CN110585233B - 一种抗肿瘤组合物及其制药用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种具有协同增效作用的抗肿瘤组合物及其制药用途，所述抗肿瘤组合物包含党参提取物和印楝提取物，所述党参提取物选自党参多糖，所述印楝提取物选自印楝素，二者的摩尔比为10:3～20。实验结果表明本发明提供的中药组合物组分之间具有协同增效功能，可有效抑制PTC‑1细胞增殖与诱导肿瘤细胞凋亡，同时本发明的中药组合物原料来源广泛，可以方便的和药学载体制成多种剂型，临床上服用方便。所制备得到的党参提取物有效成分含量高，杂质少，与印楝素复配后且具有吸收快、能迅速发挥药效，临床上用量少的优点，且工艺稳定，适合工业化大规模生产。

Description

一种抗肿瘤组合物及其制药用途

技术领域

本发明涉及一种中药组合物，特别是涉及一种具有抗甲状腺癌活性的中药组合物及其制药用途。

背景技术

肿瘤(Tumor)是机体在各种致癌因素作用下，局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的新生物。一般认为，肿瘤细胞是单克隆性的，即一个肿瘤中的所有细胞均是一个突变的细胞的后代。一般将肿瘤分为良性和恶性两大类。所有的恶性肿瘤总称为癌症(cancer)。瘤细胞具有异常的形态、代谢和功能，并在不同程度上失去了分化成熟的能力。肿瘤生长旺盛，并具有相对的自主性，即使致瘤因素已不存在，仍能持续性生长，肿瘤细胞的遗传异常可以传给子代细胞。每个肿瘤细胞都含有引起其异常生长的基因组的改变。肿瘤性增生不仅与机体不协调，而且有害。非肿瘤性增生一般是多克隆性的。增生的细胞具有正常的形态、代谢和功能，能分化成熟，并在一定程度上能恢复原来正常组织的结构和功能。非肿瘤性增生有一点的限度，增生的原因一旦消除后就不再继续。非肿瘤性增生或者反应性增生有的属于正常新陈代谢所需的细胞更新；有的是针对一定刺激或损伤的防御性、修复性反应，对机体有利。由于目前仍没有理想治疗肿瘤药物，所以全世界每年都有大量人群死于癌症。

恶性肿瘤的形成是一个长期的多因素形成的分阶段的过程，要使细胞完全恶性转化，需要多个基因的转变，包括几个癌基因的突变和两个或更多肿瘤抑制基因的失活，以及凋亡调节和DNA修复基因的改变。在中药中，在癌的名称出现之前，中医中典中称之为恶肿。50年代前：主要以草药、单方、验方治疗肿瘤，如黄芪、猪苓、白花蛇舌草、半枝莲、苦参等。70年代：应用配方及复方治疗肿瘤，同时出现中成药“斑蝥”、“鸦胆子油”作为肿瘤辅助药物开始用于肿瘤领域，开启中西医结合时代。90年代：提取灵芝、樟芝、灰树花、姬茸菌类的有提高人体免疫力的成分，通过调节免疫力来抗肿瘤。21世纪：重新对中药配方抗癌的机理进行深入研究，提取配方中每一种药材的有效成分进行组方，形成西药成份的中药式配方，开辟中医生物疗法全新医学理论。近年来，生物疗法日趋成熟，将药物多种有效抗癌成份和固本扶正的免疫调节成分，用中药配方理论成功结合，这是中西智慧的融汇，多基因靶向生物制药生命金春肠溶胶囊是该类药品的典范。中医认为癌症的起因首先是人体内阴阳平衡，组织细胞在不同的致癌因素长期作用下，细胞突变而引起的，它的主要表现在组织细胞异常和过度的增生。其实癌组织也是人体的一部分，只有在人本阴阳平衡失调，五行生克乘侮发生变化的前提下，人体的免疫监控系统才会对其失去监控，任其发展。久而久之，癌细胞日益增殖，肿瘤队伍日益壮大，最后侵蚀周围正常组织，消耗大量能量和营养，影响人体的正常生理代谢，造成机体逐渐衰竭，最终导致死亡。以中医整体辩证理论为基础、结合针灸理论、癌康诱导理论、免疫抗癌理论、物理医学理论，它是一种抗癌、保命与治本相结合和治疗方法。以改善肿瘤间质细胞功能而抗癌，(即：使本来对肿瘤间质细胞起支持和营养作用的肿瘤间质转变成对肿瘤实质细胞起拮抗和抑制作用的间质细胞，癌细胞失去生存环境而灭亡)；以调理气血、调整阴阳平衡、维持正常生命体征而保命；以培补正气、产生抗体，清理"毒源"而治本。适合中医治疗肿瘤的患者：1、早期肿瘤患者，未转移者。2、不适于手术、放疗、化疗及患者不愿意西医治疗者3、晚期癌痛西药无效者。4、已经接受手术、放疗、化疗的患者需要中医减轻并发症及辅助治疗。在西药中，“癌”第一次出现在相关著作中是1107年。1943年，Gilman用“氮芥”治疗淋巴瘤，揭开了现代肿瘤化疗的序幕。1948年Farber用叶酸类似物MYX治疗ALL获得缓解。1957年，Arnold合成CTX。Duschinsky合成5-Fu。1971年：雌激素抑制“三苯氧胺”的诞生，标志着乳腺癌可通过内分泌调控进行辅助或预防性治疗。顺铂和阿霉素应用于临床，使化疗从姑息性向根治性明白迈进。1989年：化疗药物“多西紫杉醇”诞生。虽然其毒性较大，但疗效明显提高。1995年：口服化疗药物“希罗达”在瑞典研究成功。该药物在抑杀癌细胞的同时使正常细胞也遭到不同程度的破坏，但使用更加方便。2000年：单靶向药物“易瑞沙”、“特罗凯”的出现，使药物对癌细胞的抑杀作用有了一定的针对性，这标志着靶向药物治疗肿瘤的开始。

