CN102805829B - 土茯苓提取物的制备方法及其在肿瘤治疗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种土茯苓提取物的制备方法及其在肿瘤治疗中的应用。所述土茯苓提取物的制备方法包括下述步骤：用选自水、甲醇、乙醇的至少一种溶剂对土茯苓原料进行提取，获得土茯苓总提取物的步骤；用石油醚对土茯苓总提取物进行提取，获得土茯苓石油醚部分提取物的步骤；进一步用乙酸乙酯进行提取，获得土茯苓乙酸乙酯部分提取物的步骤；进一步用水饱和正丁醇进行提取，获得土茯苓水饱和正丁醇部分提取物和土茯苓水部分提取物，进一步通过对土茯苓水部分提取物进行醇沉，可以得到水上清部分提取物。

Description

土茯苓提取物的制备方法及其在肿瘤治疗中的应用

技术领域：

本发明涉及一种土茯苓提取物、其制备方法及其应用，特别是涉及土茯苓水部分及水上清部分提取物及其制备方法，以及土茯苓提取物在抗肿瘤药物的制备中的应用。

背景技术：

恶性肿瘤是严重威胁人类生命的常见病和多发病，其死亡率仅次于心血管疾病而列居第二，且发生率有逐年上升的趋势，因此，抗肿瘤药物的研究一直是医学研究的热点。作为肿瘤治疗主要手段的化疗虽然有较好的疗效，但是常引起骨髓抑制、免疫功能低下等副反应，使患者难以坚持治疗，并且化疗药物在治疗过程中出现的耐药性已成为目前临床治疗中的难题之一。因此，有必要寻求疗效好、毒副作用小的治疗方法和药物。

随着分子生物学和分子药理学对肿瘤本质和作用机制方面的阐述，中药天然药物抗肿瘤药物的研究水平也有了显著提高并展示出了广阔的前景。其在抑制、杀伤肿瘤细胞，改善症状与体征、以及减轻放化疗不良反应等方面，都发挥着重要作用。目前广泛用于临床的抗肿瘤药物，如紫杉醇、喜树碱、长春花碱等，都是天然植物的提取物，它们在肿瘤治疗中疗效确切、不良反应小，成为肿瘤治疗的重要药物。例如，紫杉醇(paclitaxel)是1971年由Wani等首先从短叶红豆杉中提取分离出来的，具有良好抗肿瘤活性，目前被广泛用于治疗卵巢癌、乳腺癌、肺癌及与艾滋病(acquiredimmune deficiency syndrome，AIDS)相关的Kaposi’s肉瘤，由于其作用机制独特、抗癌疗效显著，已成为目前全球销售量排名第一的抗肿瘤药物。近年来，对白藜芦醇、鬼臼毒素、人参、青蒿素、风车子抑碱、小檗碱、苦参类生物碱以及天然黄酮类化合物的抗肿瘤作用的研究也日渐升温。可见，中药天然药物正成为抗肿瘤药物研究的热点。由于肿瘤的发生发展是一个涉及到多基因改变的复杂过程，上述的单一化合物虽然取得了一定的抗肿瘤疗效，但其与其它化疗药物一样，存在耐药与毒副作用的问题。而某些具有抗肿瘤作用的天然中药，其抗肿瘤作用可能是由同类物质的不同化合物共同发挥作用取得的，因此，如果能从中抗肿瘤作用的天然中药中获得具有抗肿瘤作用的有效组分，将有可能作为抗肿瘤药物直接用于临床，其组分中的不同化合物可通过对肿瘤细胞的多靶点作用，达到有可能优于单一靶点的临床治疗效果。

土茯苓为百合科植物光叶菝葜Smilax glabra Roxb.的干燥根茎，它分布长江流域以南等地，是一种常用中药材，其味甘淡，性平，入肝、胃经，为清热祛湿，泄浊解毒的常用中药。《本草纲目》中称它“健脾胃，强筋骨，去风湿，利关节，止泄泻，治拘挛骨痛，恶疮痈肿，解汞粉银朱毒。”

