CN104188976A - 一种p53-mdm2相互作用的抑制剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种P53-MDM2相互作用的抑制剂及其应用，所述P53-MDM2相互作用的抑制剂为灵芝酸X、灵芝酸Me、灵芝酸Y、灵芝酸T或灵芝酸F；或灵芝酸X、灵芝酸Me、灵芝酸Y、灵芝酸T、灵芝酸F中之一与药理学上允许的添加成分组合而成的组合物。本发明的P53-MDM2相互作用的抑制剂在促肿瘤细胞凋亡中的应用，特别是在促表达P53蛋白的95-D肺癌细胞或不表达P53蛋白的H1299肺癌细胞凋亡中的应用，该P53-MDM2相互作用的抑制剂具有显著地抑制人恶性肺癌肿瘤细胞中MDM2活性，从而抑制P53蛋白的降解，进一步促进含有p53的肿瘤细胞的凋亡。

Description

一种P53-MDM2相互作用的抑制剂及其应用

技术领域

本发明涉及一种P53-MDM2相互作用的抑制剂及其在由P53介导的诱导肿瘤细胞凋亡中的应用。

背景技术

随着生活方式、环境条件及人口老龄化等影响肿瘤发生发展因素的改变，自20世纪70年代以来，我国肿瘤发生率呈明显上升趋势，现已成为城、乡居民的首要死因。肿瘤的共同特性是由于正常细胞凋亡系统的缺陷导致细胞凋亡失调，具有无限增生的能力（Carcinogenesis，21:485，2000)。 因此，直接抑制癌细胞中的细胞凋亡方面起着中心作用的靶向负调节剂代表了新抗癌药物设计的一种很有前景的治疗策略。

灵芝（Ganoderma lucidum）是一种传统的药用真菌，《中华人民共和国药典》收录了灵芝作为法定中药材，2001年灵芝被列入《可用于保健食品的真菌菌种名单》。灵芝具有抗肿瘤、免疫调节等作用。三萜类化合物是灵芝类的主要化学成分之一，自1982年T Kubota (Helv. Chim. Acta, 65(2), 611-619, 1982) 等人首次分离得到该类化合物以后，迄今为止已分离得到140多种同类化合物。自Toth O（Tetrahedron Letter, 24: 1081-1084，1983）等报道灵芝三萜类化合物的抗癌活性以来，多种灵芝酸被证实具有抑制肿瘤增殖和转移功能。

有关灵芝抗肿瘤的专利和文献，主要是灵芝子实体或孢子粉和其他药物配伍及灵芝酸单体，用于抑制癌症的体内体外实验研究：专利CN1483423报道了一种治疗恶性肿瘤的中药制剂及其制备方法，该中药制剂是以半枝莲、灵芝、鸡血藤、生地、枸杞子等为主要原料，对各种肿瘤皆有很好的疗效。专利CN 1480208报道了一种用于放化疗减毒增效的药物组合物及其制备方法，这种药物由黄芪、枸杞、灵芝按重量配比制成。专利CN 1421227报道了包含灵芝的用于治疗与预防辐射线损伤的药物。专利CN 1286119报道了一种灵芝保健品及其制备方法，灵芝酸纯度为15％，对肿瘤的抑制率达30%上。CN 1709264公开了灵芝酸T和灵芝酸Me在肿瘤生长或增殖抑制剂中的应用。文献报道：灵芝酸T体外诱导肿瘤细胞凋亡的途径是依赖于线粒体的内源性凋亡途径（Life sciences, (80):205-211，2006）。

近年来,  关于蛋白-蛋白相互作用小分子抑制剂的研究已经成为药物化学家关注的热点，P53-HDM2 的相互作用已成为近年肿瘤药物研究的一个主要领域，抑制 HDM2与P53相互作用无疑为新药研究提供了一个很好的作用点。

