血清，用免疫透射比浊法测定血液中IgA、IgM的水平。

11)RCE-4对H₂₂实体瘤小鼠组织形态学的影响

取心、肝、脾、肺、肾、脑、肾上腺、胸腺、胃、大肠、小肠、卵巢、子宫等脏器用10％甲醛固定，常规石腊包埋、切片、HE染色、光镜检查，其余实验大鼠于停药2周后做同样的检查。

12)统计分析

所有实验结果用均数±标准差()表示，所有数据分析在SPSS13.0统计软件包上进行，以单因素方差分析进行多组间差异的比较，以Dunnett-t检验比较两组间均数的差异；P<0.05认为差异有统计学差异。

试验结果

1)RCE-4对H₂₂荷实体瘤小鼠一般情况的影响

H₂₂细胞接种后第3天起，KM小鼠右侧后腿背部出现黄豆大小的移植瘤，25只小鼠20成瘤，用药前各组间平均肿瘤体积大小无显著性差异(P＞0.05)。小鼠成瘤及给药后，模型组，RCE-4(50、100、200mg/kg)和阳性药卡培他滨(755mg/kg)的进食量、饮水、大小便均正常，精神状态良好，活动正常，反应敏捷，皮肤颜色如常，移植瘤组织未见破溃。

2)RCE-4对H22荷实体瘤小鼠体重的影响

由表3可见，在治疗期间，模型组的体质量均明显增加，与正常组比较具有显著性差异(P＜0.05)；用RCE-4(50、100、200mg/kg)和卡培他滨组治疗后，从第11天开始，各给药组的体重出现不同程度的降低，与模型比较具有显著性差异(P＜0.05&P＜0.01)。

表3 RCE-4对H₂₂实体瘤小鼠体质量的影响(n＝4-5)

续表3

与同时间点的正常组比较^#P＜0.05，^##P＜0.01；与同时间点的模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01。

3)RCE-4对H₂₂实体瘤小鼠瘤体积的影响

模型组小鼠接种H₂₂肝癌细胞株后，瘤体生长迅速，用RCE-4(50、100、200mg/kg)和卡培他滨治疗后，肿瘤体积虽然继续增大，但生长速度明显变缓，从治疗后第15天开始，与模型组组比较，具有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)，而且随着治疗时间的延长，其疗效愈加明显(见表4)。

表4 RCE-4对H₂₂实体瘤小鼠瘤体积的影响(n＝4-5)

续表4

与同时间点的模型组比较*P＜0.05,**P＜0.01。

4)RCE-4对H₂₂实体瘤小鼠瘤重和抑瘤率的影响

由表5和可知，模型组瘤体积和瘤重明显增加，用RCE-4(50、100、200mg/kg)和卡培他滨治疗后，其瘤重明显降低，与模型组比较具有显著性差异(P＜0.01)；抑瘤率随剂量的增加而逐渐增高，与模型组比较具有显著性差异(P＜0.01)。

表5 RCE-4对H₂₂实体瘤小鼠瘤重和抑瘤率的影响(n＝4-5)

与模型组比较*P＜0.05,**P＜0.01。

6)RCE-4对H₂₂实体瘤小鼠血液学指标的影响

由表6可知，模型组小鼠血液学指标如：WBC、RBC、HGB、PLT、MON％、NEU、BASO、EOS及EOS％等严重受损，与正常组比较具有显著性差异(P＜0.01)；用RCE-4(50、100、200mg/kg)治疗后，血液学指标有一定程度的改善，而卡培他滨对此改善不明显，相反有些指标还有不同程度的恶化。

表6 RCE-4对H₂₂实体瘤小鼠血液学指标的影响(n＝4-5)

续表6

续表6

续表6

续表6

续表6

与正常组比较^#P＜0.05，^##P＜0.01；与同时间点的模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01。