对于土茯苓的抗肿瘤作用，非专利文献1报道了土茯苓对黄曲霉毒素B1(AFB1)致大鼠肝癌的作用，进食土茯苓的大鼠肝r-谷氨酰转肽酶(r-GT)灶小于对照组每个灶的平均面积，差别非常显著，表明土茯苓对AFB1致肝癌有一定抑制作用。另外，已知土茯苓在体外试验对子宫颈癌培养株系JTC226有抑制作用，抑制率在90％以上。但土茯苓对N-丁基-N-(4-羟丁基)亚硝胺诱发大鼠的膀胱肿瘤无明显影响(参见非专利文献2)。

另外，对于土茯苓具有的活性化学成分，普遍认为土茯苓化学成分中具有明显药理作用的为皂甙类、黄酮类(参见非专利文献3)。作为抗肿瘤活性成分，非专利文献4中记载了土茯苓总皂苷对体外培养的艾氏腹水癌(EAC)、肉瘤S180和肝癌(H22)细胞均具有一定的细胞毒性，对荷瘤小鼠S180具有一定的抑制作用，但其认为土茯苓总皂甙在体内对EAC和H22小鼠无明显抑瘤作用，临床上土茯苓主要与其他中草药配伍治疗肿瘤。

但是，如上所述，土茯苓总皂甙的抗肿瘤方面的效果并不理想，对于体内抗肿瘤效果，仅在非专利文献1中报道了土茯苓提取物对肝癌有一定抑制作用。关于土茯苓总提取物、尤其是非皂甙、黄酮部分的体内抗肿瘤活性没有任何报道，对于土茯苓提取物单独作为活性成分在抗肿瘤药物中的应用也没有任何记载。

现有技术

非专利文献1：严瑞琪，陈志英，覃国忠，等.当归等三种中药及联苯双酯对黄曲霉素B1致大鼠肝癌作用的影响.癌症，1986；5(2)：141

非专利文献2：杨德安，石炳毅，李炎唐，等.猪芩、土茯苓和硒对膀胱化学致癌抑制作用的实验研究〔J〕.中华医学杂志，1987，67(11)：622.

非专利文献3：土茯苓品质与药理研究进展，沙飞等，中药材第29卷第5期，2006年5月

非专利文献4：土茯苓总皂甙的抗肿瘤作用研究，邱光清等，中药药理与临床2001；17(5)：17

发明内容：

本发明是鉴于上述问题完成的，其提供一种土茯苓提取物、其制备方法及其应用，尤其是土茯苓水部分或水上清部分提取物及其制备方法，以及土茯苓提取物在抗肿瘤药物的制备中的应用；所述土茯苓提取物具有优异的抗肿瘤效果，能够确实地用于抗肿瘤药物的制备。

本发明人在对土茯苓总提取物进行研究时意外地发现，其不仅在体外显出了抗肿瘤作用，在体内也显出了明显的抗肿瘤作用。进一步对活性成分进行研究时发现，利用系统溶剂法得到的乙酸乙酯部分、水部分和水上清部分也显示出了具有抑制肿瘤细胞体内/外增殖的活性，进一步研究发现，水部分抑瘤活性呈现明显的量效关系，并且主要的活性成分集中在土茯苓的水上清部分。由此完成了本发明。具体地说，本发明涉及下述的技术方案。

1、一种土茯苓提取物的制备方法，所述制备方法包括下述步骤：

用选自水、甲醇、乙醇的至少一种溶剂对土茯苓原料进行提取，回收溶剂获得土茯苓总提取物的步骤；用水将所述土茯苓总提取物溶解，用石油醚进行提取，获得土茯苓石油醚部分提取物的步骤；进一步用乙酸乙酯进行提取，获得土茯苓乙酸乙酯部分提取物的步骤；进一步用水饱和正丁醇进行提取，获得土茯苓水饱和正丁醇部分提取物和土茯苓水部分提取物，所述土茯苓提取物至少含有所述土茯苓水部分提取物。

2、如上述1所述的土茯苓提取物的制备方法，其中，进一步包括对土茯苓水部分提取物进行醇沉，获得水上清部分提取物和粗多糖的步骤，所述土茯苓提取物至少含有所述土茯苓水上清部分提取物。