肿瘤抑制基因p53是一个转录激活因子,  它可以调控细胞生长，当细胞中DNA受到损伤时, p53会上调有关基因进行DNA修复，使受损细胞处于细胞周期 G1 的停滞状态,  并诱导过度受损细胞进行凋亡，从而避免发生癌变。p53 的突变与很多癌症的发生有关，p53肿瘤抑制基因在控制细胞周期进行和细胞凋亡中起着重要作用（Nature， 408:307，2000)，。p53的活性由蛋白MDM2来调控。通过两种不同机制起作用: (1)直接与 p53 结合，抑制其正常结合功能使之不能形成转录复合物; (2)通过蛋白酶体途径靶向p53,  使其泛素化并降解。MDM2是一种p53的关键负向调节剂。其通过结合至p53的氨基终端转活化区而形成一种负向自动调节回路，所以，在具有野生型p53的肿瘤中，活性p53的平衡浓度可通过拮抗MDM2和p53间的相互作用而增加，将导致在这种肿瘤细胞中P53介导的凋亡。MDM2除了抑制p53的外， 还直接与pRb-调节的转录因子E2F1/DP1相互作用，因为MDM2与p53和E2F1的相互作用均位于MDM2的相同结合部位，可预期MDM2/P53拮抗剂将不仅活化细胞的P53，而且也调整E2F1的活性，而E2F1的活性在肿瘤细胞中通常是不受调节的。因此，MDM2和P53的相互作用的抑制提供一种以野生型p53治疗性干预肿瘤的方法，甚至在缺乏功能性P53的肿瘤细胞中也显示抗增殖效果。

关于MDM2和P53间相互作用的抑制剂的专利和文献：Weissman 等在 2005 年通过高通量筛选得到MDM2抑制剂（Cancer Cell，7：547,2005.），Hardcastle和Lunec等也在2005年报道了异吲哚啉酮类小分子抑制剂（Mol. Cancer Ther，4：1019,2005.），美国强生公司Koblish等在2006年报道了一种利用Thermo Fluor微量量热法来发现P53-HDM2小分子抑制剂的技术（Mol. Cancer Ther.，5：160, 2006. ）。WO 00/15357提供了哌嗪-4-苯基衍生物作为MDM2和P53间相互作用的抑制剂。EP 1137418提供了三环化合物，用于恢复P53家族蛋白质的构形稳定性。WO 03/041715描述了取代的1，4-苯并二氮杂革及其作为MDM2-P53相互作用抑制剂的用途。WO 03/51359提供了顺式_2，4，5-三苯基-咪唑酮，其抑制MDM2蛋白质与类P53肽的相互作用且具有抗增殖活性。WO 04/05278公开了双芳基磺酰胺化合物，其结合MDM2且可用于治疗癌症。CN101023074 公开了MDM2及P53间相互作用的抑制剂的合成的小分子化合物。CN 101405285公开了作为MDM2和P53间相互作用的抑制剂的环状-烷基胺衍生物。CN 102548963公开了新颖的作为MDM2-P53相互作用抑制剂的N经取代的吡咯烷类化合物。CN 102627649公开了几种MDM2 的小分子抑制剂以及其应用。CN 101316823公开了用作抗癌剂的作为P53和MDM2蛋白之间相互作用的抑制剂的2,4,5-三苯基咪唑啉衍生物。在鉴定有效的小分子抑制剂方面，虽然高效的筛选策略取得了十分有限的成功，但还是十分有限的化合物被认为具有活性。因此，迫切需要筛选新的可以抑制P53-MDM2相互作用的药物小分子。

虽然现有研究已经采用结构-活性模拟筛选模型找到了几类有限的有潜在应用价值的小分子抑制剂，但毒副作用大，不稳定，尚未进行临床研究，同时，基于结构-活性模拟筛选模型筛选出的小分子抑制剂主要是作用于MDM2和P53的结合结构域里，阻止二者结合，没有其他的生物活性，对正常细胞和肿瘤细胞无选择性，单纯地抑制这种结合对正常细胞是致命的。因此从安全性较高的中草药中筛选新的更安全的P53-MDM2相互作用抑制剂具有重要的意义。长期的临床实践已经证明了灵芝及其成分的安全性，从灵芝中筛选P53- MDM2相互作用抑制剂还未见报道。

