CN107522765B

CN107522765B - 一种短葶山麦冬总皂苷及其制备方法和应用

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Publication number: CN107522765B
Application number: CN201710451705.9A
Authority: CN
Inventors: 孙立; 袁胜涛; 于晓文; 余伯阳; 周水平; 李瑞明; 何毅; 颜璐璐; 李菊
Original assignee: Tasly Pharmaceutical Group Co Ltd
Current assignee: Tasly Pharmaceutical Group Co Ltd
Priority date: 2016-06-16
Filing date: 2017-06-15
Publication date: 2021-03-09
Anticipated expiration: 2037-06-15
Also published as: CN107522765A

Abstract

本发明涉及一种短葶山麦冬总皂苷及其制备方法和应用，所述总皂苷中含有以下式Ⅰ到式Ⅳ所示的成分，不含有倍半萜葡萄糖苷类化合物。从组成上来看，本发明明确限定总皂苷中各成分的含量，较现有技术组分结构清楚，且各成分在总皂苷中占比明确。效果上，本发明提供的总皂苷在抗肿瘤(尤其是在胃癌、黑色素瘤、卵巢癌、结肠癌、肺癌方面)及抗肿瘤转移上均具有明确的疗效。

Description

一种短葶山麦冬总皂苷及其制备方法和应用

技术领域：

本发明涉及一种中药药物提取物，其药物制剂和医疗用途，特别涉及一种短葶山麦冬总皂苷、制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术：

短葶山麦冬Liriope muscari(Decne)Bailey为百合科山麦冬属植物，主要分布于广西、福建泉州等地，生于林下、灌丛中。短葶山麦冬块根作为常用中药收载于《中国药典》(一部)“山麦冬”项下，具有养阴润肺，益胃生津的功效，用于肺燥干咳，津伤口渴，肠燥便秘等。药理研究表明，短葶山麦冬药材可以显著延长小鼠存活时间、极显著增加小鼠的脾脏重量、显著增强小鼠的碳粒廓清作用。

短葶山麦冬中主要含有甾体皂苷类、萜类、酰胺生物碱类、脂肪酸类等化合物，其中皂苷类化合物为该植物主要活性成分，本领域技术人员将这些皂苷类化合物称之为短葶山麦冬总皂苷。短葶山麦冬皂苷C为短葶山麦冬总皂苷中的主要活性成分，能明显的增强小鼠耐缺氧能力、增加小鼠免疫器官重量、促进碳粒廓清速率的作用，其作用强度与人参总皂苷近似；并且可对抗由环磷酞胺和₆₀Coγ射线引起的小鼠白细胞数下降；对肉瘤180和艾氏腹水癌等均有较强的抑瘤活性；此外，短葶山麦冬皂苷C具有较强的抗炎免疫药理活性，对实验性肝损伤有保护作用等(余伯阳，殷霞等.短葶山麦冬皂苷C的药理活性研究[J].中国药科大学学报，1994，25(5)：286-288；徐强，王蓉等.DT-13对迟发型变态反应及炎症反应的影响[J].中国药科大学学报，1993，24(2)：98-101；Feihua Wu，Jingsong Cao，etal.Ruscogenin glycoside(Lm-3)isolated from Liriope muscari improves liverinjhury by dysfunctioning liver-infiltration lymphocytes[J].Journal ofPharmacy and pharmacology，2001，53：681-688；Jin Tao，Hongyi Wang，et al.Thesaponin monomer of dwarf lilyturf tuber，DT-13，reduces L-type calcium currentsduring hypoxia in adult rat ventricular myocytes[J].Life Sciences，2005，77：3021-3030)。

然而，短葶山麦冬皂苷C的出率低，制备成本高，应用到医药领域的市场直接导致患者的治疗成本大幅增加，因此降低应用成本是药品进入市场流通的必然。但是最可行的降低成本的有效路径就是不提纯单体，将其改为提取有效部位是业内公知的并且通用的技术手段。有效部位，主要指的是总皂苷相对于单体皂苷出率高，制备成本低，适合临床使用，并能有效降低治疗成本，患者顺应性也很好。但是医药用途的有效部位并非简单的有效成分等的混合，而是必须针对特定的目的(治疗效果)经过特殊工艺手段去芜存菁的、精制后的混合物，这是需要大量的工作以及娴熟的技艺才能胜任的。

因此，本领域亟需发明一种可以分离出包括短葶山麦冬皂苷C单体在内的总皂苷及其制备提纯方法，目的是可以得到具有确实成分的、治疗效果明确的短葶山麦冬中总皂苷，使得到的总皂苷可以直接用于医药领域的治疗目的明确的各种制剂，明确规范该植物提取物的医学用途，降低含有短葶山麦冬总皂苷的产品的副作用以及降低其医药用途风险。

短葶山麦冬皂苷C以及相关提取物的制备方法参考CN102085293A(申请号为201110007853.4，该专利是CN101926921A(申请号为CN200910142488.0)的改进发明，但专利中没有提及短葶山麦冬总皂苷的概念和制备方法，也没有公开抗肿瘤作用。

