CN101418325B - 桦褐孔菌胞内外混合多糖及其制备方法和药物用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种桦褐孔菌胞内外混合多糖及其制备方法和药物用途，属于医药领域。无菌条件下取斜面菌种接入新鲜的综合固体培养基的平皿内，经过一级发酵、二级发酵，将二级发酵产物进行抽滤，得到桦褐孔菌的菌丝体和发酵液；经过浓缩、水提醇沉得桦褐孔菌胞内外混合多糖。本发明利用液体深层发酵所得的发酵产物中，同样含有药用活性成分，其生长周期短，可以成为获取活性成分的一种有效手段。本发明经过实验，从桦褐孔菌菌丝体及其发酵液中提取得到混合粗多糖，并对其抗肿瘤活性进行了研究，得出桦褐孔菌胞内外混合多糖具有高抑瘤活性和低毒性的特征。

Description

桦褐孔菌胞内外混合多糖及其制备方法和药物用途

技术领域

本发明属于医药领域。

背景技术

桦褐孔菌Inonotus obliquus，国内还称为桦癌褐孔菌、斜生纤孔菌。也称Phaeoporus obliquus，Fuscoporia obliqua，Chaga，Black birchtinder(tuchwood)，birch mushroom，Kabanoanoanatake等。属担子菌亚门(Basidiomycotina)、层菌纲(Hymenomycetes)、非褶菌目(Aphyllophorales)、刺革菌科(Hymenoehaetaeeae)。

桦褐孔菌的形态：它的子实体呈现瘤状(不育性的块状物)，直径25～40cm，深色，表面深裂，很硬，干时脆。孢子阔椭圆状至卵状，光滑，有刚毛(setae)。菌丝为二系菌丝系统，具有生殖菌丝和骨架菌丝。气生菌丝多为骨架菌丝，黄褐色，具有刚毛状菌丝和稀少刚毛；基内菌丝多为生殖菌丝，淡黄褐色，有隔，无锁状联合。

分布：桦褐孔菌的菌丝体极其耐寒是生长在寒带的木腐菌，生于白桦、银桦、榆树、赤杨等活立木的树皮下或砍伐后树木的枯干上，并能引起白桦、银杨、榆树、赤杨的白腐。其主要分布在北半球北纬45°～50°的地区，如北美(北部)、芬兰、波兰、俄罗斯(西西伯利亚、远东部分地区、勘察加半岛)、中国(黑龙江、吉林省长白山地区)、日本(北海道)等国家生境。

化学成分：关于桦褐孔菌化学成分的研究已有许多报道，主要含有羊毛脂烷型三萜类、木质素类、黑色素类等。Lovyagina等最早从桦褐孔菌中得到一种含叶酸衍生物——蝶酰谷氮酸，以及芳香物质：香草酸、丁香酸和一羟基苯甲酸；1961年和1962年Ludwiczalkt和Wrzclono分别报道从该菌中分离得到桦褐孔菌醇。Ichimura T还发现桦褐孔菌的水提取物中含有低分子量的多酚类。

Yamaguchi T从桦褐孔菌的水提取物中得到一种水溶性的高分子量的有抑制HIV-I蛋白酶活性的木质素衍生物。何坚等还从桦褐孔菌中分离得到麦角甾醇过氧化物、鞘氨脂类似物、甘露醇。

Kukulyanslaya等发现天然的桦褐孔菌中的黑色素与人工培养的桦褐孔菌合成的黑色素的理化性质不同，并存在结构差异，规定天然合成的黑色素为异黑色素。Ichimura T等研究表明桦褐孔菌形成的黑色素属于1，1，3，4，4，6-六甲基一7一乙酰基一1，2，3，4-四氢萘吐纳麝香类，从它的碱性降解产物里鉴别得知含有P一羟苯酸。

药理作用：桦褐孔菌的主要药理作用为抗肿瘤作用，其中起主要作用的是三萜类化合物和多糖类化合物。据李英秀等报道，桦褐孔菌提取物在0.5～16.0μg/ml对胃癌MGC—803细胞株均有抑制细胞增殖作用，并显示明显的量效关系。张慧丽等研究证明桦褐孔菌多糖在1.0～16.0μg/ml范围内，对肝癌SMMC7721细胞株的增殖均有抑制，并表现出浓度依赖性关系.不同浓度间的抑制率均存在显著性差异。