纵观恶性肿瘤治疗方法的历史发展与衍变，不难看出，肿瘤外科学、肿瘤放射治疗学、肿瘤化学治疗学构成了现代肿瘤治疗学的三大支柱。三种手段互有特点，互为补充。从治疗效应看，外科手术和放射治疗都为局部治疗的方法。因此，肿瘤化学治疗专家除了重视局部肿瘤外，更多地把着眼点放在恶性肿瘤的扩散和转移上。他们对于肿瘤治疗的观点为细胞指数杀灭的观点，故强调了多疗程、足剂量的用药方法，以期能彻底杀灭绝大部分的肿瘤细胞。药物化疗在延长肿瘤患者生命以及提高他们的生活质量方面具有肯定、积极和不可替代的作用，寻找结构新颖而又安全有效的抗肿瘤药物已成为当今肿瘤研究的热点。目前临床上常用的抗肿瘤药物主要为细胞毒类药物，这些抗癌药具有难以避免的选择性差、毒副作用大、易产生耐药等缺点。

甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤，约占人类所有癌症类型的1％，在过去的几十年里，全世界甲状腺癌的发病率持续增加，而甲状腺癌的死亡率。一直保持相对稳定。据报道，近30年来，不论碘盐消费的保健和普及程度如何，中国甲状腺癌的发病率仍然不断上升。2017年中国肿瘤登记数据显示，2013年全国甲状腺癌发病率为10.16/10万，男性4.72/10万，女性15.6/10万。与其他恶性肿瘤相比，尽管甲状腺癌不是那么致命的癌症形式，但甲状腺癌的社会和经济影响并不是微不足道的。仅在2013年，美国1985年以后确诊的高分化型甲状腺癌患者的估计总体社会成本就高达16亿美元。在中国，2013年由于甲状腺癌导致过早死亡的残疾调整生命年(DALY)和寿命损失年(YLL)分别为13.35万人/年和1.142万人/年。许多因素涉及甲状腺致癌，如遗传突变、环境因素、生活方式、肥胖和电离辐射等。目前，甲状腺全切除术和颈淋巴结清扫术，联合术后放射性碘治疗是甲状腺癌治疗的主要手段，而化疗的价值非常有限。甲状腺手术常引起相关的并发症，例如甲状旁腺及喉返神经、喉上神经损伤风险，严重影响患者的生活质量。甲状腺癌的诊断以及终身甲状腺激素补充或替代治疗给患者带来了沉重的经济负担；继发性恶性肿瘤的风险增加和癌症复发的诊断也给患者带来了心理负担。因此，寻找降低甲状腺癌发病率的化学预防剂具有重要意义。