发明内容：

本发明一方面提供了一种短葶山麦冬总皂苷。

本发明第二方面提供了上述短葶山麦冬总皂苷的制备方法。

本发明第三方面提供了上述短葶山麦冬总皂苷的应用。

本发明所述的短葶山麦冬总皂苷，其皂苷含量为50％以上，不含有倍半萜葡萄糖苷类化合物。

本发明所述的短葶山麦冬总皂苷，所述总皂苷中含有如表1所示的式Ⅰ到式Ⅳ所示的成分，不含有倍半萜葡萄糖苷类化合物：

表1

编号	分子式	分子量	母核	具体糖基连接(R取代基)
					P1	C<sub>44</sub>H<sub>70</sub>O<sub>17</sub>	870	IV	[α-L-rha(1→2)]-[β-D-xyl(1→3)]-β-D-glu
P2	C<sub>49</sub>H<sub>78</sub>O<sub>21</sub>	1002	IV	[β-D-xyl(1→2)]-[β-D-xyl(1→4)-α-L-rha(1→3)]-β-D-glu
					P4	C<sub>43</sub>H<sub>68</sub>O<sub>17</sub>	856	I	[β-D-glu(1→2)][β-D-xyl(1→3)]-β-D-xyl
P10	C<sub>44</sub>H<sub>70</sub>O<sub>17</sub>	870	II	[β-D-glul(1→2)][β-D-xyl(1→3)]-β-D-fuc
					P11	C<sub>44</sub>H<sub>70</sub>O<sub>17</sub>	870	I	[β-D-glul(1→2)][β-D-xyl(1→3)]-β-D-fuc
P14	C<sub>49</sub>H<sub>78</sub>O<sub>20</sub>	986	III	[β-D-xyl(1→2)]-[β-D-xyl(1→4)-α-L-rha(1→3)]-β-D-glu
					P15	C<sub>44</sub>H<sub>70</sub>O<sub>16</sub>	854	I	[α-L–rha(1→2)][[α-L–xyl(1→3)]-β-D-fuc
P16	C<sub>44</sub>H<sub>70</sub>O<sub>16</sub>	854	I	[β-D-fuc(1→2)][[β-D-xyl(1→4)]-β-D-fuc

其中，P10和P11是短葶山麦冬皂苷C的两个构型，下面用短葶山麦冬皂苷C代替P10和P11 的总和。

具体的，所述总皂苷中含有以下重量百分比的皂苷成分：P1 1-4％、P2 1-8％、P40.2-1％、短葶山麦冬皂苷C 35-70％、P14 0.2-1％、P15 0.2-0.8％、P16 0.4-0.8％，皂苷的总含量不少于50％，不含有倍半萜葡萄糖苷类化合物。

优选地，所述总皂苷中含有以下重量百分比的成分：P1 1.3-4％、P2 1.5-8％、P40.2-1％、短葶山麦冬皂苷C 35-70％、P14 0.3-1％、P15 0.4-0.8％、P16 0.5-0.8％。

进一步优选，所述短葶山麦冬总皂苷含有以下重量百分比的成分：P1 2-4％、P25-8％、P4 0.3-0.8％、短葶山麦冬皂苷C 40-65％、P14 0.3-0.6％、P15 0.4-0.5％、P160.5-0.6％。

更进一步优选，所述短葶山麦冬总皂苷含有以下重量百分比的成分：P1 2.5-4％、P2 5.5-7.5％、P4 0.5-0.8％、短葶山麦冬皂苷C 45-60％、P14 0.3-0.6％、P15 0.4-0.5％、P16 0.5-0.6％。

再进一步优选，所述短葶山麦冬总皂苷含有以下重量百分比的成分：P1 3-3.5％、P2 6.5-7.5％、P4 0.6-0.8％、短葶山麦冬皂苷C 45-50％、P14 0.5-0.6％、P15 0.4-0.5％、P16 0.5-0.6％。

其中所述短葶山麦冬皂苷C为P10和P11的混合物，二者的重量比为15-23：25-41，优选为15-20：25-38，优选为16-17.5：30-32。

本发明还提供了本发明短葶山麦冬总皂苷的制备方法，该方法包括以下步骤：

1)取短葶山麦冬地下部位，粗粉碎，加入8-12倍量(提取溶剂体积：药材质量8-12：1)的60％乙醇水溶液，煎煮1-1.5小时，过滤，滤渣中再加入6-8倍量60％乙醇水溶液，煎煮1-1.5小时，过滤，合并滤液，减压浓缩至无醇，加95％乙醇至含醇量达到20％-25％，调节体积至药材量的6-8倍，即得到上样液；

2)吸取上样液加入D101大孔吸附树脂柱中(树脂质量：药材质量2：3)，上样流速为1BV/h；用30％乙醇水溶液冲洗6BV，流速为2BV/h，弃去流出液；再用75％乙醇水溶液洗脱6BV，流速为2BV/h，收集流出液，减压浓缩，调节体积至药材量的6-8 倍，药液体积：药材质量6：1，酒精度20±2％，得到富集溶液；

3)将富集液加入ADS-7树脂柱中，树脂质量：药材质量2：3，上样流速为1BV/h；用20％乙醇洗脱6BV，流速为2BV/h，弃去流出液；然后用60-90％乙醇洗脱6-8BV，流速为2BV/小时，收集流出液，减压浓缩至干，得到短葶山脉冬总皂苷粗品；

4)准确称取大孔树脂纯化后的总皂苷粗品，用80％乙醇溶解，用2倍量的100-200目硅胶拌样，加入8-10倍量的100-200目硅胶硅胶柱中(硅胶质量：短葶山麦冬总皂苷粗品质量8-10：1)，用乙酸乙酯：乙醇3-6:1洗脱至3BV，流速为1BV/小时，弃去流出液；再用乙酸乙酯：乙醇1-3：1洗脱3-5BV，流速为1BV/小时，收集流出液；将流出液浓缩至干，即得到短葶山脉冬总皂苷。

本发明还提供了短葶山麦冬总皂苷在制备治疗胃癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、结肠癌的药物中的应用。

本发明另一方面提供了短葶山麦冬总皂苷在制备抑制肿瘤转移的药物中的应用。

其中，所述肿瘤转移，优选包括黑色素瘤肺转移。

以下通过实验数据进一步说明本发明的有益效果：

一：短葶山麦冬总皂苷(以下简称总皂苷)抗肿瘤体外细胞试验

1、细胞株与方法：见表2

表2：人源细胞株的来源和培养条件

[MTT方法]

1)取处于指数生长期状态良好的细胞一瓶，加入0.25％胰蛋白酶消化液，消化使贴壁细胞脱落，计数2～4×10⁴个/ml，制成细胞悬液。取细胞悬液接种于96孔板上，180μl/孔，置恒温CO₂培养箱中培养24小时。