Jarosz A等研究发现桦褐孔菌菌丝、菌核中的多糖有抑制细胞周期，调节酶cdc25和cdc2/cyclin B的作用。Burczy报道桦褐孔菌的菌丝体和培养基中的成分能对Hela细胞的M、G和Gz期有阻碍作用，同时有激活过氧化氢酶活性的作用，但是这两种作用之间没有必然的联系。Rzymowsk研究表明桦褐孔菌的水提取液能够抑制人类母体外子宫颈肿瘤细胞的生长，降低肿瘤细胞蛋白质数量和有丝分裂指数值，干扰肿瘤细胞新陈代谢，还影响细胞周期中的8/G阶段。此外对恶性肿瘤患者进行放疗、化疗过程中服用含有桦褐孔菌的有效成分，可增强病人的耐受性，削弱因放疗、化疗而引起的毒副作用。桦褐孔菌含有白桦脂酸，1999年韩国学者发现这种物质能抑制293型癌细胞达70％，具有很强的抗肿瘤性，且无毒副作用。

日本有关报道，桦褐孔菌对呕吐、腹泻、胃肠功能紊乱、胃及十二指肠溃疡、肝炎、胃炎和肾炎有一定的治疗作用；对因不合理的饮食而导致的骨质方面的疾病有一定的预防和治疗作用。桦褐孔菌还是血液的清洁剂和疼痛的缓解剂，对皮肤过敏也有一定的疗效。

目前，国内治疗肿瘤方面的药物很多，但在天然药物中，治疗效果很好的中药很少，未能达到扶正气，提高病人的免疫力，防复发、转移，杀灭癌细胞的作用。而桦褐孔菌正是一种能有效治疗各种癌症并能提高机体免疫力的天然药物。目前已被列入俄罗斯药典。对桦褐孔菌子实体的化学成分和药理作用的研究国外已有很多，特别是对其抗肿瘤作用的研究。但在我国桦褐孔菌的研究还处于起步阶段，大规模人工驯化还没有实现，其来源主要是靠采集野生资源，更加珍贵的是野生的品种只有在活的桦树上生长10～15年才具有很好的药用价值，并且每两万棵桦树上大约只有一棵生长着桦褐孔菌，因此野生的桦褐孔菌价格十分昂贵，这使桦褐孔菌的开发利用受到了限制。

发明内容

本发明提供一种桦褐孔菌胞内外混合多糖及其制备方法和药物用途，以解决野生的桦褐孔菌价格十分昂贵、使桦褐孔菌的开发利用受到限制的问题。本发明采取的技术方案是：它是由下列方法得到的：

一、无菌条件下取斜面菌种接入新鲜的综合固体培养基的平皿内，培养温度26-29℃，培养240-360小时；该综合固体培养基配方(g/100ml)：马铃薯16-26，葡萄糖1.2-3.2，琼脂1.5-2.5，MgSO₄0.12-0.2，KH₂PO₄0.28-0.35，VB₁0.8-1.2mg加水定溶至所需体积，PH值自然；

二、一级发酵：在无菌条件下，用6mm的打孔器菌落边缘处打孔，用接种铲取6-10块的菌饼接入含有100-150ml液体培养基的250ml摇瓶中，置于26-29℃，转速为120-185rpm/min的摇床中，恒温培养210-300小时后进行二级发酵培养；该液体培养基配方(g/100ml)：马铃薯16-26，葡萄糖1.2-3.2，MgSO₄0.12-0.2，KH₂PO₄0.28-0.35，VB₁0.8-1.2mg加水定溶至所需体积，PH值自然；

三、二级发酵：取一级发酵液接种于含有250-350ml该液体培养基的1000ml二级摇瓶中，接种量为10％-13％，置于26-29℃，转速为120-170rpm/min的摇床中，恒温培养160-240小时；

