CN108853308A - 一种重楼总皂苷-木鳖子药物组合及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开的一种重楼总皂苷‑木鳖子药物组合物及制备方法,包括重楼总皂苷提取物和木鳖子提取物,重楼总皂苷提取物和木鳖子提取物的质量比为5:1~20:1。具体包括以下步骤:步骤1、从重楼饮片中提取重楼总皂苷,得到重楼总皂苷提取物;步骤2、从木鳖子药材中提取木鳖子提取物;步骤3、将重楼总皂苷提取物和木鳖子提取物以5:1~20:1的质量比混合,得到重楼总皂苷‑木鳖子药物组合物。体外可显著抑制人肺癌A549细胞,SK‑MES‑1细胞,NCI‑H460细胞等多种肺癌细胞株的生长,体内也可显著抑制荷瘤小鼠体内肺癌移植瘤生长,并可提高荷瘤小鼠脾脏指数与胸腺指数,且未见明显毒副作用和不良反应。
Description
技术领域
本发明属于药物的制备方法技术领域,涉及一种重楼总皂苷-木鳖子药物组合物,本发明还涉及该重楼总皂苷-木鳖子药物组合物的制备方法。
背景技术
中药重楼为百合科植物云南重楼Paris polyphylla Smith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.和七叶一枝花Paris polyphylla Smith var.chinensis(Franch.)Hara的干燥根茎,收载于2015版《中华人民共和国药典》(一部),主产于四川、云南、陕西等地,其中七叶一枝花亦为秦巴山区特色太白七药之一,为清热解毒类中药。在中医理论指导下,中药重楼已有上千年的药用历史,民间用于疔疮痈肿、肺痨久咳等,目前临床常用于炎症、肿瘤的治疗。现已有楼莲胶囊、金复康口服液等几种复方成药在国内上市销售,同时它还是著名中成药云南白药、宫血宁胶囊等的主要组成药物。现代药理研究发现,重楼中发挥主要药效作用的是其中的甾体皂苷类成分,即重楼皂苷。
木鳖子为葫芦科苦瓜属植物木鳖Momordica cochinchinensis(Lour.)Spreng.的干燥成熟果实,收载于2015版《中华人民共和国药典》(一部),主产于江苏、安徽、江西、湖南、四川、贵州、福建、台湾、广东、广西、云南和西藏。中南半岛和印度半岛也有分布。多生长于海拔450至1100米的山沟或林缘。其干燥种子入药,味苦、微甘,有毒,入肝、脾、胃经,具散结消肿、攻毒疗疮功效。用于疮疡肿毒,乳痈,瘰疬,痔漏,干癣,秃疮。古时多外用,少内服。目前,对其化学成分及药理生物活性已有一些报道,但对于其抗肿瘤作用的研究较少。
肺癌是临床常见的原发性恶性肿瘤之一,近年,我国新发肿瘤人数和死亡人数中,肺癌已排在了第一位,成为我国致死率最高的恶性肿瘤。近年来,人口老龄化社会加速、生存环境变化、雾霾天气现象频发,可以预见,肺癌的发病和致死率在未来还有将呈上升趋势。在中医理论指导下,中药抗肺癌研究近年来进步较快,在抗肺癌方面已显示出独有特色,许多中药单药及其中成分均显示出对肺癌有一定的抑制作用。目前,重楼总皂苷抗肺癌和木鳖子提取物抗肿瘤研究均有报道,但将两者按比例混合作为药物组合物使用,则能达到更好的抗肿瘤效果,目前尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种重楼总皂苷-木鳖子药物组合物,能达到更好的抗肿瘤效果。
本发明的另一目的是提供上述重楼总皂苷-木鳖子药物组合物的制备方法,解决了现有制备方法存在工艺复杂的问题。