2)换液，加入受试药物(实施例1提供的总皂苷)，20μl/孔，培养72小时。将MTT 试剂加入96孔板中，20μl/孔，培养箱中反应4小时(培养条件37℃，5％CO₂)。

3)MTT法，吸去上清液，加入DMSO，150μl/孔，平板摇床上振摇5分钟。

用酶联免疫检测仪在波长为570nm处测定每孔的吸光值，并计算细胞抑制。

2、筛选结果

(1)药物对细胞的抑制率统计表：见表3-6。

表3：药物对细胞的抑制率统计表

表4：药物对细胞的抑制率统计表

表5：药物对细胞的抑制率统计表

表6：对表或结果的说明

3、结论

(1)总皂苷对四株细胞均显示中效细胞抑制作用，总皂苷四株细胞均显示有抑制细胞生长作用，且对MDA-MB-231细胞显示中效细胞抑制作用，对其他三株细胞均显示弱效细胞抑制作用。

(2)总皂苷在低浓度下对NCI-H1975较为敏感，高浓度时对四种肺癌细胞敏感性相当。

二、短葶山麦冬总皂苷抑制肿瘤转移动物实验

(一)短葶山麦冬总皂苷在小鼠黑色素瘤肺转移模型中的抗肿瘤转移作用

1实验目的

采用小鼠黑色素瘤B16-F10实验性肺转移模型，评价总皂苷体内抗侵袭转移活性。

2.实验材料

2.1实验动物

C57BL/6雄性小鼠，体重18～20g，由中国医学科学院实验动物中心提供[合格证号： SCXK(京)2014-0004]，动物饲养于中国医学科学院药物研究所GLP动物实验中心。自由摄食、饮水，温度20±3℃，相对湿度50.0±10.0％，间隔12小时开灯光照。实验中所有操作均遵循北京市实验动物福利伦理审查指南。

2.2样品及试剂

短葶山麦冬总皂苷样品：制备方法见实施例1，由天士力研究院药理毒理所提供，用0.5％CMC-Na液配制成混悬液。

注射用环磷酰胺为山西普德药业有限公司，批号：04140202。

2.3细胞株

小鼠B16-F10高转移黑色素瘤细胞株为本实验室保存，常规复苏，在含10％胎牛血清的1640培养液(含青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml)中生长，培养条件为37℃、 5％CO₂，饱和湿度。用含0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA液消化传代。体外扩增。

3.实验方法

3.1模型制备

无菌条件下收集生长状态良好的B16-F10细胞，显微镜下计数，用无菌生理盐水稀释成1×10⁶/ml浓度。适应环境后的雄性C57BL/6小鼠(18～20g)82只，无菌条件下尾静脉注射B16-F10细胞，注射量0.2ml/只。于造模后第二天随机分组并开始给药。

3.2分组给药情况

42只尾静脉接种B16-F10瘤株C57BL/6小鼠按体重随机分为4组，每组10～12只。分组情况、给药剂量及给药方式见表7，分别为模型组、总皂苷低剂量组、高剂量组及阳性对照药环磷酰胺组。除环磷酰胺组为每周腹腔注射给药1次，共给药3次，其他给药组均每天灌胃给药1次，连续给药24天。模型组动物灌胃给予相同量的0.5％CMC-Na 液。给药量均为10mL/kg。每天观察动物状态，每3-4天称量一次动物体重。

表7：B16-F10实验性肺转移模型动物分组情况

组别	动物数(只)	剂量(mg/kg)	给药方式
				模型组	12	-	po.
总皂苷低剂量组	10	4.17	po.
				总皂苷高剂量组	10	16.68	po.
环磷酰胺组	10	60	ip.

3.3检测指标

小鼠于末次给药后禁食不禁水16h，称重，取血，分离血清，血清储存于-80℃冰箱保存备用。处死动物后仔细剥离肺脏，脾脏，分别称重，计算肺脏指数和脾脏指数(计算方法同实验一)。在解剖显微镜下计数肺转移灶数目(2mm)，并按下式公式计算肺转移抑制率：

4实验结果

4.1动物一般状况及体重变化情况：见表8

表8：对黑色素瘤B16-F10肺转移小鼠模型体重情况的影响

组别	动物数(只)	剂量(mg/kg)	体重(g)<sup>a</sup>
				模型组	12/10	-	21.7±1.84
总皂苷低剂量组	10/10	4.17	21.2±1.35
				总皂苷高剂量组	10/9	16.68	21.4±1.38
环磷酰胺组	10/9	60	20.1±0.76<sup>*</sup>

^a注：禁食不禁水12h后体重。与模型组比较，^*P＜0.05。

表8结果显示：阳性对照药环磷酰胺组在第一次给药后动物体重即显著降低，第4-18 天四次称量动物体重，与模型组比较均有统计学差异(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05，P ＜0.05)。

环磷酰胺组在开始给药后第10天有1只动物因体重严重下降死亡。模型组动物在开始给药后第14天1只动物死亡，解剖死亡动物发现肺脏已出现黑色点状转移灶。总皂苷高剂量组在开始给药后第19天有1只动物死亡，解剖发现肺脏有黑色转移灶。

在开始给药后23天，即接种肿瘤后24天取1只模型组动物处死，解剖观察肺脏转移情况，发现众多大小不等的黑色肺转移灶已经形成。鉴于动物状态，于接种B16-F10 黑色素瘤后第26天，处理全部动物。禁食不禁水16h，动物处死前体重情况见表8。阳性对照药环磷酰胺组动物体重与模型组比较显著减低(P＜0.05)。

结果表明：总皂苷低、高剂量组动物体重与模型组比较无降低，提示总皂苷样品无明显毒性。

4.2肺脏指数、脾脏指数：见表9

表9：对肺脏指数、脾脏指数的影响

组别	剂量(mg/kg)	肺脏指数(g/g)％	脾脏指数(g/g)％
				模型组	-	1.61±0.44	0.38±0.06
总皂苷低剂量组	4.17	1.42±0.65	0.38±0.06
				总皂苷高剂量组	16.68	1.45±0.55	0.42±0.08
环磷酰胺组	60	1.02±0.16<sup>**</sup>	0.26±0.02<sup>***</sup>