四、将二级发酵产物进行抽滤，得到桦褐孔菌的菌丝体和发酵液；将菌丝体用蒸馏水冲洗三次，置55-60℃鼓风干燥箱中烘干，称重，60目粉碎，按蒸馏水与菌丝体粉末比45-50:1置于超声仪内，48-52℃，65-75Hz超声提取40min，重复提取2-3次，合并提取液，45-55℃减压浓缩至原体积的1/5-1/10，得胞内多糖浓缩液；将发酵液45-55℃减压浓缩至原体积的1/5-1/10，并与胞内多糖浓缩液合并，加入95％乙醇，搅拌，使乙醇终浓度达到75％-80％，4℃沉淀8-12小时，收集沉淀，用无水乙醇洗涤3次，55-60℃恒温干燥，重复2～3次，得桦褐孔菌胞内外混合多糖。

本发明桦褐孔菌胞内外混合多糖在制备抗肿瘤的药物中应用。

本发明药物的活性组分可以加入制备不同剂型时所需的各种常规辅料，如崩解剂、润滑剂、粘合剂等以常规的中药制剂方法制备成任何一种常用口服剂型，如颗粒剂、丸剂、散剂、片剂、胶囊剂、口服液等。

本发明利用液体深层发酵所得的发酵产物中，同样含有药用活性成分，其生长周期短，可以成为获取活性成分的一种有效手段。本发明经过实验，从桦褐孔菌菌丝体及其发酵液中提取得到混合粗多糖，并对其抗肿瘤活性进行了研究，得出桦褐孔菌胞内外混合多糖具有高抑瘤活性和低毒性的特征。成人日服药量为0.81～1.62g/kg。

具体实施方式

试验例1，本发明桦褐孔菌胞内外混合多糖的抗肿瘤试验

试验材料，桦褐孔菌菌种，2006年购于黑龙江省伊春市食药用菌研究所；桦褐孔菌胞内外混合多糖。

阳性对照药，复方环磷酰胺片为通化茂祥制药有限公司产品，规格为每片含环磷酰胺50mg，人参茎叶总皂甙50mg，批号：070601。

动物及瘤株，昆明种小鼠，雌性，体重20±2g，6周龄，购于长春生物制品研究所，合格证编号：0006456。

瘤株：肉瘤S₁₈₀和肝癌H₂₂购于吉林省肿瘤研究所。

试验方法

取昆明种小鼠50只，在无菌条件下将接种了7d的小鼠腹水用9g/L的生理盐水以1：3的比例稀释至含肿瘤细胞数为5×10⁶cfu/只，小鼠右腋窝皮下接种(0.2mL/只)。接种24h后称重并随机分为5组，每组10只，分别为空白对照组(生理盐水)、阳性对照组——复方环磷酰胺组(30mg/kg)及桦褐孔菌胞内外混合多糖高剂量组(500mg/kg)、中剂量组(250mg/kg)、低剂量组(125mg/kg)。同时在接种24h后灌胃给药，给药体积为20mL/kg，每日1次，连续给药10d，停药后次日称重脱臼致死取瘤块，称重并计算抑瘤率。

抑瘤率＝(空白组瘤重-给药组瘤重/空白组瘤重)×100％

胸腺指数＝胸腺重/体重(mg/g)

脾系指数＝脾中/体重(mg/g)

统计学处理，SPSS12.0软件进行统计学处理，分析组间差异，试验结果用(x±s)表示。

结果

1、桦褐孔菌胞内外混合多糖对小鼠肉瘤S₁₈₀抑制作用

桦褐孔菌胞内外混合多糖的高剂量组、中剂量组和低剂量组对小鼠S₁₈₀肉瘤的抑制作用均达30％以上，且高、中、低剂量组与空白对照组比较均有极显著性差异(P<0.01)。其中低剂量组的效果最佳。参考文献将小鼠低剂量125mg/kg换算成人服用剂量为10.125mg/kg，结果详见表1。

表1  桦褐孔菌胞内外混合多糖对小鼠S₁₈₀肉瘤肿瘤抑制率及小鼠体重的影响

                      (n＝10，x±s)

