CN100408042C - 灵芝酸t在制备肿瘤生长或增殖抑制剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了灵芝酸T(Ganoderic acid T)和灵芝酸Me(Ganoderic acid Me)在制备肿瘤生长或增殖的抑制剂中的应用。体内和体外实验证明:灵芝酸T或灵芝酸Me具有显著的抑制人类肿瘤胞生长或增殖作用,同时对正常细胞的毒性较小,具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及灵芝酸T(Ganoderic acid T)和灵芝酸Me(Ganoderic acid Me)的用途。
背景技术
灵芝是一种珍贵的药用真菌,已有几千年的应用历史。东汉时期的《神农本草经》,把灵芝列为上药。以后历代医药学家也有许多关于灵芝的论著,如东晋葛洪的《抱朴子》,唐朝苏静的《新修本草》,梁代陶弘景的《名医别录》,以及明代李时珍的《本草纲目》等。古代医药学家对灵芝的药用价值已有充分认识,认为灵芝具有“扶正固本”作用,可用于治疗多种疾病。
灵芝的现代研究始于20世纪50年代,随着人工栽培和深层发酵生物技术的成功,为灵芝的医药研究和产品开发提供了充足的原料。《中华人民共和国药典》(2000)已收载了灵芝作为法定中药材,美国《草药药典与治疗概要》也收载了灵芝,该系列专著迄今仅收载了10种中药。说明灵芝的药用价值得到了多方面的承认。
灵芝的化学研究证明,它含有多糖,三萜类,肽类等主要有效成分。药理研究证明,它有广泛的药理作用,如抗肿瘤,抗HIV病毒,免疫调节,抗心肌缺血,调节血脂,降血糖,镇静作用,保肝作用,抗放射和抗化疗,抗缺氧和抗衰老作用等。
三萜类化合物是灵芝类的主要化学成分之一,很多三萜类化合物具有重要的生理活性,比如,ganodriol F、ganodermanontriol、lucidumol A和lucidumol B有抗HIV病毒活性,ganodericacid F有很强的抑制血管紧张素酶的活性等。自1982年T Kubota(Helv.Chim.Acta,65(2),611-619,1982)等人首次分离得到该类化合物以后,迄今为止已分离得到100多种同类化合物。
有关灵芝酸的公开的专利和发表的文献大致可分为三类:
第一类是关于发酵生产灵芝酸,这些专利和文献主要是优化发酵条件,增加灵芝酸产量:日本专利:公开特许公报特开平4-304890,公开了灵芝酸的发酵生产工艺,但所得的产物中灵芝酸的含量仅为0.46-1.0毫克/100毫克干重。专利CN1264743A中,钟建江和方庆华提供了一种“液体发酵法同时生产灵芝多糖和灵芝酸工艺”,涉及到一种液体好氧发酵-液体静止培养法,考察了第二阶段培养过程中振荡与静止对灵芝酸生产的影响。王淑华,孙翠焕,朱万琴,王恒新,冯健.灵芝液体深层发酵工艺研究初报,微生物学杂志1994,14(5):29-32报道了灵芝G3-1批培养的方法。还有一些专利和文献也公开和报道了各种发酵方法,比如,钟建江和汤亚杰公开了有关发酵法同时生产灵芝多糖和灵芝酸的专利(专利公开号CN1375557、CN1316519),可以高效率生产灵芝酸,粗灵芝酸的总含量可达5毫克/100毫克,总产量高达1克/升。
第二类是关于灵芝抗肿瘤的专利和文献,主要是灵芝子实体或孢子粉和其他药物配伍后,用于癌症的治疗:专利CN1483423报道了一种治疗恶性肿瘤的中药制剂及其制备方法,该中药制剂是以半枝莲、灵芝、鸡血藤、生地、枸杞子等为主要原料,对各种肿瘤皆有很好的疗效。专利CN 1480208报道了一种用于放化疗减毒增效的药物组合物及其制备方法,这种药物由黄芪、枸杞、灵芝按重量配比制成。专利CN 1421227报道了包含灵芝的用于治疗与预防辐射线损伤的药物。专利CN 1286119报道了一种灵芝保健品及其制备方法,灵芝酸纯度为15%,对肿瘤的抑制率达30%上。但是相关文献中未见有关灵芝酸单体的报道。
第三类是关于灵芝酸分离的专利和文献,介绍了灵芝酸的粗分离工艺,比如,专利CN1282611报道了灵芝孢子中抗肿瘤成分的分离技术,原料经浸提、萃取、层析后得到一系列膏状物。专利CN 1181271报道了一种高活性灵芝酸多糖和高含量灵芝酸的制备方法,提取物的得率提高40%。