发明内容

本发明的目的是为了提供的一种P53-MDM2相互作用的抑制剂，该抑制剂是从灵芝中筛选的。

本发明的技术方案

一种P53-MDM2相互作用的抑制剂，为灵芝酸X（以下简称GA-X）、灵芝酸Me（以下简称GA-Me）、灵芝酸Y（以下简称GA-Y）、灵芝酸T（以下简称GA-T）或灵芝酸F（以下简称GA-F）；

或GA-X、GA-Me、GA-Y、GA-T、GA-F之一与药理学上允许的添加成分组合而成的组合物；

所述的药理学上允许的添加成分为药物上可接受的盐类或酯类；

所述的GA-X、GA-Me、GA-Y、GA-T或GA-F从赤灵芝（G.Lucidum）子实体中提取纯化(Biochemical Engineering Journal, 32 (3): 205，2006)而得，其纯度大于99%。

所述的一种P53-MDM2相互作用的抑制剂，其可以经脂溶剂（如乙醇）等溶剂用常规法调制，因此其在剂型上无特殊限制。

所述的一种P53-MDM2相互作用的抑制剂还能与药理学上允许的添加成分，如稀释剂，着色剂，安定剂，界面活性剂，助溶剂，缓冲剂，矫味剂，香料，保存剂或糖衣剂等进行组合。

所述的一种P53-MDM2相互作用的抑制剂，其给药途径可以经口给药，也可非经口给药。

经口给药剂型是指片剂，丸剂，颗粒剂，散剂或胶囊。

非经口剂型是指静脉注射剂，肌肉注射剂，皮下注射剂，浴剂，直肠，肛门或阴道给药。

所述的“相互作用的抑制剂”，是指避免或降低一种或多种分子、肽、蛋白质、酶或受体的直接或间接结合；或避免或降低一种或多种分子、肽、蛋白质、酶或受体的正常活性。

“P53-MDM2相互作用的抑制剂”是指在药理分析过程中増加P53表达的药剂。此种增加可由下述的一种或多种下列作用机制所引起，但不限于此：

[1]、抑制P53与MDM2间的相互作用；

[2]、与MDM2或P53蛋白质的任一者直接结合；

[3]、与上游或下游靶，例如激酶，或涉及泛蛋白化修饰的酶活性的相互作用；

[4]、MDM2与P53在不同细胞区间的隔离或传输；

[5]、与MDM2结合的蛋白质的调节，例如（但不限于）p73、p21；

[6]、向下调节或干扰MDM2表达和/或MDM2活性，例如通过（但不限干）影响其细胞局部化、后转译修饰、核输出或泛蛋白连接酶活性；

[7]、P53蛋白质的直接或间接稳定化，例如通过保持其为其结构形式或通过避免错折叠；

[8]、促进p53表达或p53家族成员（例如p63及p73)的表达；

[9]、増加p53活性，例如通过（但不限干）增强其转录活性；

[10]、增加p53信号传输路径的基因及蛋白质的表达，例如（但不限于）p21wafl、cipl及ATF-3。

“P53”是指因p53基因的表达所获得的蛋白质，包含所有被p53基因编码的蛋白质、其变异物、其选择性的切断蛋白质及其磷酸化蛋白质；

“MDM2”是指因MDM2基因的表达所获得的蛋白质。在此术语的意义中，MDM2包含所有被MDM2编码的蛋白质、其变异物、其选择性的切断蛋白质及其磷酸化蛋白质。另外，当用于发明时，术语“MDM2”包括MDM2类似物，例如MDMX(也称为MDM4)及MDM2同系物及其它动物的类似物，例如人类同系物HDM2或人类类似物HDMX。

上述的P53-MDM2相互作用的抑制剂在促肿瘤细胞凋亡中的应用。

所述的肿瘤细胞是指医学上所属的各类恶性肿瘤：肺癌，甲状腺癌，恶性黑色素瘤，恶性淋巴瘤，脑部肿瘤，消化器官的肿瘤，乳癌，卵巢癌，子宫癌，睾丸癌，前列腺癌，上颚癌，咽喉癌，舌癌，口腔癌，各类肉瘤，骨肉瘤，白血病，神经系统肿瘤，膀胱肿瘤，皮肤癌，皮肤附属器官癌和皮肤转移癌。