注：与空白对照组比较^*P<0.05^**P<0.01

2、桦褐孔菌胞内外混合多糖对小鼠肝癌H₂₂抑制作用

桦褐孔菌胞内外混合多糖的高、中、低剂量组对小鼠肝癌H₂₂的生长均有显著的抑制作用，其抑制率均达30％以上，且呈明显量效关系，与空白组相比有极显著性差异(P<0.01)。其中高剂量组的效果最佳。参考文献将小鼠高剂量500mg/kg换算成人服用剂量为40.5mg/kg，结果详见表2。

表2  桦褐孔菌胞内外混合多糖对小鼠肝癌H₂₂肿瘤抑制率及小鼠体重的影响

                      (n＝10，x±s)

注：与空白对照组比较^*P<0.05^**P<0.01

试验例2桦褐孔菌胞内外混合多糖急毒实验

方法

经预试，无法找出100％致死量，测出LD₅₀，因此对其小鼠最大耐受量进行了试验。参照文献，取昆明种小鼠40只，雌雄各半，随机分为2组，禁食不禁水，12h后，以20g/kg.d，16g/kg.d的高，中两个剂量给药，给药体积为40ml/kg·d，一天内给药一次，隔日称重，连续观察14d，每天观察两次，记录小鼠外观，行为活动，精神状态，大、小便形状及颜色，被毛，肤色，呼吸，运动等状况。14d后将动物处死，大体解剖活检动物心、肝、脾、肺、肾、脑、胸腺、胃、肠等器官色泽、位置、质地等。

结果

小鼠，连续观察14d时间小鼠无一只死亡，其进食、饮水、行为方式、排泄等均未见异常，体重均有不同程度的增长，体重变化见表3。第15天后处死小鼠进行尸体解剖，均未有肉眼可见的病变。

表3  小鼠体重变化情况(g，x±s)

结果显示，桦褐孔菌胞内外混合多糖组小鼠最大耐受量为20g/kg。

参考文献计算得到成人最大服药量为1.62g/kg。

实施例1本发明片剂的制备

一、无菌条件下取斜面菌种接入新鲜的综合固体培养基的平皿内，培养温度26℃，培养240小时；该综合固体培养基配方(g/100ml)：马铃薯16，葡萄糖1.2，琼脂1.5，MgSO₄0.12，KH₂PO₄0.28，VB₁0.8mg加水定溶至所需体积，pH值自然；

二、一级发酵：在无菌条件下，用6mm的打孔器菌落边缘处打孔，用接种铲取6块的菌饼接入含有100ml液体培养基的250ml摇瓶中，置于26℃，转速为120rpm/min的摇床中，恒温培养210小时后进行二级发酵培养；该液体培养基配方(g/100ml)：马铃薯16，葡萄糖1.2，MgSO₄0.12，KH₂PO₄0.28，VB₁0.8mg加水定溶至所需体积，pH值自然；

三、二级发酵：取一级发酵液接种于含有250-350ml该液体培养基的1000ml二级摇瓶中，接种量为10％，置于26℃，转速为120rpm/min的摇床中，恒温培养160小时；

四、将二级发酵产物进行抽滤，得到桦褐孔菌的菌丝体和发酵液；将菌丝体用蒸馏水冲洗三次，置55℃鼓风干燥箱中烘干，称重，60目粉碎，按蒸馏水与菌丝体粉末比45:1置于超声仪内，48℃，65Hz超声提取40min，重复提取3次，合并提取液，45℃减压浓缩至原体积的1/5，得胞内多糖浓缩液；将发酵液45℃减压浓缩至原体积的1/5，并与胞内多糖浓缩液合并，加入95％乙醇，搅拌，使乙醇终浓度达到75％，4℃沉淀8小时，收集沉淀，用无水乙醇洗涤3次，55℃恒温干燥，重复2次，得桦褐孔菌胞内外混合多糖；

五、桦褐孔菌胞内外混合多糖与制备片剂的常规辅料混合，压片。

实施例2：本发明颗粒剂的制备

一、无菌条件下取斜面菌种接入新鲜的综合固体培养基的平皿内，培养温度28℃，培养300小时；该综合固体培养基配方(g/100ml)：马铃薯21，葡萄糖2.4，琼脂2.0，MgSO₄0.16，KH₂PO₄0.31，VB₁1.0mg加水定溶至所需体积，pH值自然；