3、一种土茯苓提取物，其是通过上述1或2所述的土茯苓提取物的制备方法得到的土茯苓水部分提取物或土茯苓水上清部分提取物。

4、一种抗肿瘤药物，其中，所述抗肿瘤药物含有上述3所述的土茯苓提取物作为活性成分。

5、如上述4所述的抗肿瘤药物，其中，所述抗肿瘤药物是治疗肝癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌、食管癌、鼻咽癌或肺癌等肿瘤的药物。

6、土茯苓提取物在制备抗肿瘤药物中的应用，其中，所述土茯苓提取物是选自上述3所述的土茯苓提取物。

7、如上述6所述的土茯苓提取物在制备抗肿瘤药物中的应用，其中，所述抗肿瘤药物是治疗肝癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌、食管癌、鼻咽癌或肺癌等肿瘤的药物。

8、一种抗肿瘤药物，其中，所述抗肿瘤药物含有土茯苓提取物作为唯一的活性成分，所述土茯苓提取物是用选自水、甲醇、乙醇的至少一种溶剂对土茯苓原料进行提取，获得的土茯苓总提取物。

9、土茯苓提取物在制备抗肿瘤药物中的应用，其中，所述土茯苓提取物是用选自水、甲醇、乙醇的至少一种溶剂对土茯苓原料进行提取，获得的土茯苓总提取物，并且在所述抗肿瘤药物中，所述土茯苓提取物是唯一的活性成分。

10、如上述9所述的土茯苓提取物在制备抗肿瘤药物中的应用，其中，所述抗肿瘤药物是治疗肝癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌、食管癌、鼻咽癌或肺癌等肿瘤的药物。