注：^**P＜0.01，^***P＜0.001，与模型组比较。

表9结果显示：取肺脏及脾脏分别称重，计算肺脏指数和脾脏指数，总皂苷低、高剂量组连续给药24天，对肺脏指数和脾脏指数均无显著影响，与模型组比较无统计学差异。环磷酰胺组每周给药一次，共给药3次，能显著降低脾脏指数和肺脏指数，对脾脏指数的降低作用进一步提示环磷酰胺的免疫抑制不良反应，对肺脏指数的降低可能是其显著抑制B16-F10黑色素瘤肺转移，减少肺脏肿瘤转移灶数量引起。

4.3 B16-F10黑色素瘤实验性肺转移抑制率：见表10

表10：对黑色素瘤肺转移的影响

组别	剂量(mg/kg)	动物数(只)	肺转移灶数目(个)	肺转移抑制率(％)
					模型	-	12/10	52.3±8.3
总皂苷低剂量组	4.17	10/10	24.3±10.9<sup>***</sup>	53.5
					总皂苷高剂量组	16.68	10/9	20.7±10.0<sup>***</sup>	60.4
环磷酰胺组	60	10/9	16.33±9.5<sup>***</sup>	68.77

注：^*P＜0.05，^***P＜0.001，与模型组比较。

表10结果显示：在尾静脉注射B16-F10黑色素瘤细胞后26天，模型组动物肺脏均出现大小不等的黑色黑色素瘤转移灶，弥漫整个肺脏，其他脏器未发现明显转移灶。

总皂苷高、低剂量组有一定抑制B16-F10黑色素瘤肺转移的作用，肺组织肿瘤转移灶数目明显减少，转移灶大小亦明显缩小，有部分动物肺组织结构清晰，仅有少量转移灶，评价总皂苷的抗肿瘤转移活性，以计数肺转移灶数目并进行统计，结果见表10，总皂苷低剂量组和高剂量组均能显著降低肺转移灶数目，与模型组比较有统计学差异。阳性对照药环磷酰胺组动物肺组织肿瘤转移灶普遍较少，肺转移抑制率达68.77％，与模型组比较有极显著统计学差异。

5、结论：

5.1总皂苷样品在黑色素瘤肺转移小鼠连续给药24天，动物体重无降低，提示毒性较小。

5.2总皂苷连续给药24天，对黑色素瘤肺转移均具有显著抑制活性，黑色素瘤肺脏转移灶数目显著减少，与模型组比较各剂量组均有统计学差异。同时转移灶体积明显缩小。

5.3阳性对照药环磷酰胺显著抑制黑色素瘤肺转移，肺转移抑制率为68.77％。

三、短葶山麦冬总皂苷自发结肠癌的实验预防作用

1、目的

考察短葶山麦冬总皂苷对C57BL/6J-ApcMin小鼠自发结肠癌的实验预防作用。

2、材料与方法

2.1受试药物

短葶山麦冬总皂苷、DT-13样品自制、短葶山麦冬提取物(参考专利文献CN102085293 A实施例1所述方法制备)。

2.2动物

雌性C57BL/6J-ApcMin小鼠，4周龄，体重18-22g，由南京大学-南京生物医学研究院提供。雌性C57BL/6J小鼠，4周龄，体重16-18g，由南京大学-南京生物医学研究院提供。每组动物数为：背景鼠6只，阴性对照组8只，各给药组各8只。

2.3试验方法

根据动物体重随机分组，每天称量小鼠体重。短葶山麦冬总皂苷组和DT-13组分别以30mg/kg和10mg/kg灌胃给药，短葶山麦冬提取物组以200mg/kg灌胃给药，每天一次，共四周；阴性对照组同时灌胃给等量的0.5％CMCNa。同时观察老鼠是否有便血情况出现。

2.4检测指标及计算方法

肿瘤体积(tumor volume，TV)，根据实际情况，设定一定的标准(如<1mm， 1-2mm，>2mm)，分别统计该标准下肿瘤的数目。

肿瘤数目，分别统计小鼠小肠部位及结直肠部位肿瘤数目。

2.5统计方法：实验数据以平均值和标准差表示，统计方法采用t-检验。

3、结果

3.1短葶山麦冬总皂苷对小鼠息肉的影响

3.1.1对小鼠结直肠息肉的影响：见表11。

表11：对小鼠结直肠息肉发生数量抑制作用

序号	阴性对照组	短葶山麦冬提取物组	短葶山麦冬总皂苷组	DT-13组
					1	1	1	1	0
2	1	1	1	1
					3	1	1	0	1
4	1	1	1	0
					5	1	1	0	1
6	1	1	0	2
					7	0	1	0	1
8	2	0	1	0
					平均发生率	1	0.875	0.5	0.75

表11结果显示：阴性对照组结直肠息肉平均发生数量为1/只；短葶山麦冬提取物组结直肠息肉平均发生率为0.875/只；短葶山麦冬总皂苷组结直肠息肉平均发生数量为0.5/只；DT-13组结直肠息肉平均发生数量为0.75/只。

结果表明：短葶山麦冬总皂苷、短葶山麦冬提取物和DT-13对小鼠结直肠息肉发生数量有抑制作用，其中短葶山麦冬总皂苷的作用较DT-13和短葶山麦冬提取物相对较强。

3.1.2对小鼠小肠息肉的影响：见表12

表12：对小鼠小肠息肉发生数量抑制作用

序号	阴性对照组	短葶山麦冬提取物组	短葶山麦冬总皂苷组	DT-13组
					1	9	6	6	6
2	7	7	5	9
					3	5	8	4	6
4	5	4	5	6
					5	5	6	6	5
6	8	5	5	5
					7	8	7	4	5
8	8	6	5	6
					平均发生率	6.875	6.125	5	6

