CN101912439B - 一种当归苦参提取工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明属于中药领域，公开一种当归苦参提取工艺，所述的提取工艺包括将按比例配备的当归苦参依次经过(1)固体发酵处理和(2)水提取处理，其中固体发酵处理选用鸡腿菇作为发酵菌种。本发明得到的当归苦参提取物，与普通水提取处理得到的提取物相比，具有抗炎作用更强的特点，并通过了毒理验证，安全可靠。
Description
技术领域
本发明属于中药领域，具体涉及一种当归苦参复方提取工艺。
背景技术
痤疮、湿疹为临床常见皮肤病，影响着患者的生活质量和美观。西医治疗痤疮、湿疹等皮肤病多用激素、抗生素或其它的一些消炎抑菌药，易产生过敏，肝、肾损伤，色素沉着，停药后反弹等副作用(参见王海生等主编，临床新药手册[M]，天津：天津科技出版社，2000年9月，第1版：1，434.)；而当归苦参丸是我国第一批非处方中成药，其作用缓和，毒副作用小，价格低廉，无需联合用药，是治疗这些皮肤病较理想的复方。
当归苦参丸来源于《古今医鉴》参归丸，原书记载“参归丸，治酒糟鼻，乃血热入肺”。近代医家在辨证基础上，将其广泛用于治疗血燥湿热所致的头面疮疡，粉刺疙瘩以及湿疹等疾病。但当归苦参丸多以药材原粉入药制成大蜜丸，不但服用不便，剂量大，杂质多，易霉变，而且挥发性成分易损失，质量难以控制，大大限制了其临床应用。目前，对当归苦参丸方药成分提取和剂型改革方面的研究报道很少，为此，需要开发新方法对其进行提取研究。
当归苦参方中选苦参为君，该药味苦性寒，具有清热燥湿，祛风杀虫之功。然苦参属苦燥伤阴之品，血虚生燥易加重瘙痒，故佐以当归，该药味甘辛苦，性温能养血润燥，与苦参相伍，既可防苦参性寒助湿之弊，又可用其辛散活血、补血之功，阻遏湿邪重浊粘滞之性，使之能寒温并施，寒不助湿，温不增燥，燥湿无妨补血，补血无碍燥湿，血活湿不得留滞，共奏清热活血，祛风燥湿，杀虫止痒之功。有实验研究表明：具有此类作用的复方有较强的抑制小鼠变态性接触性皮炎的作用(参见涂彩霞等，四种中药复方对小鼠实验性皮炎作用的研究[J]，中华皮肤科杂志，1998，31(4)：244.)。
现代药理研究表明：苦参碱具有明显的抑制金黄色葡萄球菌、皮肤致病性真菌及变态反应的作用(参见樊宏伟等，苦参碱类生物碱的体外抑菌、抑病毒及诱生干扰素的实验研究[J]，中医药信息，2000，17(4)：75；吴玲清等，氧化苦参碱对小鼠腹腔肥大细胞组胺释放的抑制作用及其机制的研究[J]，中华微生物和免疫学杂志，1992，12(1)：41；楼之岑等，常用中药材品种整理和质量研究[M]，北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1995：343.)，裴仁九等人研究证明苦参碱对网状内皮系统吞噬功能、迟发性超敏反应、血清溶血素的生成均有抑制作用(参见裴仁九等，苦参碱对小鼠免疫功能的影响[J]，海峡药学，1998，10(2)：7.)。苦参总生物碱对金黄色葡萄球菌也有抑制作用(参见陈婷婷等，苦参总碱有效成分对柯萨基B3m病毒感染的Hele细胞的保护作用[J]，中国实验临床免疫学杂志，1997，9(1)：18.)。苦参抑制变态反应的机制与氨茶碱相同，即苦参中的苦参总碱能抑制环核苷酸磷酸二酯酶，提高体内环磷腺苷，阻止肥大细胞脱颗粒释放组胺(参见殷金珠等，苦参治疗I型变态反应性疾病的机理研究[J]，北京医科大学学报，1993，25(2)：84；秦万章主编，现代中医药应用与研究大全·皮肤科[M]，上海：上海中医药大学出版社，1994：128.)。当归含有阿魏酸、多糖、17种氨基酸及微量金属元素等成分，具有提高机体细胞免疫、体液免疫功能(参见韩克慧，中药免疫实验研究和临床应用[M]，北京：学术期刊出版社，1999.)及类雌激素样作用(参见寇俊萍等，当归芍药散对多种记忆损伤动物模型的影响[J]，中成药，2002，24(3)：191.)的作用。当归中的阿魏酸具有抗氧化作用，通过对自由基的消除，阻断了自由基的反应而发挥抗损伤、提高免疫系统功能，同时还有抗菌消炎等作用(参见欧仕益等，阿魏酸及其衍生物的药理作用研究进展[J]，中药材，2001，24(3)：220.)。当归主要含挥发性和水溶性成分两大部分，阿魏酸是水溶性成分中主要有效成分之一。