当前,肿瘤化疗治疗领域急需解决的问题是寻找出新的低毒、高效和不易产生多药抗药性的抗癌药物资源,本项发明正与其相符合,因此,具有重要的经济效益和社会效益。
发明内容
本发明提供的肿瘤生长和增殖的抑制剂,其为灵芝酸T(Ganoderic acid T,缩写GA-T)或灵芝酸Me(Ganoderic acid Me,缩写GA-Me),或其与药理学上允许的添加成分相组合而成的剂型。
其中所说的灵芝酸T(GA-T)或灵芝酸Me(GA-Me)分别由灵芝菌丝体发酵中提取(Chem.Pharm.Bull.,34(5),2282-2285,1986;Agric.Biol.Chem.,51(2),619-622,1987),纯度大于99%,其最先被分离鉴定于1983年(Tetrahedron Lett.,24(10),1081-1084,1983)和1987年(Agric.Biol.Chem.,51(2),619-622,1987)。所说的肿瘤为医学上所属的各类肿瘤,包括良性肿瘤和恶性肿瘤。而所说的恶性肿瘤包括:恶性黑色素瘤,恶性淋巴瘤,消化器官的肿瘤(胃癌,肠癌,肝癌,胆囊癌,胆道癌,胰腺癌),肺癌,乳癌,睾丸癌,卵巢癌,子宫癌,前列腺癌,上颚癌,舌癌,口腔癌,咽喉癌,甲状腺癌,脑部肿瘤,各类肉瘤,骨肉瘤,白血病,神经系统肿瘤,膀胱肿瘤,皮肤癌,皮肤附属器官癌和皮肤转移癌。
本发明提供的肿瘤生长和增殖的抑制剂,小剂量即产生抑制多种肿瘤细胞生长的作用且具有剂量依赖性,可将它们作为治疗肿瘤的药物,应用于肿瘤的化学治疗中。
本发明提供的肿瘤生长和增殖的抑制剂,在低浓度的情况下具有抑制肿瘤细胞增殖的作用,说明不仅具有杀灭肿瘤细胞的作用而且可以遏制肿瘤细胞的无限增殖能力,因而可以发挥更进一步更大程度治疗肿瘤的效果。
本发明提供的肿瘤生长和增殖的抑制剂,对不同的人类癌细胞和人类正常细胞有不同的细胞毒性,尤其是对癌细胞的IC50要比正常细胞的IC50低很多,而且两者差异显著(p<0.05)。
本发明的肿瘤生长和增殖的抑制剂,低毒,适合于人和哺乳类动物经口或非经口给药。
本发明提供的肿瘤生长和增殖的抑制剂,在剂型方面无特定的限制,可作为经口给药的散剂,丸剂,片剂,胶囊剂等固型制剂,也可作为非经口给药的外用剂,软膏,贴敷剂,注射剂。
本发明提供的肿瘤生长和增殖的抑制剂,通常能与不影响药理学作用的辅助料配合制成经口或非经口给药的制剂。
本发明提供的肿瘤生长和增殖的抑制剂,可经水溶剂(如蒸馏水),水溶性制剂(如生理盐水),脂溶剂(如胡麻油)等溶剂用常规法调制。
本发明提供的肿瘤生长和增殖的抑制剂,通常能与药理学上允许的添加成分(稀释剂,着色剂,安定剂,界面活性剂,助溶剂,缓冲剂,矫味剂,香料,保存剂,糖衣剂)相组合,用于经口或非经口剂型。
本发明提供的肿瘤生长和增殖的抑制剂,在剂型上通常能与药理学上允许的稀释成分和成型成分相组合,用于经口或非经口剂型。
本发明提供的肿瘤生长和增殖的抑制剂经口剂型,是指片剂,丸剂,颗粒剂,散剂或胶囊。非经口剂型是指静脉注射剂,肌肉注射剂,皮下注射剂,浴剂,直肠,肛门或阴道给药。本发明的显著的优点和技术上的进步:
本发明提供的具有抑制多种人类肿瘤细胞生长和增殖作用的两种天然化合物,克服了传统上以灵芝混合提取物作为药物的缺陷,用现代生物技术作为发明的手段,明确了有效成分,运用纯化合物作为抗肿瘤药物,减少了未知成分引起负作用的可能性。这两种化合物具有显著的抑制人类肿瘤细胞生长和增殖作用(体内和体外实验),同时对人类正常细胞的细胞毒性较小,具有良好的应用前景。
附图说明
图1为不同浓度的GA-T和GA-Me对HeLa细胞的抑制作用。
图2为不同浓度的GA-T和GA-Me对95-D细胞的抑制作用。
图3为GA-T和GA-Me对几种肿瘤细胞和正常细胞L02的IC50比较。
图4为不同药物及浓度抑制裸鼠体内肿瘤生长的比较。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明内容作进一步说明。所举之例并不限制本发明的保护范围:
实施例1
GA-T和GA-Me对HeLa细胞的毒性作用:
GA-T和GA-Me均为从发酵生产的灵芝菌丝体中分离得到的纯天然产物,纯度大于99%,用DMEM培养液稀释成所需浓度。采用噻唑蓝(MTT)快速比色法测定GA-T和GA-Me对HeLa细胞的毒性作用。将对数生长期细胞(106cell·ml-1)接种于96孔培养板,每孔0.2ml,分别加入一定浓度的GA-T和GA-Me处理,每浓度平行4孔,对照组加等量体积的培养液,置37℃,5%CO2及饱和湿度的培养箱培养1-4天,实验终止前4小时每孔加入5mg·ml-1 MTT10μl,培养结束后每孔加入0.04 N二甲基亚砜(DMSO),每孔150μl,振荡10min,待MTT还原产物完全溶解,用BioRad 550型酶标仪,以550nm为实验波长,655nm为参照波长测定其吸收度,计算肿瘤细胞的抑制率和药物对细胞的抑制率,并以药物的不同浓度和细胞的抑制率作图,确定细胞的半数抑制浓度(IC50)。实验结果如下图1所示。
以上实施例说明,GA-T和GA-Me均具有良好的杀灭HeLa肿瘤细胞的作用,而且这种抑制效果还具有剂量依赖性。
实施例2
GA-T和GA-Me对95-D细胞的毒性作用:
GA-T和GA-Me均为从发酵生产的灵芝菌丝体中分离得到的纯天然产物,纯度大于99%,用RPMI-1640培养液稀释成所需浓度。采用噻唑蓝(MTT)快速比色法测定GA-T和GA-Me对95-D细胞的毒性作用。将对数生长期细胞(106cell·ml-1)接种于96孔培养板,每孔0.2ml,分别加入一定浓度的GA-T和GA-Me处理,每浓度平行4孔,对照组加等量体积的培养液,置37℃,5%CO2及饱和湿度的培养箱培养1-4天,实验终止前4小时每孔加入5mg·ml-1 MTT10μl,培养结束后每孔加入0.04N DMSO,每孔150μl,振荡10min,待MTT还原产物完全溶解,用BioRad 550型酶标仪,以550nm为实验波长,655nm为参照波长测定其吸收度,计算肿瘤细胞的抑制率和药物对细胞的抑制率,并以药物的不同浓度和细胞的抑制率作图,确定IC50。实验结果见图2。
以上实施例说明,GA-T和GA-Me均具有良好的杀灭95-D肿瘤细胞的作用,而且这种抑制效果具有剂量依赖性。
实施例3
GA-T和GA-Me对几种肿瘤细胞和正常细胞L02的细胞毒性比较:
GA-T和GA-Me均为从发酵生产的灵芝菌丝体中分离得到的纯天然产物,纯度大于99%,用DMEM或RPMI-1640培养液稀释成所需浓度。采用噻唑蓝(MTT)快速比色法测定GA-T和GA-Me对几种细胞的毒性作用。将对数生长期细胞(106cell·ml-1)接种于96孔培养板,每孔0.2ml,分别加入一定浓度的GA-T和GA-Me处理,每浓度平行4孔,对照组加等量体积的培养液,置37℃,5%CO2及饱和湿度的培养箱培养1-4天,实验终止前4小时每孔加入5mg·ml-1 MTT 10μl,培养结束后每孔加入0.04N DMSO(二甲基亚砜),每孔150μl,振荡10min,待MTT还原产物完全溶解,用BioRad 550型酶标仪,以550nm为实验波长,655nm为参照波长测定其吸收度,计算肿瘤细胞的抑制率和药物对细胞的抑制率,确定IC50并作图,结果见图3。
以上实施例说明,GA-T和GA-Me对人类肿瘤细胞的细胞毒性较大,对正常细胞的细胞毒性较弱,即GA-T和GA-Me对某些人类肿瘤细胞具有一定的靶向抑制作用。
实施例4
GA-T和GA-Me抑制裸鼠体内肿瘤生长活性的比较:
GA-T和GA-Me均为从发酵生产的灵芝菌丝体中分离得到的纯天然产物,纯度大于99%,用PBS配制并稀释成所需浓度。雄性裸鼠两只,前肢腋下注射95-D细胞(1×106个/ml),喂养四周后处死,剥离裸鼠的实体瘤,剪碎并用PBS(7.4)研磨,80目筛网过滤。配成细胞悬浮液备用。雄性裸鼠按体重随机分组,前肢腋下注射95-D细胞悬浮液(1×106个/ml),喂养一周,待实体瘤长出后,不同的药物腹腔隔日注射,阴性对照为生理盐水(PBS)。以抗癌药物为阳性对照,注射2周后停药,再饲养10天,处死,剥离裸鼠的实体瘤称重。与对照比较计算抑制率。药物的不同浓度对肿瘤的抑制率的影响的实验结果如图4所示。
以上实施例说明,GA-T和GA-Me在体内也能抑制肿瘤的生长,同时也具有剂量依赖性。
Claims (1)
1. 灵芝酸T在制备肿瘤生长和增殖的抑制剂中的应用,所述肿瘤选自子宫癌、肺癌、口腔癌和肝癌。
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