根据本发明，明确了土茯苓中的抗肿瘤活性成分的存在部位，通过简单的制备方法就能有效获得具有体内/外抗肿瘤作用的土茯苓提取物，从而能够有效地用于抗肿瘤药物的制备。

附图说明：

图1：土茯苓各部分的分离提取流程图

图2-1～图2-3：土茯苓各部分的抑瘤(H22)活性分析图

图3：土茯苓水部分的抑瘤(H22)活性量效分析图

图4：土茯苓水上清部分和粗多糖的抑瘤(H22)活性分析图

图5-1：土茯苓水上清部分对人源性肿瘤HT-29的抑瘤活性分析图

图5-2：土茯苓水上清部分对人源性肿瘤PG的抑瘤活性分析图

图6-1：溶剂(DMSO)对MCF-7的体外增殖抑制活性分析图

图6-2：土茯苓总提取物对MCF-7的体外增殖抑制活性分析图

图6-3：土茯苓石油醚部分提取物对MCF-7的体外增殖抑制活性分析图

图6-4：土茯苓乙酸乙酯部分提取物对MCF-7的体外增殖抑制活性分析图

图6-5：土茯苓正丁醇部分提取物对MCF-7的体外增殖抑制活性分析图

图6-6：土茯苓水部分提取物对MCF-7的体外增殖抑制活性分析图

图6-7：土茯苓水上清部分提取物对MCF-7的体外增殖抑制活性分析图

图6-8：土茯苓粗多糖部分对MCF-7的体外增殖抑制活性分析图

图6-9：溶剂(DMSO)对BGC-823的体外增殖抑制活性分析图

图6-10：土茯苓总提取物对BGC-823的体外增殖抑制活性分析图

图6-11：土茯苓石油醚部分提取物对BGC-823的体外增殖抑制活性分析图

图6-12：土茯苓乙酸乙酯部分提取物对BGC-823的体外增殖抑制活性分析图

图6-13：土茯苓正丁醇部分提取物对BGC-823的体外增殖抑制活性分析图

图6-14：土茯苓水部分提取物对BGC-823的体外增殖抑制活性分析图

图6-15：土茯苓水上清部分提取物对BGC-823的体外增殖抑制活性分析图

图6-16：土茯苓粗多糖部分对BGC-823的体外增殖抑制活性分析图

图7-1：土茯苓水部分提取物对人乳腺癌细胞系BICR体外增殖抑制活性分析图

图7-2：土茯苓水部分提取物对人结肠癌细胞系HT-29体外增殖抑制活性分析图

图7-3：土茯苓水部分提取物对人胃腺癌细胞系AGS体外增殖抑制活性分析图

图7-4：土茯苓水部分提取物对人食管癌细胞系EC-9706体外增殖抑制活性分析图

图7-5：土茯苓水部分提取物对人肺腺癌细胞系A549体外增殖抑制活性分析图

图7-6：土茯苓水部分提取物对人高转移性巨细胞肺癌细胞系PG体外增殖抑制活性分析图

图7-7：土茯苓水部分提取物对人鼻咽癌细胞系CNE体外增殖抑制活性分析图

图7-8：土茯苓水部分提取物对人宫颈癌细胞系HeLa体外增殖抑制活性分析图

图7-9：土茯苓水部分提取物对人前列腺癌细胞系PC3体外增殖抑制活性分析图

图8-1：土茯苓总提取物抑制体外对肿瘤细胞的克隆形成能力图

图8-2：土茯苓水部分提取物抑制体外对肿瘤细胞的克隆形成能力图

图9-1：土茯苓总提取物抑制体外可诱导肿瘤细胞凋亡的细胞核形态观察图

图9-2：土茯苓水部分提取物抑制体外可诱导肿瘤细胞凋亡的细胞核形态观察图

图10-1：土茯苓总提取物体外可诱导肿瘤细胞凋亡的DNALadder检测图

图10-2：土茯苓水部分抑制体外可诱导肿瘤细胞凋亡的DNALadder检测图

图11-1：土茯苓总提取物诱导细胞凋亡的结果的图

图11-2：土茯苓水部分提取物诱导细胞凋亡的结果的图

具体实施方式：

本发明的土茯苓抗肿瘤活性物质的制备方法包括下述步骤：

用选自水、甲醇、乙醇的至少一种溶剂对土茯苓原料进行提取，回收溶剂获得土茯苓总提取物的步骤；用水将所述土茯苓总提取物溶解，用石油醚进行提取，获得土茯苓石油醚部分提取物的步骤；进一步用乙酸乙酯进行提取，获得土茯苓乙酸乙酯部分提取物的步骤；进一步用水饱和正丁醇进行提取，获得土茯苓水饱和正丁醇部分提取物和土茯苓水部分提取物。

用所述至少一种溶剂对土茯苓原料进行提取时，可以采用现有公知的方法。例如渗漉法、回流提取法等。为了尽可能地提取土茯苓的有效成分，优选通过回流的方法来获得土茯苓总提取物。

所用溶剂优选为乙醇。通过乙醇回流的方式得到土茯苓总提取物时，更优选用较高浓度的乙醇回流提取后，用浓度较低的乙醇对药渣进一步回流提取，并将其合并。

所述较高浓度的乙醇优选为95％的乙醇，浓度较低的乙醇的浓度优选为50％。

本发明的制备方法更优选还包括对水部分提取物进一步进行醇沉的步骤。这样能够得到有效成分富集的土茯苓提取物。

进行醇沉时，优选使醇浓度达到80％以上。

考虑到活性成分纯度，本发明的土茯苓提取物优选至少包含水部分提取物或水上清部分提取物。更优选包含水上清部分提取物，进一步优选是水分部分提取物，最优选是水上清部分提取物。

本发明中土茯苓提取物中的具体抗肿瘤活性成分尚不清楚，但从该活性成分富集在水上清部分可知，其不是现有技术中普遍认为的活性成分-皂甙或黄酮类化合物。

另外，本发明的土茯苓提取物的抗肿瘤的作用机制尚不清楚，根据申请人的实验结果，推测其是通过诱导肿瘤细胞凋亡实现的，具体地说，其可能是通过增加肿瘤细胞中的活性氧、增加细胞内钙离子浓度和改变线粒体膜电位来诱导细胞发生凋亡的。

下面举出实施例对本发明的制备方法进行说明，但本发明的制备方法并不限于此。例如，实施例中采用的是乙醇回流提取的方法，但本领域技术人员显然清楚，采用其他方法(例如渗漉法、浸提法等)也能取得相同的效果。