中药制剂与西药制剂最大的差别是制剂的原料，因此中药制剂的基础研究，除与西药制剂一样，包括制剂成型理论和技术、质量控制、合理应用等内容，还包括对中药或方剂药效物质的提取、精制、浓缩、干燥等内容，其中关键问题是“提取”。用何种思路和方法将中药或方剂的药效物质最大限度地提取出来，以保持中药或方剂特有的疗效值得深思，是提取方法研究的核心；同时又是减小剂量、创新剂型、提高临床疗效的基本前提。目前，多数中药制剂的制备仍局限于传统的水提醇沉，或仅以提取单体成分为目的的有机溶剂提取，前者在某些方面是合理的，但若把此种方法视为中药提取的“通则”就绝对化了，会阻碍复方中药提取工艺的发展。后者则忽视了药物间各成分的协同作用，不能体现复方的整体作用，更不符合中医临床用药的综合作用特点。如何在中医药理论指导下，充分利用先进的工艺技术，以尽可能的保留原方的活性物质，提高药效，是目前中医药界面临的重大问题之一。
必须指出，中医用药绝不是单体成分，而是多种成分相互作用的综合结果，这种综合效能：从化学成分上考虑，可能是一种中药共存成分之间或(和)多种中药成分之间的复合作用；从药剂学的角度考虑，可能是药材(饮片)提取过程中生成新的化合物；从药物代谢过程考虑，可能是体内发挥药效过程中的复合作用。药物化学结构唯一决定药效的观点已被打破；中药成分“无效”与“有效”的旧有界限也逐步被打破，某些过去认为是无效的成分，现在发现它有新的生物活性，如人参、黄芪、枸杞子、猪苓等具补益作用的中药中所含的多糖类成分，在增强人体免疫机能、抗癌等方面显示出较强的生物活性；天花粉蛋白质可用于中期妊娠引产；金龙胆草中含有的树脂具镇咳平喘功能；鞣质在注射剂中应作为杂质去除，而在五倍子中是具收敛作用的成分。因此只以复方中某单体化学成分的动物体外实验为指标研究中药提取工艺和制定质量标准，有很大的局限性。“化学等值不一定生物等效”。体内药效的发挥不仅包括原型药物，更包括其代谢产物。多数药物代谢后活性减弱或丧失，但也有的药物代谢物活性增强，还有的没有生物活性的药物经代谢后产生活性物。将复方体外与体内药效物质的化学研究紧密结合起来进行提取工艺和质量控制研究应该说是一种创新型研究，也是时代发展的必然。
固体发酵技术(Solid-State-Fermentation Technology)是生物技术的一种，是指某些生长需水很少的微生物利用疏松而含有必需营养物的固体培养基进行的发酵。真菌是固体发酵最普遍被使用的微生物，因其菌丝如同植物的根能在固态表面生长，并渗透到基质内，产生多样的胞外酵素能力，故比其他单细胞的细菌及酵母菌更适合固体发酵的环境。
目前，发酵技术应用于中药的研究主要是液体发酵技术。固体发酵技术应用中药复方的研究还没有。
发明内容
本发明针对目前当归苦参丸多以药材原粉入药制成大蜜丸，不但服用不便，剂量大，杂质多，易霉变，而且挥发性成分易损失，质量难以控制，并且目前，对当归苦参丸方药成分提取和剂型改革方面的研究报道很少等问题，发明人从中药复方中各种成分的层次性、联系性，复方的整体作用角度出发，根据中药复方的作用特点是多成分、多途径、多环节和多靶点，意在提供一种当归苦参新的提取工艺，通过采用固体发酵技术预处理当归和苦参后，再结合传统的水煎提取工艺对发酵产物处理，以得到抗炎作用效果更强的提取液产物。
为实现本发明的目的，发明人提供如下的技术方案：
一种当归苦参提取工艺，包括下述步骤：
(1)固体发酵处理
将原料按重量份当归和苦参400-600份、麦麸0-20份，氧化钙1-6份及水20-40份称取并混匀，混合物经灭菌处理后接种鸡腿菇，然后于温度25-29℃下发酵培养25-31天，
(2)水提取处理
步骤(1)得到的发酵产物加入其重量6-10倍的水，煎提处理得到提取液。
本发明固体发酵处理中，当归和苦参为底物，麦麸的作用是提供碳源、氮源，氧化钙为无机盐，其主要作用为调节pH值。无机盐类是微生物生命活动所不可缺少的物质。主要功用是：①构成菌体成分；②作为酶活性基的组成部分或维持酶的活性；③调节渗透压、pH值、氧化还原电位等；④作为自养菌的能源。水为溶剂，其作用为润湿药材。影响固体发酵的因素较多，如C/N、底物浓度、温度、时间等。根据发明人的研究发现，对于本发明来说，碳源和氮源以及C/N对该复方发酵的结果影响不明显，其发酵结果基本与单独用当归、苦参最为底物的结果相同。故发明人对不同组合发酵菌种用正交设计安排一系列发酵实验，探索时间、温度、接种量等因子的实验室最佳水平，以选择最佳菌种使本发明的药材发酵。