7)RCE-4对H₂₂实体瘤小鼠血液生化指标的影响

由表7可知，模型组小鼠血液生化指标出现异常升高，与正常组比较具有显著性差异(P＜0.01)；用RCE-4(50、100、200mg/kg)治疗后，血液学指标有一定程度的改善，而卡培他滨对血液生化指标有恶化副作用。

表7 RCE-4对H₂₂实体瘤小鼠血液生化指标的影响(n＝4-5)

续表7

与正常组比较^#P＜0.05，^##P＜0.01；与同时间点的模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01。

8)RCE-4对H₂₂实体瘤小鼠移植瘤组织形态学的影响

如图10所示，空白对照组肿瘤细胞细胞核增大，核呈双个或多个，大小、形态不一，异形性明显，核深染，核仁清晰，染色质增多，核膜增厚；RCE-4治疗组有较多瘤细胞皱缩，胞质密集，核染色质边集，出现均质红染的坏死区域，可见细胞凋亡，而且随RCE-4剂量的增加，瘤组织的坏死区域逐渐增大，凋亡细胞逐渐增多。

9)RCE-4对H₂₂实体瘤小鼠主要脏器组织形态学的影响

病理组织学检测结果表明，RCE-4对H₂₂实体瘤小鼠脑、心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胃、小肠、卵巢、子宫肉眼及镜检均无病理性改变，表明RCE-4无明显的作用(图11)。

实验结论

由RCE-4对H₂₂荷实体瘤小鼠实验可知，RCE-4可抑制荷H₂₂实体瘤小鼠瘤体积和瘤重，对小鼠的血液常规指标、血液生化指标和组织形态学均没有显著性的副作用，而阳性药卡培他滨尽管抑瘤效果略强于RCE-4，但是它是以高剂量、强副作用见长。因此，与其相比，本发明RCE-4有较好的优势。

实验例4

MTT法检测自噬抑制之后RCE-4对Caski细胞增殖的影响

单独使用RCE-4以及RCE-4与3-MA共同作用都能显著抑制Caski细胞的增殖，并在确定的作用时间内呈现一定的量效关系。单独使用3-MA处理细胞，与空白组比较没有显著性差异；当RCE-4浓度高于6μM时，3-MA的存在对细胞抑制率没有影响，抑制率都能达到95％以上；当RCE-4浓度在2～4μM之间时，随着RCE-4浓度的增加，3-MA的存在显著地增强了RCE-4的细胞毒性，抑制率明显高于RCE-4单独作用；3-MA存在下，RCE-4对Caski细胞的IC50由5.1μM减少到2.6μM，变化了接近2倍。结果见图12。

实验结果表明，RCE-4诱导Caski细胞发生了保护性自噬，当自噬被抑制之后，RCE-4的细胞毒活性增强。

综上所述，RCE-4对正常细胞具有较弱的细胞毒性，而对人肝癌细胞H₂₂和HepG2具有较强的细胞毒性；对H₂₂荷腹水瘤和实体瘤小鼠均具有显著的抗肿瘤作用，能有效延长小鼠的存活时间、降低荷腹水瘤小鼠的腹围和实体瘤小鼠的瘤体积、瘤重，而且对液血液常规指标、血液生化指标和组织形态学均没有显著性的副作用。实验结果表明，RCE-4无论是细胞水平还是动物水平均显示出了一定的抗肝癌的作用，与当前的临床上使用的抗癌药相比，具有效果相当，但毒副作用小的优势。

上述实施例和实验例对本发明对本发明做了具体说明。任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.甾体皂苷RCE-4作为唯一活性成分在制备治疗肝癌的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物包含自噬抑制剂。

3.根据权利要求2所述的用途，其中所述自噬抑制剂为6-氨基-3-甲基嘌呤3-MA。

4.根据权利要求2所述的用途，其中所述药物还含有其他抗癌药物活性成分。

5.根据权利要求2所述的用途，其中所述药物还含有载体、稀释剂或赋形剂。

6.根据权利要求2所述的用途，其中所述药物中RCE-4浓度在2～4μM之间。

7.根据权利要求6所述的用途，其中所述药物中RCE-4浓度为4μM。