本发明所采用的技术方案是,一种重楼总皂苷-木鳖子药物组合物,包括重楼总皂苷提取物和木鳖子提取物,重楼总皂苷提取物和木鳖子提取物的质量比为5:1~20:1。
本发明所采用的另一种技术方案是,一种重楼总皂苷-木鳖子药物组合物的制备方法,具体包括以下步骤:
步骤1、从重楼饮片中提取重楼总皂苷,得到重楼总皂苷提取物;
步骤2、从木鳖子药材中提取木鳖子提取物;
步骤3、将重楼总皂苷提取物和木鳖子提取物以5:1~20:1的质量比混合,得到重楼总皂苷-木鳖子药物组合物。
本发明的特点还在于,
重楼总皂苷提取物中的总皂苷含量为50.8%~60.3%。
步骤1具体步骤如下:
步骤1.1、将重楼饮片粉碎后,先用提取溶剂对其进行回流提取,再对提取液进行过滤,然后将滤液减压浓缩至无醇味,得到浸膏;
步骤1.2、先用乙酸乙酯对浸膏进行萃取,并弃去有机层;再用等体积水饱和的正丁醇再次萃取,弃去水层;然后对有机层液体进行减压浓缩,真空干燥后,即得重楼总皂苷提取物。
步骤1.1的回流提取过程中:提取溶剂是体积浓度为50%~80%的乙醇,提取溶剂与重楼饮片体积比为5:1~20:1;提取次数为2~6次,每次提取时间1~3h。
步骤1.2中,乙酸乙酯与浸膏的体积比为10:1~20:1。
步骤2具体步骤如下:
步骤2.1、将木鳖子药材粉碎后,先用提取溶剂回流对其进行提取,再对提取液进行过滤,然后将滤液减压浓缩,得到浸膏;
步骤2.2、先将浸膏用乙酸乙酯萃取,并弃去有机层,然后对水层进行减压浓缩,真空干燥,即得木鳖子提取物。
步骤2.1的回流提取过程中:提取溶剂为蒸馏水,提取溶剂与木鳖子药材体积比为5:1~20:1,回流提取次数为2~6次,每次提取时间0.5~3h。
步骤2.2中,乙酸乙酯与浸膏的体积比为10:1~20:1。
本发明的有益效果在于:
(1)本发明重楼总皂苷-木鳖子药物组合物,体外可显著抑制人肺癌A549细胞,SK-MES-1细胞,NCI-H460细胞等多种肺癌细胞株的生长,体内也可显著抑制荷瘤小鼠体内肺癌移植瘤生长,并可提高荷瘤小鼠脾脏指数与胸腺指数,且未见明显毒副作用和不良反应;
(2)本发明重楼总皂苷-木鳖子药物组合物,活性高且作用明确,同时可配以临床上接受的赋形剂,制备成口服剂型(片剂,酊剂,可分散性粉剂,颗粒剂,乳剂,糖浆剂,硬胶囊,软胶囊等)或者非口服剂型(注射剂,喷雾剂,贴剂等)用于肿瘤的治疗;
(3)本发明重楼总皂苷-木鳖子药物组合物的制备方法,得到的总皂苷的含量可达重楼总皂苷提取物的50.8%~60.3%,并且工艺简单,易于操作。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明一种重楼总皂苷-木鳖子药物组合物,包括重楼总皂苷提取物和木鳖子提取物,重楼总皂苷提取物和木鳖子提取物的质量比为5:1~20:1。
优选的,重楼总皂苷提取物和木鳖子提取物的质量比为10:1。
一种重楼总皂苷-木鳖子药物组合物的制备方法,具体包括以下步骤:
步骤1、从重楼饮片中提取重楼总皂苷,得到重楼总皂苷提取物;
步骤1.1、将重楼饮片粉碎后,先用提取溶剂对其进行回流提取2~6次,每次提取时间1~3h,再将提取液合并进行过滤,然后将滤液在70~80℃的条件下减压浓缩至无醇味,得到浸膏;
回流提取过程中:提取溶剂是体积浓度为50%~80%的乙醇,提取溶剂与重楼饮片体积比为5:1~20:1。