实施例：

参考例1：

土茯苓饮片(市售)20kg，粉碎，95％乙醇回流提取3次(6倍量(以体积计，下同)、5倍量、5倍量)，每次2hr，过滤；药渣再以50％乙醇回流提取3次(5倍量、5倍量、5倍量)，每次2hr，与95％乙醇提取液合并，减压回收溶剂，得流浸膏2552g(该部分为乙醇总提取物)。

参考例2：

土茯苓饮片(市售)200g，粉碎，取1L蒸馏水浸泡2hr，大火煮沸，同时行文火煎煮2hr，通过充分的挤压药渣，获得全部土茯苓煎剂，进而通过减压回收溶剂，将土茯苓煎剂浓缩为1g土茯苓生药/mL的浓度。

参考例3土茯苓乙酸乙酯部分提取物的制备

将参考例1得到的乙醇总提取物以10升水混悬后，依次用等体积石油醚、乙酸乙酯各萃取4次，回收溶剂，分别获得土茯苓石油醚部分提取物、土茯苓乙酸乙酯部分提取物。

实施例1土茯苓水部分提取物的制备

与参考例3同样进行，其中，用乙酸乙酯提取后用水饱和正丁醇萃取4次，回收溶剂，获得土茯苓水饱和正丁醇部分提取物，剩余水相为土茯苓水部分提取物水溶液。减压回收溶剂，得到土茯苓水部分提取物。

实施例2土茯苓水部分上清提取物的制备

与实施例1同样进行得到土茯苓水部分提取物水溶液，将该土茯苓水部分提取物水溶液取一半量在搅拌下加入95％乙醇，使其含醇量达80％，搅拌，静置，抽滤，所得沉淀依次用无水乙醇、丙酮、无水乙醚洗涤，获得土茯苓粗多糖，干燥，称重。剩余上清液减压回收溶剂，加水溶解，冻干，即为土茯苓水部分上清提取物。

下面通过试验例证明本发明的土茯苓提取物的抗肿瘤活性

下述试验例中，所得土茯苓各活性部分在进行体内荷瘤小鼠肿瘤生长抑制模型试验时采用PBS(磷酸盐缓冲液)为溶解介质，通过超声将各活性部分溶解为悬浊液或真溶液待用，同时使用PBS为该类试验的阴性对照品；在进行体外土茯苓各活性部分对细胞生长状态影响相关试验中土茯苓各活性部分用含二甲基亚砜(DMSO)的PBS溶液溶解(使用时DMSO终浓度不超过0.2％)，储液浓度为1000mg/mL，于-70℃冻存，两周内使用保存于-20℃，同时使用含0.2％DMSO/PBS为该类试验的阴性对照品。

试验例1：对荷瘤(H22)小鼠体内肿瘤生长抑制试验

从北京维通利华实验动物技术有限公司购买的5周龄ICR鼠80只，在前肢皮下接种鼠肝癌H22细胞(卫生部药品生物制品检定所)(2.5×10⁶/100μl/只)。接种后次日，随机分成8组，每组10只。各组分别灌胃给予参考例1得到的土茯苓乙醇总提取物、参考例2得到的土茯苓煎剂、参考例3得到的土茯苓石油醚部分提取物、土茯苓乙酸乙酯部分提取物、实施例1得到的土茯苓水饱和正丁醇部分提取物和土茯苓水部分提取物(相当于生药量1g/1mL/天/只)，并以环磷酰胺(CTX)为阳性对照(80mg/kg，皮下给药一次)，PBS为阴性对照(1mL/天/只)，连续给药7天，每日注意观察小鼠的饮食、自主活动、毛色等，用药结束后处死老鼠，取瘤块称重进行统计分析。结果见图2-1～图2-3。

由图2-2可知，土茯苓总提取物、水部分提取物及乙酸乙酯部分提取物给药组的瘤块重量明显小于溶剂对照组(P值均小于0.01)，并且由图2-3可知，给药组小鼠的饮食和自主活动无明显异常，体重与对照组相比没有明显的降低。该结果表明总提取物、水部分提取物以及乙酸乙酯部分提取物能够抑制ICR小鼠体内小鼠肝癌H22细胞的生长，三种部分提取物对H22细胞的体内抑瘤率分别为47.9％、46.7％和43.1％，并且对小鼠无明显的毒副作用。