上述的一种MDM2-P53相互作用抑制剂，在肿瘤细胞中小剂量使用能抑制MDM2活性或MDM2-P53相互作用，导致P53的降解过程被抑制，具有对P53介导的肿瘤细胞的选择性诱导凋亡作用。所述的小剂量是指每天、每公斤体重低于0.1-5mg的剂量；

上述的一种MDM2-P53相互作用抑制剂，在肿瘤细胞中大剂量使用直接表现出无选择性的细胞毒性。可将它们作为P53介导的肿瘤治疗药物。所说的大剂量是指每天、每公斤体重高于5-50mg的剂量。

本发明的一种P53-MDM2相互作用的抑制剂，在野生型p53和缺陷型p53肿瘤细胞中均有抑制MDM2作用，从而具有促肿瘤细胞凋亡作用，特别是表达P53蛋白的95-D肺癌细胞或p53缺陷型的H1299肺癌细胞，并且对表达P53蛋白的95-D肺癌细胞的促凋亡作用更好。

本发明的有益效果

本发明的一种P53- MDM2相互作用的抑制剂，来源于中国传统中药灵芝，能够通过多种分子途径抑制P53- MDM2相互作用，具有显著地抑制人恶性肺癌肿瘤细胞中MDM2活性，抑制P53蛋白降解的功能，可以用于抑制泛素化作用介导的蛋白降解，促进含有p53的肿瘤细胞凋亡。

现有技术中的基于结构-活性模拟筛选模型筛选出的小分子抑制剂主要是作用于MDM2和P53的结合结构域里，阻止二者结合，没有其他的生物活性，对正常细胞和肿瘤细胞无选择性，单纯地抑制这种结合对正常细胞是致命的。而本发明的一种P53- MDM2相互作用的抑制剂，其来源于灵芝，由于灵芝酸具有多种作用位点，即可以抑制MDM2表达也可以刺激P53的表达，而且对正常细胞低毒，对肿瘤细胞表现出更高的活性，因此本发明的一种P53- MDM2相互作用的抑制剂可以促进肿瘤细胞的凋亡，特别是对促进表达P53蛋白的95-D肺癌细胞和不表达P53蛋白的H1299肺癌细胞的凋亡效果非常明显。

附图说明  

图1、浓度分别为8.5μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml的GA-T对表达P53蛋白的95-D肺癌细胞和不表达P53蛋白的H1299肺癌细胞的细胞毒性情况；

图2、浓度16μg/ml、80μg/ml的GA-Me分别对表达P53蛋白的95-D肺癌细胞和不表达P53蛋白的H1299肺癌细胞处理5min、13min、19min、25min、37min后，对两种肺癌细胞抑制作用情况；

图3、GA-X、GA-Me、GA-Y、GA-T、GA-F对表达P53蛋白的95-D肺癌细胞和不表达P53蛋白的H1299肺癌细胞凋亡的影响；

图4、GA-X、GA-Me、GA-Y、GA-T、GA-F对表达P53蛋白的95-D肺癌细胞中MDM2的活性的影响。

具体实施方式

下面通过实施例并结合附图对本发明内容作进一步阐述，但并不限制本发明的保护范围。

本发明的各实施例中所用的原料、试剂等如无特别说明均为市售。

实施例1

GA-T对表达P53蛋白的95-D肺癌细胞和不表达P53蛋白的H1299肺癌细胞的毒性作用

取4份GA-T，纯度大于99%，用DMSO（二甲基亚砜，分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司）分别稀释成浓度为8.5μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml。

采用噻唑蓝（以下简称MTT，分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司）快速比色法测定上述四种不同浓度的GA-T对2种表达P53蛋白的95-D肺癌细胞和不表达P53蛋白的H1299肺癌细胞的毒性作用。