步骤1.2、先用10~20倍体积比的乙酸乙酯对浸膏进行萃取除去亲脂性成分,并弃去有机层;再用等体积水饱和的正丁醇再次萃取,弃去水层;然后对有机层液体在70~80℃的条件下进行减压浓缩,真空干燥后,即得重楼总皂苷提取物。
其中,重楼总皂苷提取物中的总皂苷含量为50.8%~60.3%,重楼总皂苷提取物收率为9.8%~14.6%。
步骤2、从木鳖子药材中提取木鳖子提取物;
步骤2.1、将木鳖子药材粉碎后,先用提取溶剂回流对其进行提取2~6次,每次提取时间0.5~3h,再将提取液合并进行过滤,然后将滤液在70~80℃的条件下减压浓缩,得到浸膏;
提取溶剂为蒸馏水,提取溶剂与木鳖子药材为5:1~20:1;
步骤2.2、先将浸膏用10~20倍体积比的乙酸乙酯萃取除去亲脂性成分,并弃去有机层,然后对水层在70~80℃的条件下进行减压浓缩,真空干燥,即得木鳖子提取物。
其中木鳖子提取物收率为4.5%~5.8%。
步骤3、将重楼总皂苷提取物和木鳖子提取物以5:1~20:1的质量比混合,得到重楼总皂苷-木鳖子药物组合物。
实施例1
步骤1、从重楼饮片中提取重楼总皂苷,得到重楼总皂苷提取物;
步骤1.1、将300g重楼饮片粉碎后,先用5倍体积比的体积浓度为70%的乙醇对其进行回流提取3次,每次提取时间2h,再将提取液合并进行过滤,然后将滤液在70℃的条件下减压浓缩至无醇味,得到浸膏;
步骤1.2、先用10倍体积比的乙酸乙酯对浸膏进行萃取除去亲脂性成分,并弃去有机层;再用等体积水饱和的正丁醇再次萃取,弃去水层;然后对有机层液体在70℃的条件下进行减压浓缩,真空干燥后,得重楼总皂苷提取物36.4g。
步骤2、从木鳖子药材中提取木鳖子提取物;
步骤2.1、将100g木鳖子药材粉碎后,先用10倍体积蒸馏水对其进行提取3次,每次提取时间30min,再将提取液合并进行过滤,然后将滤液在80℃的条件下减压浓缩,得到浸膏;
步骤2.2、先将浸膏用10倍体积比的乙酸乙酯萃取除去亲脂性成分,并弃去有机层,然后对水层在80℃的条件下进行减压浓缩,真空干燥,即得木鳖子提取物5.22g。
步骤3、将重楼总皂苷提取物和木鳖子提取物以5:1的质量比混合,得到重楼总皂苷-木鳖子药物组合物。
实施例2
步骤1、从重楼饮片中提取重楼总皂苷,得到重楼总皂苷提取物;
步骤1.1、将210g重楼饮片粉碎后,先用8倍体积比的体积浓度为70%的乙醇对其进行回流提取2次,每次提取时间1.5h,再将提取液合并进行过滤,然后将滤液在70℃的条件下减压浓缩至无醇味,得到浸膏;
步骤1.2、先用8倍体积比的乙酸乙酯对浸膏进行萃取除去亲脂性成分,并弃去有机层;再用等体积水饱和的正丁醇再次萃取,弃去水层;然后对有机层液体在70℃的条件下进行减压浓缩,真空干燥后,得重楼总皂苷提取物25.2g。
步骤2、从木鳖子药材中提取木鳖子提取物;
步骤2.1、将70g木鳖子药材粉碎后,先用10倍体积蒸馏水对其进行提取2次,每次提取时间50min,再将提取液合并进行过滤,然后将滤液在80℃的条件下减压浓缩,得到浸膏;
步骤2.2、先将浸膏用10倍体积比的乙酸乙酯萃取除去亲脂性成分,并弃去有机层,然后对水层在80℃的条件下进行减压浓缩,真空干燥,即得木鳖子提取物3.5g。
步骤3、将重楼总皂苷提取物和木鳖子提取物以15:1的质量比混合,得到重楼总皂苷-木鳖子药物组合物。
实施例3
步骤1、从重楼饮片中提取重楼总皂苷,得到重楼总皂苷提取物;