另一方面，煎剂对体内肿瘤的生长也具有一定的抑制作用，其抑瘤率为37.5％。由此可见，本申请的土茯苓的部分提取物的抗肿瘤效果优于传统水煎土茯苓提取物的抗肿瘤效果。

试验例2：土茯苓水部分提取物对荷瘤(H22)小鼠体内肿瘤生长抑制的量效分析试验

从北京维通利华实验动物技术有限公司购买的5周龄ICR鼠40只，在前肢皮下接种鼠肝癌H22细胞(卫生部药品生物制品检定所)(2.5×10⁶/100μl/只)。接种后次日，随机分成5组，每组8只。将荷瘤(H22细胞)ICR小鼠分别灌胃给予相当于生药量0.5、1、2g/1mL/天/只的实施例1中得到的土茯苓水部分提取物，并以环磷酰胺(CTX)为阳性对照(80mg/kg，皮下给药一次)，PBS为阴性对照(1mL/天/只)，连续给药7天后，次日处死小鼠，取瘤块称重进行统计分析。结果见图3。

由图3可知，水部分提取物对ICR小鼠体内小鼠肝癌H22细胞的生长抑制作用呈现明显的量效关系，2g/mL/天/只剂量组的抑瘤率可达61.97％(P＜0.01)，从而进一步确证了水部分提取物的体内抗肿瘤作用。

试验例3：土茯苓水上清部分提取物/粗多糖对荷瘤(H22)小鼠体内肿瘤生长抑制试验

从北京维通利华实验动物技术有限公司购买的5周龄ICR鼠28只，在前肢皮下接种鼠肝癌H22细胞(卫生部药品生物制品检定所)(2.5×10⁶/100μl/只)。接种后次日，随机分成4组，每组7只。将荷瘤(H22细胞)ICR小鼠分别灌胃给予相当于生药量1g/1mL/天/只的实施例2中得到的土茯苓水上清部分提取物和粗多糖，并以环磷酰胺(CTX)为阳性对照(80mg/kg，皮下给药一次)，PBS为阴性对照(1mL/天/只)，连续给药7天后，次日处死小鼠，取瘤块称重进行统计分析。结果见图4。

由图4可知，水上清部分提取物对ICR小鼠体内小鼠肝癌H22细胞的生长呈现明显的抑制作用，抑制率为47.40％，而粗多糖的抑制率为33.21％。由此证明了，与粗多糖相比，土茯苓的抗肿瘤活性成分集中在水上清部分提取物中。

试验例4：土茯苓水上清部分抑制裸鼠体内人结肠癌HT-29细胞和人肺癌PG细胞的生长抑制试验

从北京维通利华实验动物技术有限公司购买的8周龄裸鼠30只，分别在前肢皮下接种人结肠癌细胞系HT-29(卫生部药品生物制品检定所)或人高转移性巨细胞肺癌细胞系PG(卫生部药品生物制品检定所)(2.5×10⁶/100μl/只)。接种后次日，每种接种细胞随机分成3组，每组5只。将荷瘤裸鼠分别灌胃给予实施例3中得到的水上清液(相当于生药量1g/1mL/天/只)或溶剂对照PBS(1mL/天/只)，并以CTX(环磷酰胺；80mg/kg，皮下给药一次)为阳性对照。连续给药15天，并注意每日观察小鼠的饮食、自主活动等，给药结束后次日，断颈处死裸鼠，取瘤块称重进行统计学分析。试验结果如图5-1、图5-2所示。

由图5-1、图5-2可知，与溶剂对照组相比，土茯苓水上清部分提取物可以显著抑制裸鼠体内人结肠癌细胞系HT-29和人高转移性巨细胞肺癌细胞系PG的生长，抑瘤率分别可达69.3％和67.95％(P＜0.01)。另外，给药组小鼠的饮食和自主活动无明显异常，两组间小鼠体重亦无明显差异。