分别将对数生长期细胞（10⁶cell.ml^-1）接种于96孔培养板，每孔0.2ml，然后分别加入上述四种不同浓度的GA-T处理，每浓度平行4孔，每孔中的DMSO最终浓度小于0.1%，对照组加等量体积的RPMI1640细胞培养液（赛业苏州生物科技有限公司），置于37℃，5% CO₂及饱和湿度的培养箱中培养1-4天，实验终止前4h每孔加入10μl 浓度为5mg/ml的 MTT水溶液，培养结束后每孔加入150μl 浓度为0.04N 的DMSO，振荡10 min，待MTT还原产物完全溶解，用BioRad 550型酶标仪，以550nm为实验波长测定其吸收度，计算GA-T对细胞的抑制率，然后以灵芝酸GA-T浓度为横坐标，细胞的抑制率为纵坐标作图，确定细胞的半数抑制浓度（IC50）。实验结果如图1所示，从图1中可以看出GA-T具有抑制表达P53蛋白的95-D肺癌细胞和不表达P53蛋白的H1299肺癌细胞增殖的作用，但表达P53蛋白的95-D肺癌细胞对GA-T更敏感，比不表达P53蛋白的H1299肺癌细胞的毒性作用要高3.3倍。由此表明灵芝酸GA-T可以通过刺激P53诱导增殖抑制。

实施例2

不同浓度和时间的GA- Me处理对表达P53蛋白的95-D肺癌细胞和不表达P53蛋白的H1299肺癌细胞的抑制作用

GA-Me纯度大于99%，用DMSO稀释成所需浓度。采用噻唑蓝（MTT）快速比色法测定GA-Me对表达P53蛋白的95-D肺癌细胞和不表达P53蛋白的H1299肺癌细胞的毒性作用。

将对数生长期的表达P53蛋白的95-D肺癌细胞和不表达P53蛋白的H1299肺癌细胞（106cell.ml-1）接种于96孔培养板，每孔0.2ml，两种不同的细胞中分别加入终浓度为16μg/ml、80μg/mlGA-Me，每个浓度平行4孔，每孔中的DMSO最终浓度小于0.1%，对照组加等量体积的RPMI1640细胞培养液（赛业苏州生物科技有限公司），置于37℃，5%CO2及饱和湿度的培养箱培养2天，实验终止前4h每孔加入10μl 浓度为5mg/ml的 MTT水溶液，培养结束后每孔加入150μl 浓度为0.04N 的DMSO，振荡10 min，待MTT还原产物完全溶解，用BioRad 550型酶标仪，以550nm为实验波长测定其吸收度，计算灵芝酸GA-Me对细胞的抑制率，并以灵芝酸GA-Me的不同浓度对表达P53蛋白的95-D肺癌细胞和不表达P53蛋白的H1299肺癌细胞的抑制率作图，结果见图2所示，从图2中可以看出GA-Me对表达P53蛋白的95-D肺癌细胞和不表达P53蛋白的H1299肺癌细胞两种肺癌细胞均具有增殖抑制作用，但对表达P53蛋白的95-D肺癌细胞比不表达P53蛋白的H1299肺癌细胞的毒性作用要强，且短时间内就可产生较大的抑制。由此表明GA-Me可以通过刺激P53诱导增殖抑制。