据统计，我国主要的恶性肿瘤主要是甲状腺癌、胃癌、肺癌等其他十余种癌症类疾病，在全部新发病例中约占75％。其中最常见的内分泌恶性肿瘤是甲状腺癌，每年发病率都在不断的增长。甲状腺癌的发病机制尚没有完全阐明，例如碘的摄入、遗传因素、放射线接触、其他如性激素等都可能与甲状腺癌的发生有关，己经严重影响到了人类健康安全，特别是对于女性来说，越来越成为影响健康的恶性肿瘤类疾病，能够寻找到并采取积极正确而有效的治疗方案己成为当务之急。甲状腺癌有四种组织学类型，乳头状甲状腺癌和滤泡性甲状腺癌为分化型甲状腺癌，约占甲状腺恶性肿瘤90％以上。分化型甲状腺癌一般可以治愈的，较为常见。末分化甲状腺癌恶性程度最高，且死亡率极高。因此，对于甲状腺癌的发病机制进行深入的探讨和研究，有助于我们能够对于甲状腺癌进行更早的诊断，以及根据发病机制而开发的更加全面而有效的治疗新方案，从而以期进一步改善甲状腺癌患者的生活质量，最终达到较稳定和优良的预后随访结果，降低甲状腺癌类疾病的死亡率。

对于大多数肿瘤来说基因的突变对于肿瘤的发生和发展至关重要，基因与肿瘤的关系是通过细胞内部的相关分子信号通路对于细胞产生作用，影响功能蛋白分子发生改变，使得细胞的增殖发生变化，细胞的生物学特性及形态学改变，最终产生肿瘤。研究表明miR-21参与多种肿瘤的发生和生长。抑癌基因磷酸酶与张力蛋白同源物基因(PTEN)通过Akt去磷酸化抑制肿瘤，而PTEN是miR-21的靶基因。甲状腺未分化癌(Anaplasticthyroidcarcinoma,ATC)靶向治疗最有效的药物类别是紫杉醇(紫杉醇或多西紫杉醇)、苯酮类和铂类(顺铂或卡铂)，但存在着来源不易制备或成本较高或毒副作用较大等问题。印楝素(azadirachtin)是从楝科(Meliaceae)植物印楝Azadirachta indica A.Juss分离得到的柠檬素类(1imonoids)四环三萜类化合物，最早用于杀虫。印楝的根、树干、树皮、树叶、花、果实和种子等都富含印楝素，是农药、医药、饲料、土壤改良剂等产业的中药原料。党参为桔梗科植物桔梗科植物党参Codonopsis pilosuld(Franch.)Nannf、素花党参Codonopsis pilosuld Nannf.var.modesta(Nannf)L.T.Shen或川党参Codonopsistangshen Oliv.的根，党参含有多糖、酚类、甾醇、挥发油、皂苷及微量生物碱等成分，它具有抗溃疡、调整胃肠功能、强心、抗休克、增强造血的功能。此外，研究发现党参多糖具有抗肿瘤的作用，研究表明党参提取物可抑制肿瘤细胞的增生，同时毒副作用弱，故经过研究，在未来很有可能应用其抗癌的良好作用，制成具有很好抗癌效果的植物活性药物，可能是治疗人甲状腺癌乳头状细胞(papillary thyroid carcinoma-1，PTC-1)的一种有前景的替代药物。

发明内容

鉴于目前临床上常用的抗肿瘤药物主要为细胞毒类药物，这些抗癌药具有难以避免的选择性差、毒副作用大、易产生耐药、不易制得或成本较高等缺点，本发明的目的在于提供一种由党参多糖和印楝素组合而成的、具有协同增效作用的抗肿瘤组合物，用于制备抗肿瘤药物。特别是治疗甲状腺癌的药物。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种抗肿瘤组合物，所述抗肿瘤组合物包含党参提取物和印楝提取物。