步骤1.1、将270g重楼饮片粉碎后,先用10倍体积比的体积浓度为50%的乙醇对其进行回流提取4次,每次提取时间2h,再将提取液合并进行过滤,然后将滤液在78℃的条件下减压浓缩至无醇味,得到浸膏;
步骤1.2、先用13倍体积比的乙酸乙酯对浸膏进行萃取除去亲脂性成分,并弃去有机层;再用等体积水饱和的正丁醇再次萃取,弃去水层;然后对有机层液体在78℃的条件下进行减压浓缩,真空干燥后,得重楼总皂苷提取物33.5g。
步骤2、从木鳖子药材中提取木鳖子提取物;
步骤2.1、将95g木鳖子药材粉碎后,先用13倍体积蒸馏水对其进行提取4次,每次提取时间1.5h,再将提取液合并进行过滤,然后将滤液在80℃的条件下减压浓缩,得到浸膏;
步骤2.2、先将浸膏用10倍体积比的乙酸乙酯萃取除去亲脂性成分,并弃去有机层,然后对水层在78℃的条件下进行减压浓缩,真空干燥,即得木鳖子提取物4.94g。
步骤3、将重楼总皂苷提取物和木鳖子提取物以20:1的质量比混合,得到重楼总皂苷-木鳖子药物组合物。
实施例4
步骤1、从重楼饮片中提取重楼总皂苷,得到重楼总皂苷提取物;
步骤1.1、将350g重楼饮片粉碎后,先用18倍体积比的体积浓度为60%的乙醇对其进行回流提取4次,每次提取时间2h,再将提取液合并进行过滤,然后将滤液在80℃的条件下减压浓缩至无醇味,得到浸膏;
步骤1.2、先用15倍体积比的乙酸乙酯对浸膏进行萃取除去亲脂性成分,并弃去有机层;再用等体积水饱和的正丁醇再次萃取,弃去水层;然后对有机层液体在80℃的条件下进行减压浓缩,真空干燥后,得重楼总皂苷提取物40.2g。
步骤2、从木鳖子药材中提取木鳖子提取物;
步骤2.1、将120g木鳖子药材粉碎后,先用15倍体积蒸馏水对其进行提取5次,每次提取时间2h,再将提取液合并进行过滤,然后将滤液在80℃的条件下减压浓缩,得到浸膏;
步骤2.2、先将浸膏用15倍体积比的乙酸乙酯萃取除去亲脂性成分,并弃去有机层,然后对水层在80℃的条件下进行减压浓缩,真空干燥,即得木鳖子提取物6.72g。
步骤3、将重楼总皂苷提取物和木鳖子提取物以8:1的质量比混合,得到重楼总皂苷-木鳖子药物组合物。
实施例5
步骤1、从重楼饮片中提取重楼总皂苷,得到重楼总皂苷提取物;
步骤1.1、将250g重楼饮片粉碎后,先用20倍体积比的体积浓度为80%的乙醇对其进行回流提取5次,每次提取时间3h,再将提取液合并进行过滤,然后将滤液在78℃的条件下减压浓缩至无醇味,得到浸膏;
步骤1.2、先用18倍体积比的乙酸乙酯对浸膏进行萃取除去亲脂性成分,并弃去有机层;再用等体积水饱和的正丁醇再次萃取,弃去水层;然后对有机层液体在78℃的条件下进行减压浓缩,真空干燥后,得重楼总皂苷提取物33.8g。
步骤2、从木鳖子药材中提取木鳖子提取物;
步骤2.1、将85g木鳖子药材粉碎后,先用20倍体积蒸馏水对其进行提取3次,每次提取时间2h,再将提取液合并进行过滤,然后将滤液在80℃的条件下减压浓缩,得到浸膏;
步骤2.2、先将浸膏用20倍体积比的乙酸乙酯萃取除去亲脂性成分,并弃去有机层,然后对水层在80℃的条件下进行减压浓缩,真空干燥,即得木鳖子提取物4.17g。
步骤3、将重楼总皂苷提取物和木鳖子提取物以10:1的质量比混合,得到重楼总皂苷-木鳖子药物组合物。
实验1、体外对肺癌细胞的生长抑制作用
1、实验方法
将人肺癌的A549细胞,SK-MES-1细胞,NCI-H460细胞分别生长于含10%胎牛血清,100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的高糖DMEM培养液中,置于含5%CO2,37℃培养箱里培养。