表12结果显示：阴性对照组小肠息肉平均发生数量为6.875/只，短葶山麦冬提取物组小肠息肉平均发生数量为6.125/只；DT-13组小肠息肉平均发生数量为6/只，短葶山麦冬总皂苷组小肠息肉平均发生数量为5/只。

结果表明：短葶山麦冬总皂苷和DT-13对小鼠小肠息肉发生数量有一定的抑制作用。

3.1.3结对小鼠肠道息肉的影响：见表13

表13：对小鼠肠道息肉发生数量抑制作用

序号	阴性对照组	短葶山麦冬提取物组	短葶山麦冬总皂苷组	DT-13组
					1	10	7	7	10
2	8	8	6	6
					3	6	9	4	7
4	6	5	6	6
					5	6	7	6	6
6	9	6	5	7
					7	8	8	4	6
8	10	6	6	6
					平均发生率	7.875	7	5.5	6.75

表13结果显示：阴性对照组肠息肉平均发生数量为7.875/只；短葶山麦冬提取物组肠息肉平均发生数量为7/只；DT-13组肠息肉平均发生数量为6.75/只；短葶山麦冬总皂苷组肠息肉发生5.5/只。

结果表明：短葶山麦冬总皂苷对小鼠肠道息肉发生数量有一定的抑制作用。

3.2对C57BL/6J-ApcMin小鼠自发肠息肉的影响

3.2.1对直径>2mm的肠息肉的影响：见表14

表14：对C57BL/6J-ApcMin小鼠自发肠息肉(直径>2mm)数量

序号	阴性对照组	短葶山麦冬提取物组	总皂苷组	DT-13组
					1	3	1	1	0
2	0	1	0	1
					3	0	1	0	0
4	0	0	0	0
					5	1	0	0	0
6	2	0	0	0
					7	2	1	0	0
8	0	0	0	0
					平均发生率	1	0.5	0.125	0.375

表14结果显示：阴性对照组直径大于2mm肠息肉的平均数量为1/短葶山麦冬提取物组直径大于2mm肠息肉的平均数量为0.5/只；DT-13组直径大于2mm肠息肉的平均数量为0.375/只，短葶山麦冬总皂苷组直径大于2mm肠息肉的平均数量为0.125/只。

结果表明：短葶山脉冬总皂苷和DT-13对肿瘤体积有明显的抑制作用，且抑制作用强于DT-13和短葶山麦冬提取物。

3.2.2对直径1-2mm的肠息肉的影响：见表15

表15：对C57BL/6J-ApcMin小鼠自发肠息肉(直径1-2mm)数量

序号	阴性对照组	短葶山麦冬提取物组	短葶山麦冬总皂苷组	DT-13组
					1	6	6	4	5
2	5	5	5	6
					3	6	5	4	5
4	5	4	5	5
					5	3	5	4	4
6	3	4	4	5
					7	6	5	1	4
8	6	5	4	4
					平均发生率	5	4.875	3.875	4.75

表15结果显示：阴性对照组直径位于1-2mm肠息肉的平均数量为5/只，短葶山麦冬提取物组直径位于1-2mm肠息肉的平均数量为4.875/只；短葶山麦冬总皂苷组直径位于1-2mm肠息肉的平均数量为3.875/只，DT-13组直径位于1-2mm肠息肉的平均数为 4.75/只。

3.2.3：对直径＜1mm的肠息肉的影响：见表16

表16：对C57BL/6J-ApcMin小鼠自发肠息肉(直径<1mm)数量

序号	阴性对照组	短葶山麦冬提取物组	短葶山麦冬总皂苷组	DT-13组
					1	1	0	2	1
2	3	2	1	3
					3	0	3	0	2
4	1	1	1	1
					5	2	2	2	2
6	4	2	1	2
					7	0	2	3	2
8	4	1	2	2
					平均发生率	1.875	1.625	1.5	1.875

表16结果显示：阴性对照组直径小于1mm肠息肉的平均数量为1.875/只；短葶山麦冬提取物组直径小于1mm肠息肉的平均数量为1.6255/只；短葶山麦冬总皂苷组直径小于1mm肠息肉的平均数量为1.5/只；DT-13组直径小于1mm肠息肉的平均数量为 1.875/只。

同时，在整个实验过程中没有发现体重异常的数值，在解剖时，给药组发现肝，脾，肺，肾等脏器均正常，初步判定无毒性副作用。

四、短葶山麦冬总皂苷对人结直肠癌HCT15裸小鼠原位瘤的实验治疗作用

1、实验目的：测试短葶山麦冬总皂苷对人结肠癌的体内抗肿瘤效果。

2、材料与方法：

2.1.动物：

BALB/c鼠，18-20g，SPF级，雌性，由南京大学模式动物中心提供，合格证号： SCXK(苏)201606732。

2.2.瘤种：人结直肠癌HCT15。

2.3.测试物：

短葶山麦冬提取物(参考专利文献CN102085293A实施例1所述方法制备)。

短葶山麦冬总皂苷自制；

DT-13自制；

氟尿嘧啶购自南通精华制药股份有限公司

2.4配制方法：

分别称取短葶山麦冬提取物、短葶山麦冬总皂苷粉末和DT-13粉末75mg、22.5mg和7.5mg，分别加入30ml的0.5％的CMCNa溶液，混匀，得到最高浓度。其他给药浓度按比例稀释；

阳性药氟尿嘧啶：注射液为：25mg/ml。

2.5造模方法：

选用18-20g雌性BALB/c裸小鼠60只。人结直肠癌HCT 15裸小鼠原位瘤，由人结直肠癌HCT15细胞株接种于裸小鼠结直肠而建立。细胞接种量为5×10⁶个/只，接种形成移植瘤后再在裸小鼠体内传1代后使用，60只裸鼠术前禁食12h。

取生长旺盛期的瘤组织剪切成1.5mm³左右，在无菌条件下，动物腹腔麻醉(4.35％的三氯水合氯醛或者0.5％戊巴比妥钠(35～50mg/kg))后，依次用碘酒、酒精消毒，在腹部中线做一切口，打开腹腔，掏出结肠，盲结肠的交接处用手术刀轻轻刮伤浆膜层，用缝合线把8-15块瘤组织缝合结肠处，术毕观察无活动性出血后，将结肠送回腹腔，缝合伤口。最后逐层缝合腹膜(含肌层)及皮肤。