优选地，所述党参提取物选自党参多糖，所述印楝提取物选自印楝素，所述印楝素的CAS号为11141-17-6。

优选地，所述党参多糖和印楝提取物的摩尔比为10∶3～20。

优选地，所述党参多糖和印楝素提取物的摩尔比为10∶5～10。

优选地，所述党参多糖的制备方法为：取一定量的党参药材，除去杂质和霉变物，清水冲洗、烘干；切碎，将党参切成3～5cm的段放入煮缸煎煮，加入6倍体积的环己烷，加热回流5h，弃去提取液，再加入6倍体积的环己烷，再加热回流5h，弃去提取液，剩余的滤渣挥干溶剂；取500g滤渣，以蒸馏水为提取溶剂，在提取温度为85℃，料液重量比为1∶10，提取时间为2h的条件下回流提取2次，合并提取液，经3500rpm离心10min，60℃减压浓缩至2000mL，加入4倍体积的无水乙醇过夜，沉淀多糖，干燥至恒定质量即得粗多糖样品；将粗多糖样品用浓度5％三氯乙酸溶解，3500rpm离心，上清液浓缩成稠浸膏，用无水乙醇洗涤2次，3000rpm离心，留沉淀物，将沉淀物减压干燥，即得精制党参多糖。

优选地，所述印楝提取物还包括其药学上可接受的盐、溶剂合物和水合物。

优选地，所述肿瘤选自甲状腺癌，乳腺癌，膀胱癌，宫颈癌，直肠癌，食管癌，头颈部癌，肝癌，肺癌，黑素瘤，骨髓瘤，成神经细胞瘤，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，肾癌，晚期肾细胞癌，肉瘤，皮肤癌，胃癌，睾丸癌，甲状腺癌，子宫癌，间皮瘤，胆管细胞癌，平滑肌肉瘤，脂肪肉瘤，鼻咽癌，神经内分泌癌，卵巢癌，肾癌，唾液腺癌。

优选地，所述肿瘤为甲状腺癌。

进一步地，本发明提供一种具有抗肿瘤作用的药物制剂，包括前述的的抗肿瘤组合物和药剂学的常规辅料，该药物制剂的剂型为药剂学领域的常规剂型。

同时，本发明还提供了前述的抗肿瘤组合物在制备抗癌药物中的应用。

本发明所述药学上可接受的盐包括不同酸加成盐，如下列无机酸或有机酸的酸加成盐：盐酸，氢溴酸，磷酸，硫酸，甲磺酸，对甲苯磺酸，三氟乙酸，枸杞酸，马来酸，酒石酸，富马酸，柠檬酸，乳酸。

所述药学上可接受的盐还包括不同碱金属盐(锂，钠，钾盐)，碱土金属盐(钙，镁盐)及铵盐，和能提供生理上可接受的阳离子的有机碱的盐，如甲胺，二甲胺，三甲胺，哌啶，吗啉及三(2-羟乙基)胺的盐。在本发明范围内的所有这些盐都可采用常规方法制备。

本发明还涉及以本发明组合物作为活性成份的药物组合物。该药物组合物可根据本领域公知的方法制备。可通过将本发明组合物与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂和/或辅剂结合，制成适于人或动物使用的任何剂型。本发明组合物在其药物组合物中的含量通常为0.1-95重量％。

本发明组合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括o/w型、w/o型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。

本发明组合物可以制成普通制剂、也制成是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。

为了将本发明组合物制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。

还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

为了将给药单元制成胶囊剂，可以将有效成分本发明组合物与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明药物组合物先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备本发明药物组合物片剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备本发明药物组合物的胶囊剂。

为将本发明药物组合物制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二醇或它们的混合物作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、pH调剂剂、渗透压调节剂。增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；pH调剂剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其它添加剂。

为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。

本发明药物组合物的给药剂量依照所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的个体情况，给药途径和剂型等可以有大范围的变化。一般来讲，本发明药物组合物的每天的合适剂量范围为0.001-150mg/Kg体重，优选为0.01-100mg/Kg体重。上述剂量可以一个剂量单位或分成几个剂量单位给药，这取决于医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。

本发明的药物组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。当本发明的药物组合物与其它治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整它的剂量。

如上所述，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明提供的具有抗甲状腺活性的中药组合物具有很好的抑制甲状腺癌细胞生长。