分别取对数生长期的人肺癌的A549细胞、SK-MES-1细胞、NCI-H460细胞配制成5×104个/ml浓度细胞悬液,每孔100μl接种于96孔板中培养24小时,待细胞充分贴壁后,弃去原有培养液,再向每个含有肺癌细胞的孔中分别加入由培养液配制成的不同浓度的重楼总皂苷提取物、不同浓度的木鳖子提取物、不同浓度的重楼总皂苷-木鳖子药物组合物(以下简称药物组合)及不同浓度的二甲基亚砜(DMSO),DMSO浓度小于0.1%,作为阴性对照,每孔100μl。37℃培养24小时,培养结束后每孔加入5mg/ml的MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)10μl继续培养4小时后弃去上清液,每孔加入DMSO 150μl,微量振荡器振荡10分钟以充分溶解结晶物。利用酶标仪在492nm波长下测定各孔吸光值(A值),按以下公式计算药物对肿瘤细胞体外增殖的抑制率。
抑制率(%)=[A492(阴性对照组)-A492(药物样品组)]/[A492(阴性对照组)-A492(空白组)]×100%
2、实验结果
重楼总皂苷提取物、木鳖子提取物、药物组合作用三种不同的肺癌细胞株24小时后,有不同程度的细胞增殖抑制作用,且其生长抑制作用呈剂量依赖性。24小时半数抑制浓度(IC50)如下表所示:
表1不同药物对不同肺癌细胞24h的IC50值
经体外MTT法活性试验证明,重楼总皂苷和木鳖子提取物以10:1质量比组合成的药物组合物可显著抑制人肺癌A549细胞,SK-MES-1细胞,NCI-H460细胞等多种肺癌细胞株的生长,其中对这三种细胞24小时的半数抑制浓度(IC50)值分别为22.56μg/ml,19.74μg/ml,25.54μg/ml。
实验2、小鼠体内抗肿瘤实验
1、实验方法
取C57BL/6J小鼠,将小鼠分笼饲养,适应环境3天后开始实验。取对数生长期的小鼠Lewis肺癌细胞,胰蛋白酶消化,离心,去上清,计数,生理盐水调细胞浓度至2×107个/ml,将细胞接种于小鼠右前肢腋窝皮下,0.1ml/只,并记为接种第1天。每隔2天记录肿瘤长径、短径、及体重。待肿瘤长至100mm3时,将动物随机分为5组,每组6只:(1)溶剂对照组:腹腔注射生理盐水,0.2ml/只;(2)环磷酰胺对照组:按20mg/kg腹腔注射环磷酰胺;(3)重楼总皂苷组:按50mg/kg腹腔注射重楼总皂苷提取物;(4)木鳖子提取物组:按50mg/kg腹腔注射木鳖子提取物;(5)药物组合组:按55mg/kg腹腔注射药物混合物。各组均连续给药10天。停药次日,称重后,麻醉,取血,处死小鼠。完整剥离肿瘤,去除血污、脂肪等非肿瘤组织,称瘤体重量,计算肿瘤生长抑制率。肿瘤生长抑制率(%)=(1-给药组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100%。荷瘤小鼠脏器指数的测定:脱臼处死裸鼠后剥离脾脏,称重后计算脏器指数,脏器指数=脏器重量(mg)/动物体重(g)。
2、实验结果
重楼总皂苷提取物、木鳖子提取物、药物组合以及环磷酰胺各给予荷瘤小鼠10天后,对肿瘤有不同程度的抑制作用,具体数据如下表所示:
表2不同药物对荷瘤小鼠抑瘤率结果
处死小鼠后,解剖取脾、胸腺,计算免疫器官脏器指数,具体见下表:
表3不同药物对荷瘤小鼠免疫器官脏器指数影响
体内荷瘤小鼠试验显示,重楼总皂苷和木鳖子提取物以10:1质量比组合成的药物组合物的抑瘤率也可达到59.14%,可明显抑制荷瘤小鼠皮下移植瘤的生长,并可提高荷瘤小鼠脾脏指数与胸腺指数。小鼠急性毒性实验表明,1.5g/kg灌胃剂量下未见毒副作用和不良反应。
实验1和实验2的结果显示,该药物组合体外可显著抑制人肺癌A549细胞,SK-MES-1细胞,NCI-H460细胞等多种肺癌细胞株的生长,体内也可显著抑制荷瘤小鼠体内肺癌移植瘤生长,并可提高荷瘤小鼠脾脏指数与胸腺指数,且未见明显毒副作用和不良反应。该药物组合物活性高且作用明确,同时可配以临床上接受的赋形剂,制备成口服剂型(片剂,酊剂,可分散性粉剂,颗粒剂,乳剂,糖浆剂,硬胶囊,软胶囊等)或者非口服剂型(注射剂,喷雾剂,贴剂等)用于肿瘤的治疗。
Claims (9)
1.一种重楼总皂苷-木鳖子药物组合物,其特征在于,包括重楼总皂苷提取物和木鳖子提取物,所述重楼总皂苷提取物和木鳖子提取物的质量比为5:1~20:1。
2.如权利要求1所述的一种重楼总皂苷-木鳖子药物组合物的制备方法,其特征在于,具体包括以下步骤:
步骤1、从重楼饮片中提取重楼总皂苷,得到重楼总皂苷提取物;
步骤2、从木鳖子药材中提取木鳖子提取物;
步骤3、将所述重楼总皂苷提取物和木鳖子提取物以5:1~20:1的质量比混合,得到重楼总皂苷-木鳖子药物组合物。
3.如权利要求2所述的一种重楼总皂苷-木鳖子药物组合物的制备方法,其特征在于,所述重楼总皂苷提取物中的总皂苷含量为50.8%~60.3%。
4.如权利要求3所述的一种重楼总皂苷-木鳖子药物组合物的制备方法,其特征在于,步骤1具体步骤如下:
步骤1.1、将重楼饮片粉碎后,先用提取溶剂对其进行回流提取,再对提取液进行过滤,然后将滤液减压浓缩至无醇味,得到浸膏;
步骤1.2、先用乙酸乙酯对所述浸膏进行萃取,并弃去有机层;再用等体积水饱和的正丁醇再次萃取,弃去水层;然后对有机层液体进行减压浓缩,真空干燥后,即得重楼总皂苷提取物。
5.如权利要求4所述的一种重楼总皂苷-木鳖子药物组合物的制备方法,其特征在于,步骤1.1所述的回流提取过程中:提取溶剂是体积浓度为50%~80%的乙醇,提取溶剂与重楼饮片体积比为5:1~20:1;提取次数为2~6次,每次提取时间1~3h。
6.如权利要求4所述的一种重楼总皂苷-木鳖子药物组合物的制备方法,其特征在于,步骤1.2中,乙酸乙酯与浸膏的体积比为10:1~20:1。
7.如权利要求2所述的一种重楼总皂苷-木鳖子药物组合物的制备方法,其特征在于,步骤2具体步骤如下:
步骤2.1、将木鳖子药材粉碎后,先用提取溶剂回流对其进行提取,再对提取液进行过滤,然后将滤液减压浓缩,得到浸膏;
步骤2.2、先将所述浸膏用乙酸乙酯萃取,并弃去有机层,然后对水层进行减压浓缩,真空干燥,即得木鳖子提取物。
8.如权利要求7所述的一种重楼总皂苷-木鳖子药物组合物的制备方法,其特征在于,步骤2.1所述的回流提取过程中:提取溶剂为蒸馏水,提取溶剂与木鳖子药材体积比为5:1~20:1,回流提取次数为2~6次,每次提取时间0.5~3h。
9.如权利要求7所述的一种重楼总皂苷-木鳖子药物组合物的制备方法,其特征在于,步骤2.2中,所述乙酸乙酯与浸膏的体积比为10:1~20:1。
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