鸡腿菇，学名：毛头鬼伞，别名：鸡腿蘑、刺蘑菇，拉丁名：Copyinds comatus(MUII.Fr)Gray。发明人为了筛选出适合本发明当归苦参用的真菌菌种，做了大量研究。下面就以鸡腿菇、灵芝及鸡腿菇灵芝混合物为例，说明本发明选用鸡腿菇作为发酵菌种的原因。
取200g当归(过20目筛)、200g苦参(过20目筛)，麦麸10g及氧化钙2g，搅拌均匀，加入20ml的水(至药材湿润)，充分搅匀后的药料装入发酵培养袋，密封。将发酵培养袋放入高压蒸汽灭菌锅内灭菌，使灭菌压力升至0.1MPa，保持压力在0.1-0.15MPa之间，时间1.5h。放凉后取出培养袋。分别选用鸡腿菇、灵芝、鸡腿菇灵芝进行接种，接种量为2g(0.5％)。如取鸡腿菇母种试管，接种针在试管口放凉片刻，然后将母种表面老化的菌种部分除去，取一部分放入贴标签的培养袋中，迅速密封放好。同样的操作接种灵芝组、鸡腿菇灵芝组。然后将3组放入20℃恒温箱中培养30天。30天后的3组菌种发酵情况是，鸡腿菇组与灵芝单种组、比鸡腿菇加灵芝合种组相比，其菌丝生长情况最好。鸡腿菇菌种在当归、苦参中发酵良好，菌丝覆盖全部药材，而灵芝菌种在当归、苦参上面基本没有菌丝生长，灵芝与鸡腿菇共同发酵组，其菌丝生长情况介于二者之间，故本发明选用鸡腿菇做当归苦参固体发酵的菌种。3组菌种发酵结果图片(参见附图1a、图1b和图1c)，附图1a是鸡腿菇组菌种发酵图片，可以看出，菌丝覆盖全部药材；附图1b是灵芝组菌种发酵图片，可以看出，菌丝没有生长；附图1c是鸡腿菇灵芝组菌种发酵图片，菌丝部分生长。
鸡腿菇菌种在当归苦参方药中发酵良好，其机制可能是鸡腿菇更适合于当归苦参药材的发酵条件，灵芝则相反。而当它们共同发酵的时候，发酵结果介于两者之间，这可能是两种真菌相互竞争抑制的结果。
进一步发明人在优选出鸡腿菇作为最佳菌种的基础上，以固体发酵菌丝体质量为指标，考察了药材量(当归苦参按重量1∶1比例配比)、生长温度、发酵时间及培养基添加麦麸量4个因素，以L9(34)正交表设计实验，作多因素正交试验优选固体发酵条件，因素水平见表1，正交试验结果见表2。
表1正交试验优选固体发酵条件
表2正交试验结果
| 实验号 | A | B | C | D | Y | Y2 |
| 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 0.025 | 0.000625 |
| 2 | 2 | 1 | 2 | 2 | 0.106 | 0.011236 |
| 3 | 3 | 1 | 3 | 3 | 0.128 | 0.016384 |
| 4 | 1 | 2 | 3 | 3 | 0.112 | 0.012544 |
| 5 | 2 | 2 | 1 | 2 | 0.046 | 0.002116 |
| 6 | 3 | 2 | 2 | 1 | 0.104 | 0.010816 |
| 7 | 1 | 3 | 2 | 2 | 0.138 | 0.019044 |
| 8 | 2 | 3 | 3 | 1 | 0.119 | 0.014161 |
| 9 | 3 | 3 | 1 | 3 | 0.039 | 0.001521 |
| Ij | 0.275 | 0.259 | 0.11 | 0.248 | ||
| IIj | 0.271 | 0.346 | 0.348 | 0.29 | ||
| IIIj | 0.271 | 0.286 | 0.359 | 0.279 | ||
| Ij 2 | 0.075625 | 0.067081 | 0.0121 | 0.061504 | ||
| IIj 2 | 0.073441 | 0.119716 | 0.121104 | 0.0841 | ||
| IIIj 2 | 0.073441 | 0.081796 | 0.128881 | 0.077841 |
注：A：药材量(g)；B：温度(℃)；C：发酵时间(d)；D：麸皮量(g)；Y：菌丝体重量(g)。
表3发酵条件方差分析表
由各因素的离均差平方和计算可知：SSA＝9×10-6SSD＝0.0003.22。
以上SSA、SSD很小，这表明该因素对试验结果没有影响或影响甚微，可以认为该列的离均差平方和主要是试验误差引起的。为了提高分析精度，常把它们合并在误差离均差平方和中一起作为试验误差。注：*(F0.05(2，4)＝6.94)有显著意义，**(F0.01(2，4)＝18.00)有极显著意义。