(2)本发明提供的中药组合物的组分之间具有协同增效作用，可有效抑制PTC-1细胞增殖与诱导肿瘤细胞凋亡。

(3)本发明的中药组合物来源广泛，可以方便的和药学载体制成多种剂型，临床上服用方便。得到的提取物有效成分含量高，杂质少，且具有吸收快、能迅速发挥药效，临床上用量少的优点，且工艺稳定，适合工业化大规模生产。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，本发明人提供了下述的实施例，然而，这些实施例仅仅是作为说明性的目的而给出的，并且不解释为对本发明的限制，因为其中许多变化是可能的，而不脱离本发明的主旨和范围。本发明的组合物和方法虽然在特定实施方案加以描述，但所属技术领域的技术人员显而易见，可使所述组合物或/和方法的步骤或步骤的顺序发生变化，但不偏离本发明的概念和范畴。更具体来说，显而易见的在化学上和生物学上相关的其他药理过程类似的药物可以取代本文所述的药物，同时达到相同或相似的效果。所述技术领域的技术人员显而易见的对所有这种相似的替换或修饰都应被认为在本发明的范畴和概念内。

实施例1

党参多糖的提取：

党参干药材购自山东济南漱玉平民大药房，经山东大学药学院生药学教研室鉴定为桔梗科植物党参Cdoonopisis pilosula(Famch.)Nannf的干燥根。

党参多糖的制备方法为：取一定量的党参药材，除去杂质和霉变物，清水冲洗、烘干；切碎，将党参切成3～5cm的段放入煮缸煎煮，加入6倍体积的环己烷，加热回流5h，弃去提取液，再加入6倍体积的环己烷，再加热回流5h，弃去提取液，剩余的滤渣挥干溶剂；取500g滤渣，以蒸馏水为提取溶剂，在提取温度为85℃，料液重量比为1∶10，提取时间为2h的条件下回流提取2次，合并提取液，经3500rpm离心10min，60℃减压浓缩至2000mL，加入4倍体积的无水乙醇过夜，沉淀多糖，干燥至恒定质量即得粗多糖样品；将粗多糖样品用浓度5％三氯乙酸溶解，3500rpm离心，上清液浓缩成稠浸膏，用无水乙醇洗涤2次，3000rpm离心，留沉淀物，将沉淀物减压干燥，即得精制党参多糖。

所得精制党参多糖为白色粉末状物质，无味，溶解于水，不溶于乙醇、丙酮等有机溶剂，

取精制党参多糖2.0mg与KBr混合研磨均匀后压片，使用红外光谱扫描仪(品牌型号为Thermo IS50)在4000～400cm^-1波数范围内、分辨率16，进行扫描，记录扫描图谱。精制党参多糖组分在3417cm^-1处有一吸收强度较大的峰，是多糖特征的OH的伸缩振动峰，由糖分子内或分子间氢键OH伸缩振动引起的吸收；2930cm^-1附近的吸收峰为次甲基(-CH2)中CH的伸缩振动的吸收峰；1633cm^-1附近的吸收峰为C＝O伸缩振动峰；1056cm^-1附近的吸收峰，此为醇羟基的变角振动；923cm^-1的吸收，此吸收为吡喃糖环醚键(-C-O-C-)的非对称伸缩振动，为甘露糖的特征吸收。由红外图谱可知精制党参多糖具有明显的糖类化合物的特征。

将党参多糖样品溶解，测定其水溶液在波长260nm(核酸)和280nm(蛋白质)处吸光度，在波长280nm和260nm处无明显吸收，表明蛋白质和核酸含量很低或者没有。

用本领域常用的苯酚-硫酸法测党参多糖的含量，测得党参中多糖含量为86.12％，RSD＝1.28％(n＝3)。

实施例2

党参多糖的制备方法如实施例所述，印楝素购自SigmaAldrich公司。

将党参多糖和印楝素分别用二甲亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)配制成100μM的储备液，小量分装，-20℃贮存备用，临用时用相应细胞培养液稀释到所需终浓度。配制终浓度如下表所示(μM)：

表1实验室配制的党参多糖与印楝素组合物溶液

1.细胞培养：PTC-1细胞的培养按照本领域常规方法进行培养。

2.选用对数生长期的PTC-1细胞，用胰酶消化后，用含小牛血清的RPMI1640培养基配成细胞悬液，接种在培养板中，每孔接种1mL，37℃，5％CO₂培养箱中培养24h。

3.实验组换新的含不同浓度被测药品的培养基，对照组则换含等体积溶剂的培养基，每组设5平行孔，每孔中药物溶剂(DMSO或水)的体积不超过1％总体积。每个浓度设5个复孔，37℃，5％CO₂培养3～5天。