实施例3

GA-X、GA-Me、GA-Y、GA-T、GA-F诱导表达P53蛋白的95-D肺癌细胞和不表达P53蛋白的H1299肺癌细胞的凋亡作用

对数生长期表达P53蛋白的95-D肺癌细胞和不表达P53蛋白的H1299肺癌细胞培养4h后，经DMSO稀释而成50μg/mL的上述GA-X、GA-Me、GA-Y、GA-T、GA-F分别充分作用8h后，经胰蛋白酶消化，分别离心收集表达P53蛋白的95-D肺癌细胞和不表达P53蛋白的H1299肺癌细胞 (1500 rpm × 10min)，PBS（氯化钠(NaCl),8g/L;氯化钾(KCl),0.2g/L;磷酸氢二钠(Na2HPO4),1.44g/L;磷酸二氢钾(KH2PO4),0.24g/L,调pH 7.4,高压蒸汽灭菌，室温保存）洗涤两遍，以PBS调整表达P53蛋白的95-D肺癌细胞和不表达P53蛋白的H1299肺癌细胞浓度分别为106个/mL,分别加入RNase，终浓度为100U/mL,37℃保温30min,加入AnnexinV和PI，终浓度为50μg/mL，在常温下暗反应30min,然后200目滤膜过滤，经流式细胞仪分析凋亡，每次记录1000－1500个细胞，结果见图3所示，从图3中可以看出 GA-X、GA-Me、GA-Y、GA-T、GA-F均可诱导表达P53蛋白的95-D肺癌细胞和不表达P53蛋白的H1299肺癌细胞的凋亡，且对表达P53蛋白的95-D肺癌细胞凋亡的诱导效果更好。

实施例4

GA-X、GA-Me、GA-Y、GA-T、GA-F抑制95-D肺癌细胞中MDM2的活性的影响

对数生长期95-D肺癌细胞培养4h后，经DMSO稀释而成0，50μg/mL的上述各种灵芝酸分别充分作用8h后，经胰蛋白酶消化，离心收集95-D肺癌细胞(1500rpm ×10min)，使用细胞裂解液裂解细胞，收集蛋白样品，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术研究所）测定每个蛋白样品的蛋白浓度，保证后续电泳的蛋白上样量一致。

配制15%SDS-PAGE凝胶，在蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（北京奥博来科技有限责任公司），沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE凝胶加样孔内。电泳时在上层胶时使用80V低电压恒压电泳，下层胶时使用120V高电压恒压电泳，时间为90-120min。电泳后切胶，转膜，选用PVDF膜，转膜电流为300-400mA，转膜时间为30-60min。转膜完毕后洗涤去除膜上的转膜液，加入封闭液，在摇床上缓慢摇动，室温封闭60min。

参考鼠抗人MDM2一抗的说明书（上海信裕生物科技有限公司），按照适当比例用一抗稀释液稀释，立即加入稀释好的一抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育1h。回收一抗。加入洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10min，吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10min，共洗涤3次。

参考二抗的说明书（上海信裕生物科技有限公司），按照适当比例用二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育1h，回收二抗。加入洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10min。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10min，共洗涤3次。

蛋白检测采用化学发光法，通过检测仪检测光密度，与阴性对照比，确定抑制率，结果如图4所示，从图4中可以看出，GA-X、GA-Me、GA-Y、GA-T、GA-F抑制了95-D肺癌细胞中MDM2的表达，从而抑制了P53蛋白的降解，进一步诱导95-D肺癌细胞的凋亡。

综上所述，本发明的一种P53-MDM2相互作用的抑制剂，具有显著地抑制人恶性肺癌肿瘤细胞中MDM2的表达，从而具有抑制P53蛋白降解的功能，因此P53-MDM2相互作用的抑制剂可以促进含有P53的肿瘤细胞凋亡。

以上所述仅是本发明的实施方式的举例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种P53-MDM2相互作用的抑制剂，其特征在于所述的P53-MDM2相互作用的   抑制剂为灵芝酸X、灵芝酸Me、灵芝酸Y、灵芝酸T或灵芝酸F；

       或灵芝酸X、灵芝酸Me、灵芝酸Y、灵芝酸T、灵芝酸F中之一与药理学上允许的添加成分组合而成的组合物。

2.如权利要求1所述的P53-MDM2相互作用的抑制剂，其特征在于所述的药理学上允许的添加成分为药物上可接受的盐类或酯类。

3.如权利要求1或2所述的P53-MDM2相互作用的抑制剂在促肿瘤细胞凋亡中的应用。

4.如权利要求1或2所述的P53-MDM2相互作用的抑制剂在促肺癌肿瘤细胞凋亡中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其中所述的肺癌肿瘤细胞为表达P53蛋白的95-D肺癌细胞或不表达P53蛋白的H1299肺癌细胞。