术后所有裸鼠暂时分笼饲养直至完全清醒,整个手术过程尽量在切除皮下瘤后1h内完成。术后立即皮下注射生理盐水1～1.5ml以补充水分的丢失，再禁食禁水6h后给予高能量饮食。

术后一周给药，将存活的裸鼠随机分为6组，分别为：模型对照组、短葶山麦冬提取物组(25mg/kg)、短葶山麦冬总皂苷高剂量组(7.5mg/kg)、短葶山麦冬总皂苷低剂量组(3.75mg/kg)、DT-13组(1.25mg/kg)及氟尿嘧啶组(30mg/kg)。每次给药同时称量体重，观察动物的进食状况及活动情况。

3结果与结论：

3.1小鼠体重的变化

在35天的实验过程中，模型对照组小鼠体重稳中有升，氟尿嘧啶组小鼠体重有所下降，短葶山麦冬总皂苷各组和DT-13组小鼠体重稳中有升。

3.2对人结直肠癌HCT 15裸小鼠原位移植瘤瘤重的影响：见表17

表17：对人结直肠癌HCT 15裸小鼠原位移植瘤瘤重的影响

注：模型对照组术后不处理，灌胃给等量的0.5％CMCNa

表17结果显示：模型对照组小鼠的平均瘤重为0.55±0.28g，氟尿嘧啶组小鼠的平均瘤重为0.3±0.17g，短葶山麦冬提取物组小鼠平均瘤重为45±0.25g DT-13组小鼠平均瘤重为0.46±0.29g，短葶山麦冬总皂苷低剂量组小鼠平均瘤重为0.37±0.23g，短葶山麦冬总皂苷高剂量组小鼠平均瘤重为0.39±0.15g。

3.3对人结直肠癌HCT 15裸小鼠原位移植瘤瘤体积的影响：见表18

表18：对人结直肠癌HCT 15裸小鼠原位移植瘤体积的影响

表18结果显示：短葶山麦冬总皂苷组对人结直肠癌HCT 15裸小鼠原位移植瘤瘤体积抑制作用和瘤重抑制作用一致。且抑制作用优于短葶山麦冬提取物组和DT-13组。

本发明提供的短葶山麦冬总皂苷具有以下优点：

1、从组成上来看，现有技术CN102085293A(申请号为201110007853.4，简写为2011年专利)公开了一种短葶山麦冬提取物，该文献中写明提取物中含有2-30％短葶山麦冬，2-20％倍半萜葡萄糖苷，本发明在研究中发现，本发明提取的总皂苷中不含有倍半萜葡萄糖苷，且发现2011年专利中未发现的成分，本发明明确限定了总皂苷中各重要成分的含量，以上成分较现有技术组分结构清楚、各成分在总皂苷中占比明确，并且可以通过明确的含量测定方法进行测定和表征。

2、从制备方法来看，通过两步树脂和一步硅胶工艺，总皂苷成分的富集和活性组分更加明确，替代了萃取工艺，得到的产物与现有技术不同，其制备方法也简便，便于批量化生产及生产过程控制。

3、效果上，与现有技术相比，本发明提供的总皂苷在单独抗肿瘤(尤其是在胃癌、黑色素瘤、卵巢癌、结肠癌、肺癌方面)及抗肿瘤转移上均具有明确较好的疗效。

附图说明

图1：总皂苷化学成分色谱图；

图2-1：P2化合物的MSE图；

图2-2：P2化合物的结构与HMBC相关谱。

具体实施方式

实施例1：一种短葶山麦冬总皂苷的制备方法

1、取短葶山麦冬地下部位，粗粉碎，加入10倍量(提取溶剂体积：药材质量10：1)的60％乙醇水溶液，煎煮1.5小时，过滤，滤渣中再加入8倍量60％乙醇水溶液，煎煮1.5 小时，过滤，合并滤液，减压浓缩至无醇，加95％乙醇至含醇量达到20％-25％，调节体积至药材量的6-8倍，即得到上样液。

2、吸取上样液加入D101大孔吸附树脂柱中(树脂质量：药材质量2：3)，上样流速为1BV/h。用30％乙醇水溶液冲洗6BV，流速为2BV/h，弃去流出液；

再用75％乙醇水溶液洗脱6BV，流速为2BV/h，收集流出液，减压浓缩，调节体积至药材量的6-8倍(药液体积：药材质量6：1)，酒精度20±2％，得到富集溶液。

3、将富集液加入ADS-7树脂柱中(树脂质量：药材质量2：3)，上样流速为1BV/h。用20％乙醇洗脱6BV，流速为2BV/h，弃去流出液；

然后用90％乙醇洗脱6-8BV，流速为2BV/小时，收集流出液，减压浓缩至干，得到短葶山麦冬总皂苷粗品；

4、准确称取大孔树脂纯化后的总皂苷粗品，用80％乙醇溶解，用2倍量的100-200目硅胶拌样，加入10倍量的100-200目硅胶硅胶柱中(硅胶质量：短葶山麦冬总皂苷粗品质量10：1)，用乙酸乙酯：乙醇4:1洗脱至3BV，流速为1BV/小时，弃去流出液；

再用乙酸乙酯：乙醇1：1洗脱3-5BV，流速为1BV/小时，收集流出液，将流出液浓缩至干，即得到短葶山麦冬总皂苷。

5、检测方法-高效液相色谱法

1)对照品溶液的制备

精密称取14个对照品，加甲醇溶解并稀释定容至刻度，摇匀，得到浓度分别为 P1(0.0965mg/mL)、P2(0.1032mg/mL)、P4(0.0351mg/mL)、10(0.1252mg/mL)、 P11(0.2209mg/mL)、P13(0.02748mg/mL)、P16(0.0534mg/mL)对照品混合溶液。