试验例5：土茯苓各活性部分体外对肿瘤细胞的生长抑制试验

试验例5-1

采用MTT法对参考例以及实施例中得到的土茯苓各部分提取物对MCF-7和BGC-823细胞株生长能力的影响进行检测，其中，所述MTT法中，将培养的MCF-7(人乳腺癌细胞系(卫生部药品生物制品检定所))和BGC-823细胞(人胃癌细胞系(卫生部药品生物制品检定所))用0.04％胰蛋白酶-EDTA消化，按2×10³细胞/孔接种96孔板，培养24小时后，细胞贴壁后，分别给予参考例1得到的土茯苓乙醇总提取物、参考例3得到的土茯苓石油醚部分提取物、土茯苓乙酸乙酯部分提取物、实施例1得到的土茯苓水饱和正丁醇部分提取物和土茯苓水部分提取物、实施例2得到的土茯苓水上清部分提取物和粗多糖以及溶剂对照(DMSO)进行处理，每个药物设5个浓度(相当于生药量的5、10、15、20、50mg/mL)，每组设3个平行孔。分别于药物作用后的0hr、24hr、48hr、72hr、96hr和120hr，取待测的96孔板进行MTT分析，绘制生长曲线。结果见图6-1～图6-16。

如图6-1～图6-16所示，土茯苓总提取物、土茯苓水部分提取物和土茯苓乙酸乙酯部分提取物对MCF-7和BGC-823细胞有明显的生长抑制作用，呈现明显的时效和量效关系，水部分提取物的作用要略强于乙酸乙酯部分提取物，而溶剂对照(DMSO)、正丁醇部分和石油醚部分对两株细胞的生长能力均未见明显影响。在水部分中，以水上清部分提取物的作用较为显著，于10-15mg/mL时就表现出抑制作用，明显优于粗多糖部分。以上体外试验结果表明，水部分提取物和水上清部分提取物是土茯苓的主要抑瘤活性部位。

试验例5-2

与试验例5-1同样地采用MTT法对实施例1中得到的土茯苓水部分提取物对多种人肿瘤细胞株生长能力的影响进行了检测，其结果见图7-1～图7-9。

如图7-1～图7-9所示，除了以上经过检测的MCF-7和BGC-823细胞外，水部分提取物还对人乳腺癌细胞系BICR(卫生部药品生物制品检定所)、人结肠癌细胞系HT-29(卫生部药品生物制品检定所)、人胃腺癌细胞系AGS(卫生部药品生物制品检定所)、人食管癌细胞系EC-9706(卫生部药品生物制品检定所)、人肺腺癌细胞系A549(卫生部药品生物制品检定所)、人高转移性巨细胞肺癌细胞系PG(卫生部药品生物制品检定所)及人鼻咽癌细胞系CNE(卫生部药品生物制品检定所)都具有较为明显的生长抑制作用。水部分提取物在浓度达到10mg/mL(相当于生药量)时，对BICR和HT-29细胞有明显的生长抑制作用；浓度为20mg/mL(相当于生药量)时，对PG和CNE细胞有明显的生长抑制作用；浓度为50mg/mL(相当于生药量)时，对AGS、EC-9706和A549细胞有明显的生长抑制作用。这表明土茯苓水部分提取物具有较广泛的抑瘤瘤谱。而人宫颈癌细胞系HeLa(卫生部药品生物制品检定所)和人前列腺癌细胞系PC3(卫生部药品生物制品检定所)对土茯苓水部分的敏感性较弱。

试验例6：土茯苓总提取物、水部分提取物体外对肿瘤细胞的克隆形成能力抑制试验

将生长状态良好的细胞消化后吹散成单个，每孔500-600个接种于12孔板中，设3个平行孔，细胞贴壁12-24小时后，加入图8中所示生药量浓度的参考例1得到的土茯苓总提取物、实施例1得到的土茯苓水部分提取物或相应量的溶剂对照(DMSO/PBS)，继续培养7天后，固定细胞并染色，对形成的细胞克隆计数分析。结果如图8-1～图8-2所示。

由图8-1～图8-2可知，土茯苓总提取物和水部分提取物均能抑制MCF-7、HT-29和BGC-823细胞的平板克隆形成能力。

试验例7：土茯苓水部分诱导肿瘤细胞凋亡试验

试验例7-1

用图9-1所示浓度的参考例1得到的土茯苓总提取物、图9-2所示浓度实施例1得到的水部分提取物或溶剂对照(DMSO/PBS)处理MCF-7、HT-29和BGC-823细胞24和48hr后，用DNA特异性的染料Hoechst 33342染细胞核，然后在激光共聚焦显微镜下观察细胞核的形态。结果如图9-1、图9-2所示。