二、一级发酵：在无菌条件下，用6mm的打孔器菌落边缘处打孔，用接种铲取8块的菌饼接入含有120ml液体培养基的250ml摇瓶中，置于28℃，转速为150rpm/min的摇床中，恒温培养260小时后进行二级发酵培养；该液体培养基配方(g/100ml)：马铃薯21，葡萄糖2.4，MgSO₄0.16，KH₂PO₄0.31，VB₁1.0mg加水定溶至所需体积，pH值自然。

三、二级发酵：取一级发酵液接种于含有250-350ml该液体培养基的1000ml二级摇瓶中，接种量为11％，置于28℃，转速为150rpm/min的摇床中，恒温培养200小时；

四、将二级发酵产物进行抽滤，得到桦褐孔菌的菌丝体和发酵液；将菌丝体用蒸馏水冲洗三次，置57℃鼓风干燥箱中烘干，称重，60目粉碎，按蒸馏水与菌丝体粉末比47:1置于超声仪内，50℃，70Hz超声提取40min，重复提取3次，合并提取液，50℃减压浓缩至原体积的1/7，得胞内多糖浓缩液；将发酵液50℃减压浓缩至原体积的1/7，并与胞内多糖浓缩液合并，加入95％乙醇，搅拌，使乙醇终浓度达到78％，4℃沉淀10小时，收集沉淀，用无水乙醇洗涤3次，57℃恒温干燥，重复3次，得桦褐孔菌胞内外混合多糖。

五、桦褐孔菌胞内外混合多糖与制备颗粒剂的常规辅料混合，制颗。

实施例3本发明胶囊剂的制备

一、无菌条件下取斜面菌种接入新鲜的综合固体培养基的平皿内，培养温度29℃，培养360小时；该综合固体培养基配方(g/100ml)：马铃薯26，葡萄糖3.2，琼脂2.5，MgSO₄0.2，KH₂PO₄0.35，VB₁1.2mg加水定溶至所需体积，pH值自然；

二、一级发酵：在无菌条件下，用6mm的打孔器菌落边缘处打孔，用接种铲取10块的菌饼接入含有150ml液体培养基的250ml摇瓶中，置于29℃，转速为185rpm/min的摇床中，恒温培养300小时后进行二级发酵培养；该液体培养基配方(g/100ml)：马铃薯26，葡萄糖3.2，MgSO₄0.2，KH₂PO₄0.35，VB₁1.2mg加水定溶至所需体积，pH值自然；

三、二级发酵：取一级发酵液接种于含有350ml该液体培养基的1000ml二级摇瓶中，接种量为13％，置于29℃，转速为170rpm/min的摇床中，恒温培养240小时；

四、将二级发酵产物进行抽滤，得到桦褐孔菌的菌丝体和发酵液；将菌丝体用蒸馏水冲洗三次，置60℃鼓风干燥箱中烘干，称重，60目粉碎，按蒸馏水与菌丝体粉末比50:1置于超声仪内，52℃，75Hz超声提取40min，重复提取2次，合并提取液，55℃减压浓缩至原体积的1/10，得胞内多糖浓缩液；将发酵液55℃减压浓缩至原体积的1/10，并与胞内多糖浓缩液合并，加入95％乙醇，搅拌，使乙醇终浓度达到80％，4℃沉淀12小时，收集沉淀，用无水乙醇洗涤2次，60℃恒温干燥，重复3次，得桦褐孔菌胞内外混合多糖。

五、桦褐孔菌胞内外混合多糖与制备胶囊剂的常规辅料混合，制颗粒，装入胶囊。

Claims (3)

1.一种桦褐孔菌胞内外混合多糖，其特征在于它是由下列方法得到的：

一、无菌条件下取斜面菌种接入新鲜的综合固体培养基的平皿内，培养温度26-29℃，培养240-360小时；该综合固体培养基配方g/100ml：马铃薯16-26，葡萄糖1.2-3.2，琼脂1.5-2.5，MgSO₄0.12-0.2，KH₂PO₄0.28-0.35，VB₁0.0008-0.0012加水定溶至所需体积，pH值自然；