台盼蓝排染法检测药物抗癌活性：药物作用后，胰蛋白酶与EDTA(1∶1)消化细胞，1000rpm离心10min，弃上清，收集细胞，每孔加入500μL 2％台盼蓝染液，普通光学显微镜下血球计数板计数，着色细胞为死亡细胞。选取任意视野中的500个细胞分别计数死亡细胞数和存活细胞数。按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率：

肿瘤细胞生长抑制率％＝死亡细胞数/总细胞数×100％。

实验分空白对照组(control)、党参多糖组(codonopsis)、印楝素组(azadirachtin)、党参多糖和印楝素组(Cod/Aza)，采用不同浓度党参多糖和印楝素单独或混合作用于不同的PTC-1细胞株，通过台盼蓝排染法检测抗肿瘤药物的细胞毒作用，并计算出肿瘤细胞生长抑制率。结果表明，不同浓度的Cod单药使用有一定程度的抑制肿瘤细胞生长作用，且呈浓度依赖效应，而Aza单药对PTC-1细胞的抑制作用不明显。

具体数值如表2中所示，表中Codonopsis列是单独使用Codonopsis的不同浓度：2μM-14μM对PTC-1细胞生长抑制率为4.8％-25.8％，表中Azadirachtin列是单独使用Azadirachtin的不同浓度0.5μM-15μM对PTC-1细胞生长抑制率分别为5.3％-5.7％。最后一列是Cod和Aza联合作用于PTC-1时，当Cod浓度为10μM、Aza浓度为5μM时抑制率为99.6％。党参多糖和印楝素混合处理可明显抑制肿瘤细胞的生长，与单用药物相比，具有协同增效作用。

表2 Cod和Aza单独使用和联合使用对PTC-1增殖的抑制率

	Control	Codonopsis	Azadirachtin	Cod-Aza
					药物浓度(μM)	0	2	0.5	10:0.5
生长抑制率(％)	5.1±0.5	4.8±1.2	5.3±0.3	48.4±2.4
					药物浓度(μM)	0	4	1	10:1
生长抑制率(％)	5.1±0.5	4.9±1.0	5.6±0.2	71.3±2.1
					药物浓度(μM)	0	8	3	10:3
生长抑制率(％)	5.1±0.5	16.0±1.1	5.7±0.3	84.5±1.5
					药物浓度(μM)	0	10	5	10：5
生长抑制率(％)	5.1±0.5	24.0±2.4	5.6±0.5	99.6±0.2
					药物浓度(μM)	0	12	10	10:10
生长抑制率(％)	5.1±0.5	25.3±2.1	5.6±0.5	99.5±0.5
					药物浓度(μM)	0	14	15	10:15
生长抑制率(％)	5.1±0.5	25.8±0.6	5.7±0.3	99.0±1.3

注：Cod-Aza复配联合用药时的药物浓度，以10:10为例，是指药物的浓度均为10μM。

从表中可以计算得知，Cod组、Aza组及Cod-Aza组PTC-1细胞生长抑制率显著高于Control组，差异具有统计学意义(P均＜0.05)；Cod-Aza组PTC-1细胞生长抑制率显著高于Cod组和Aza组，差异具有统计学意义(P均＜0.05)。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (2)

1.一种抗肿瘤组合物，其特征在于，所述抗肿瘤组合物包含党参多糖和印楝素；

所述党参多糖的制备方法为：取一定量的党参药材，除去杂质和霉变物，清水冲洗、烘干；切碎，将党参切成3～5cm的段放入煮缸煎煮，加入6倍体积的环己烷，加热回流5h，弃去提取液，再加入6倍体积的环己烷，再加热回流5h，弃去提取液，剩余的滤渣挥干溶剂；取500g滤渣，以蒸馏水为提取溶剂，在提取温度为85℃，料液重量比为 1∶10，提取时间为2h的条件下回流提取2次，合并提取液，经3500 rpm离心10min，60℃减压浓缩至2000mL，加入4倍体积的无水乙醇过夜，沉淀多糖，干燥至恒定质量即得粗多糖样品；将粗多糖样品用浓度5%三氯乙酸溶解，3500rpm离心，上清液浓缩成稠浸膏，用无水乙醇洗涤2次，3000rpm离心，留沉淀物，将沉淀物减压干燥，即得精制党参多糖；

所述党参多糖和印楝素的摩尔比为10:5~10；

所述肿瘤选自甲状腺癌。

2.权利要求1所述的抗肿瘤组合物在制备抗甲状腺癌药物中的应用。