标准品均为实验室自制

2)供试品溶液的制备

精密称取短葶山麦冬总皂苷，置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释定容至刻度，摇匀，得到浓度为(0.5263mg/mL)的供试品溶液，过0.22μm滤膜，即得。

3)总皂苷色谱条件：

Waters Xbridge^TM C18(4.6×250mm，3.5μm)色谱柱；以甲醇-乙腈-水(5:39:56)为流动相等度洗脱120min；流速为1mL/min；检测波长为203nm；柱温为40℃。

4)结果见图1：

结合检测结果与现有文献比较，最终确定结构式Ⅰ到Ⅳ的结构和表19中的P1、P3-16 化合物。

表19：总皂苷配比及结构表

*代表新化合物P1、P3-16化合物结构式来源于已发文献。

结构鉴定：

P2分子式C₄₉H₇₈O₂₁为新化合物

P2化合物：白色粉末。易溶于甲醇、乙醇、吡啶等溶剂，难溶于水、氯仿等。Liebermann-Burchard Reaction阳性(墨绿色)，提示该化合物可能为一甾体皂苷类化合物。IR除了在3435(OH)、2952、1457、1379(-C＝C-)和1051(-C-O-)cm^-1处的吸收峰外，表现出特征的25I异螺甾烷型的特征吸收峰(978、918、892、836、892>918cm^-1)。 ESI-Q-TOF-MS给出[M+HCOOH-H]^-准分子离子峰1047.5050(Calc.1047.5012，见图2-1 P2化合物的MS^E图)，表明该化合物的分子量为1002，结合其¹H、¹³C推断化合物分子式为C₄₉H₇₈O₂₁。

将该化合物数据(表20)进一步与参考文献1中化合物18的数据对比，发现两者糖链一致，可确定化合物的结构为：

(25R)-pennogenin-3-O-[β-D-xylopyranosyl(1→2)]-[β-D-xylopyranosyl(1→4)-α-L-rham nopyranosyl(1→3)]-β-D-glucopyranoside，该化合物为一新化合物，相应信号归属见表 2-1，结构与HMBC相关谱见图2-2。

表20：P2化合物的¹H和¹³C NMR数据(pyridine-d5)

实施例2：一种短葶山麦冬总皂苷的制备方法

1、取短葶山麦冬地下部位，粗粉碎，加入8倍量(提取溶剂体积：药材质量10：1) 的60％乙醇水溶液，煎煮1小时，过滤，滤渣中再加入6倍量60％乙醇水溶液，煎煮1小时，过滤，滤渣中再加入6倍量60％乙醇水溶液，煎煮1小时，过滤，合并滤液，减压浓缩至无醇，加95％乙醇至含醇量达到20％-25％，调节体积至药材量的6-8倍，即得到上样液。

然后用60％乙醇洗脱6-8BV，流速为2BV/小时，收集流出液，减压浓缩至干，得到短葶山麦冬总皂苷粗品；

4、准确称取大孔树脂纯化后的总皂苷粗品，用80％乙醇溶解，用2倍量的100-200目硅胶拌样，加入8倍量的100-200目硅胶硅胶柱中(硅胶质量：短葶山麦冬总皂苷粗品质量8：1)，用乙酸乙酯：乙醇4:1洗脱至3BV，流速为1BV/小时，弃去流出液；

再用乙酸乙酯：乙醇1：1洗脱3BV，流速为1BV/小时，收集流出液，将流出液浓缩至干，即得到短葶山脉冬总皂苷。

5、内容物含量，检测方法见实施例1，结果见表21

表21：相关物质峰名称与结构

实施例3：一种短葶山麦冬总皂苷的制备方法

1、取短葶山麦冬地下部位，粗粉碎，加入12倍量(提取溶剂体积：药材质量12： 1)的60％乙醇水溶液，煎煮1.5小时，过滤，滤渣中再加入10倍量60％乙醇水溶液，煎煮1.5小时，过滤，合并滤液，减压浓缩至无醇，加95％乙醇至含醇量达到20％-25％，调节体积至药材量的6-8倍，即得到上样液。

再用70％乙醇水溶液洗脱6BV，流速为2BV/h，收集流出液，减压浓缩，调节体积至药材量的6-8倍(药液体积：药材质量6：1)，酒精度20±2％，得到富集溶液。

4、准确称取大孔树脂纯化后的总皂苷粗品，用80％乙醇溶解，用2倍量的100-200目硅胶拌样，加入10倍量的100-200目硅胶硅胶柱中(硅胶质量：DT13总皂苷粗品质量10：1)，用乙酸乙酯：乙醇4:1洗脱至3BV，流速为1BV/小时，弃去流出液；

再用乙酸乙酯：乙醇1：1洗脱3BV，流速为1BV/小时，收集流出液，将流出液浓缩至干，即得到短葶山麦冬总皂苷。

5、检测内容物含量，其检测方法同实施例1。结果见表22

表22：相关物质峰名称与结构

注：*表示新化合物

实施例4：一种短葶山麦冬总皂苷的制备方法

1、取短葶山麦冬地下部位，粗粉碎，加入10倍量(提取溶剂体积：药材质量12： 1)的60％乙醇水溶液，煎煮1.5小时，过滤，滤渣中再加入8倍量60％乙醇水溶液，煎煮1.5小时，过滤，合并滤液，减压浓缩至无醇，加95％乙醇至含醇量达到20％-25％，调节体积至药材量的6-8倍，即得到上样液。

4、准确称取大孔树脂纯化后的总皂苷粗品，用80％乙醇溶解，用2倍量的100-200目硅胶拌样，加入9倍量的100-200目硅胶硅胶柱中(硅胶质量：短葶山麦冬总皂苷粗品质量9：1)，用乙酸乙酯：乙醇4:1洗脱至3BV，流速为1BV/小时，弃去流出液；

再用乙酸乙酯：乙醇2：1洗脱3-5BV，流速为1BV/小时，收集流出液，将流出液浓缩至干，即得到短葶山麦冬总皂苷。

5、内容物含量，检测方法见实施例1，结果见表23

表23：相关物质峰名称与结构

注：*表示新化合物

参考文献：

1姜宇.麦冬须根的化学成分研究[D].沈阳：沈阳药科大学,2007.