二、一级发酵：在无菌条件下，用6mm的打孔器菌落边缘处打孔，用接种铲取6-10块的菌饼接入含有100-150ml液体培养基的250ml摇瓶中，置于26-29℃，转速为120-185rpm/min的摇床中，恒温培养210-300小时后进行二级发酵培养；该液体培养基配方g/100ml：马铃薯16-26，葡萄糖1.2-3.2，MgSO₄0.12-0.2，KH₂PO₄0.28-0.35，VB₁0.0008-0.0012加水定溶至所需体积，pH值自然；

三、二级发酵：取一级发酵液接种于含有250-350ml该液体培养基的1000ml二级摇瓶中，接种量为10％-13％，置于26-29℃，转速为120-170rpm/min的摇床中，恒温培养160-240小时；

四、将二级发酵产物进行抽滤，得到桦褐孔菌的菌丝体和发酵液；将菌丝体用蒸馏水冲洗三次，置55-60℃鼓风干燥箱中烘干，称重，60目粉碎，按蒸馏水与菌丝体粉末比45-50∶1置于超声仪内，48-52℃，65-75KHz超声提取40min，重复提取2-3次，合并提取液，45-55℃减压浓缩至原体积的1/5-1/10，得胞内多糖浓缩液；将发酵液45-55℃减压浓缩至原体积的1/5-1/10，并与胞内多糖浓缩液合并，加入95％乙醇，搅拌，使乙醇终浓度达到75％-80％，4℃沉淀8-12小时，收集沉淀，用无水乙醇洗涤3次，55-60℃恒温干燥，重复2～3次，得桦褐孔菌胞内外混合多糖。

2.如权利要求1所述的桦褐孔菌胞内外混合多糖的制备方法，包括下列步骤：

一、无菌条件下取斜面菌种接入新鲜的综合固体培养基的平皿内，培养温度26-29℃，培养240-360小时；该综合固体培养基配方g/100ml：马铃薯16-26，葡萄糖1.2-3.2，琼脂1.5-2.5，MgSO₄0.12-0.2，KH₂PO₄0.28-0.35，VB₁0.0008-0.0012加水定溶至所需体积，pH值自然；

二、一级发酵：在无菌条件下，用6mm的打孔器菌落边缘处打孔，用接种铲取6-10块的菌饼接入含有100-150ml液体培养基的250ml摇瓶中，置于26-29℃，转速为120-185rpm/min的摇床中，恒温培养210-300小时后进行二级发酵培养；该液体培养基配方g/100ml：马铃薯16-26，葡萄糖1.2-3.2，MgSO₄0.12-0.2，KH₂PO₄0.28-0.35，VB₁0.0008-0.0012加水定溶至所需体积，pH值自然；

三、二级发酵：取一级发酵液接种于含有250-350ml该液体培养基的1000ml二级摇瓶中，接种量为10％-13％，置于26-29℃，转速为120-170rpm/min的摇床中，恒温培养160-240小时；

四、将二级发酵产物进行抽滤，得到桦褐孔菌的菌丝体和发酵液；将菌丝体用蒸馏水冲洗三次，置55-60℃鼓风干燥箱中烘干，称重，60目粉碎，按蒸馏水与菌丝体粉末比45-50∶1置于超声仪内，48-52℃，65-75KHz超声提取40min，重复提取2-3次，合并提取液，45-55℃减压浓缩至原体积的1/5-1/10，得胞内多糖浓缩液；将发酵液45-55℃减压浓缩至原体积的1/5-1/10，并与胞内多糖浓缩液合并，加入95％乙醇，搅拌，使乙醇终浓度达到75％-80％，4℃沉淀8-12小时，收集沉淀，用无水乙醇洗涤3次，55-60℃恒温干燥，重复2～3次，得桦褐孔菌胞内外混合多糖。

3.如权利要求1所述的桦褐孔菌胞内外混合多糖在制备抗肿瘤的药物中的应用。