由图9-1、图9-2可知，当细胞给予20mg/mL的土茯苓总提取物及50mg/mL的水部分提取物(相当于生药量的浓度)处理后24hr，即可观察到细胞核凋亡形态的改变，如新月形核、核浓缩、凋亡小体等，表明土茯苓总提取物和水部分提取物可以诱导肿瘤细胞凋亡的发生。

试验例7-2

将培养状态良好的细胞消化后铺于6孔板中，每孔约5×10⁵个细胞，细胞贴壁12-24小时后，分别加入20mg/mL和50mg/mL生药量浓度的参考例1得到的土茯苓总提取物、实施例1得到的水部分提取物或溶剂对照(DMSO/PBS)作用24、48和72hr，然后分别收集细胞，提取基因组DNA，用2％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。试验结果见图10-1～图10-2。

由该图10-1～图10-2可知，该浓度范围下的土茯苓总提取物和水部分提取物作用于MCF-7、HT-29和BGC-823细胞后，其DNA琼脂糖凝胶电泳图谱出现典型的凋亡特点-DNALadder，并呈现剂量和时间依赖关系。

试验例7-3

采用FITC-AnnexinV/PI双染法，用流式细胞仪定量检测了土茯苓诱导细胞凋亡的情况。将参考例1得到的土茯苓总提取物、参考例3得到的乙酸乙酯部分提取物、实施例1得到的水部分提取物或溶剂对照加入处于对数生长期的MCF-7、HT-29和BGC-823细胞中，药物作用24小时后，消化细胞，转移至离心管中，加入PI和FITC-Annexin V，室温避光温育15min，立即用流式细胞仪进行分析。结果见图11-1和图11-2。表明，土茯苓总提取物作用后可以显著增加凋亡细胞的比例(FITC-AnnexinV单染及FITC-AnnexinV和PI双染的细胞)，呈现一定的剂量依赖关系。50mg/mL生药量浓度的水部分提取物作用于上述三株细胞后，与对照组相比，凋亡细胞的比例也有所增加。该结果进一步证实了土茯苓能够诱导细胞发生凋亡。

上述试验结果表明，土茯苓的抗肿瘤活性成分存在与水部分提取物中，与以往认为的活性成分不同。

上述试验例中主要针对土茯苓的水部分提取物的抗肿瘤作用进行了试验，验证了其显著的抗肿瘤效果，证明了土茯苓提取物由于包括确切的抗肿瘤活性物质，能够确实地用于抗肿瘤药物的制备，其不仅可以与其他药物合用，即使单独作为有效成分也能实现抗肿瘤的作用。

产业上的可利用性

根据本发明，确定了土茯苓中抗肿瘤活性成分的存在部位，能够确实地从土茯苓中提取有效的抗肿瘤活性成分，从而能够用于抗肿瘤药物的制备，实现确实有效的抗肿瘤效果。

Claims (2)

1.土茯苓抗肿瘤活性提取物在制备抗肿瘤药物中的应用，其中，所述土茯苓提取物是通过下述制备方法得到的土茯苓水部分提取物或土茯苓水上清部分提取物，该制备方法包括下述步骤：

用选自水、甲醇、乙醇的至少一种溶剂对土茯苓原料进行提取，回收溶剂获得土茯苓总提取物的步骤；用水将所述土茯苓总提取物溶解，用石油醚进行提取，获得土茯苓石油醚部分提取物的步骤；进一步用乙酸乙酯进行提取，获得土茯苓乙酸乙酯部分提取物的步骤；进一步用水饱和正丁醇进行提取，获得土茯苓水饱和正丁醇部分提取物和土茯苓水部分提取物，对土茯苓水部分提取物进行醇沉，获得水上清部分提取物和粗多糖的步骤。

2.如权利要求1所述的土茯苓提取物在制备抗肿瘤药物中的应用，其中，所述抗肿瘤药物是治疗肝癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌、食管癌、鼻咽癌或肺癌的药物。