2王宪民.短葶山麦冬地下部位皂苷类成分变化规律研究[D].南京：中国药科大学,2015.

3.余伯阳,徐国钧,平井康昭,等.湖北麦冬与短葶山麦冬的化学成分研究[J].中国药科大学学报, 1988,19:209.

[4]李永伟.I类抗肿瘤新药短葶山麦冬皂苷C相关物质及类似物研究[D].南京：中国药科大学, 2014。

Claims

1.一种短葶山麦冬总皂苷，所述总皂苷中含有以下式Ⅰ到式Ⅳ所示的成分，不含有倍半萜葡萄糖苷类化合物：

编号分子式分子量母核具体糖基连接(R取代基) P1 C44H70O17 870 IV [α-L-rha(1→2)]-[β-D-xyl(1→3)]-β-D-glu P2 C49H78O21 1002 IV [β-D-xyl(1→2)]-[β-D-xyl(1→4)-α-L-rha(1→3)]-β-D-glu P4 C43H68O17 856 I [β-D-glu(1→2)][β-D-xyl(1→3)]-β-D-xyl P10 C44H70O17 870 II [β-D-glul(1→2)][β-D-xyl(1→3)]-β-D-fuc P11 C44H70O17 870 I [β-D-glul(1→2)][β-D-xyl(1→3)]-β-D-fuc P14 C49H78O20 986 III [β-D-xyl(1→2)]-[β-D-xyl(1→4)-α-L-rha(1→3)]-β-D-glu P15 C44H70O16 854 I [α-L–rha(1→2)][[α-L–xyl(1→3)]-β-D-fuc P16 C44H70O16 854 I [β-D-fuc(1→2)][[β-D-xyl(1→4)]-β-D-fuc

其中，P10和P11是短葶山麦冬皂苷C的两个构型，所述总皂苷含有以下重量百分比的成分：P1 1-4％、P2 1-8％、P4 0.2-1％、短葶山麦冬皂苷C 35-70％、P14 0.2-1％、P15 0.2-0.8％、P16 0.4-0.8％，皂苷的总含量不少于50％，不含有倍半萜葡萄糖苷类化合物。

2.根据权利要求1所述的短葶山麦冬总皂苷，其特征在于，所述总皂苷中含有以下重量百分比的成分：P1 1.3-4％、P2 1.5-8％、P4 0.2-1％、短葶山麦冬皂苷C 35-70％、P140.3-1％、P15 0.4-0.8％、P16 0.5-0.8％。

3.根据权利要求2所述的短葶山麦冬总皂苷，其特征在于，所述总皂苷中含有以下重量百分比的成分：P1 2-4％、P2 5-8％、P4 0.3-0.8％、短葶山麦冬皂苷C40-65％、P14 0.3-0.6％、P15 0.4-0.5％、P16 0.5-0.6％。

4.根据权利要求3所述的短葶山麦冬总皂苷，其特征在于，所述总皂苷中含有以下重量百分比的成分：P1 2.5-4％、P2 5.5-7.5％、P4 0.5-0.8％、短葶山麦冬皂苷C 45-60％、P140.3-0.6％、P15 0.4-0.5％、P16 0.5-0.6％。

5.根据权利要求4所述的短葶山麦冬总皂苷，所述短葶山麦冬总皂苷含有以下重量百分比的成分：P1 3-3.5％、P2 6.5-7.5％、P4 0.6-0.8％、短葶山麦冬皂苷C 45-50％、P140.5-0.6％、P15 0.4-0.5％、P16 0.5-0.6％。

6.根据权利要求1-5任一项所述的短葶山麦冬总皂苷，其特征在于，所述短葶山麦冬皂苷C为P10和P11的混合物，二者的重量比为15-23：25-41。

7.根据权利要求6所述的短葶山麦冬总皂苷，其特征在于，所述短葶山麦冬皂苷C中P10和P11的重量比为15-20：25-38。

8.根据权利要求7所述的短葶山麦冬总皂苷，其特征在于，所述短葶山麦冬皂苷C中P10和P11的重量比为16-17.5：30-32。

9.权利要求1-8任一项所述短葶山麦冬总皂苷的制备方法，所述方法包括以下步骤：

1)取短葶山麦冬地下部位，粗粉碎，加入8-12倍量的60％乙醇水溶液，煎煮1-1.5小时，过滤，滤渣中再加入6-8倍量60％乙醇水溶液，煎煮1-1.5小时，过滤，合并滤液，减压浓缩至无醇，加95％乙醇至含醇量达到20％-25％，调节体积至药材量的6-8倍，即得到上样液；

2)吸取上样液加入D101大孔吸附树脂柱中，树脂质量：药材质量2：3，上样流速为1BV/h；用30％乙醇水溶液冲洗6BV，流速为2BV/h，弃去流出液；再用75％乙醇水溶液洗脱6BV，流速为2BV/h，收集流出液，减压浓缩，调节体积至药材量的6-8倍，药液体积：药材质量6：1，酒精度20±2％，得到富集溶液；

4)准确称取大孔树脂纯化后的总皂苷粗品，用80％乙醇溶解，用2倍量的100-200目硅胶拌样，加入8-10倍量的100-200目硅胶硅胶柱中，用乙酸乙酯：乙醇3-6:1洗脱至3BV，流速为1BV/小时，弃去流出液；再用乙酸乙酯：乙醇1-3：1洗脱3-5BV，流速为1BV/小时，收集流出液；将流出液浓缩至干，即得到短葶山脉冬总皂苷。

10.权利要求1-8任一项所述短葶山麦冬总皂苷在制备治疗胃癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、结肠癌和抑制肿瘤转移的药物中的应用。

11.含有权利要求1-8任一项所述短葶山麦冬总皂苷的药物组合物。