| 方差来源 | SS | f | 方差 | F值 | 显著性 |
| B | 0.015371 | 2 | 0.0076855 | 20.49467 | ＊＊ |
| C | 0.013201 | 2 | 0.0066005 | 17.60133 | ＊ |
| 误差e | 0.0015 | 4 | 0.000375 |
注：*(F0.05(2，4)＝6.94)有显著意义，**(F0.01(2，4)＝18.00)有极显著意义。
分析表明：因素B对试验结果有非常极显著的影响，C对试验结果也有显著影响，而A和D的影响不显著。
结论：
正交试验方差分析原则：只选取有显著意义因素的最高水平和交互作用的最优搭配，确定出最佳方案，不显著的因素，原则上可以根据实际条件(如节约、省时等)酌情确定一个水平。由以上原则B可取B2，C可取C3，A从节约药材的角度可选A1，D从实际经验的角度考虑可选D2。综合上诉分析，得到最佳方案为A1B2C3D2，药材量为400g，温度27℃，发酵时间31d，麸皮量10g。按照优选出工艺进行了验证性实验，结果菌丝体重量为0.162g。
中药复方用固体发酵技术提取的主要理论依据有以下几点：
(1)微生物及其代谢过程中产生丰富的酶类，能降解大量中药植物纤维素，降低淀粉等高分子对中药成分的包裹作用，利于有效成分溶出。微生物在代谢过程中可产生成百上千的胞内酶，并且可以分泌几十种胞外酶到培养基中去，这些酶可水解植物细胞壁的纤维素、半纤维素、果胶质等，使细胞破裂，细胞间隙增加，减小细胞壁、细胞间质等传质屏障对有效成分从胞内向提取介质扩散的传质阻力，利于有效成分溶出(参见Yang X et al，Bioconversion of corn straw by coupling ensiling and solid-state fermentation，Bioresour Technol，2001Jul，78(3)：277-280)。而且淀粉等大分子物质可以作为微生物生长代谢所需的氮源和碳源，被微生物消耗、代谢、降解、吸收，促进有效成分的释放(参见Sati SC et al，Utilization of various carbon sources for the growth ofwaterborne conidial fungi，Mycologia，2006Sep-Oct，98(5)：678681)。
(2)用固体发酵技术提取中药可以使某些在体内不能直接被利用的药物有效活性组分，在体外消解得以完成而被直接利用，并能除去大分子杂质，迅速发挥应有效能。如中药大多含有苷类化合物，所含苷类多数为药物前体，发挥药效的主体物质一般都是苷元，其含糖部分被切掉后进入血液循环，才能更好的发挥药理作用。药物发酵后，苷元连接的糖基会在体外被众多微生物及其代谢产生的酶所利用而被消解掉，只剩下目标物质苷元，即利用代谢酶的作用使促进苷键的断裂从而使提取率得到提高(参见Fujita R et al，Anti-androgenic activities of Ganoderma lucidum.J Ethnopharmacol，2005 Oct 31，102(1)：107-112)。
(3)用固体发酵技术提取方药时选择具有协同作用的药用真菌，其本身就具有补充或增强方剂中药物的功能，能增强中药复方的临床疗效，这充分体现出中药方剂的配伍思想与理论。有益微生物还能利用中药中的成分促进自身的增殖，这比单一使用活菌制剂或向提取液中加酶，或将二者简单的结合在一起使用，可能会取得明显的增效作用。
作为优选，根据本发明所述的当归苦参提取工艺，其中，所述的步骤(1)中的当归和苦参按重量比1∶1配料。中药原料配比，参考中药部颁标准21册当归苦参丸(WS3-B-0537-91)。
作为优选，根据本发明所述的当归苦参提取工艺，其中，所述的步骤(1)中的当归和苦参的粒度要求为粉碎成20目粗粉。药材粉碎20目的要求是本领域一般提取均用粗粉的规格。
作为优选，根据本发明所述的当归苦参提取工艺，其中，所述的步骤(1)中的鸡腿菇的接种量为0.5-1.0wt％，以当归和苦参重量计。固体发酵接种量一般不会过大，过小会延长培养时间，降低发酵罐的生产率；过大会引起溶氧不足，影响产物合成，而且会过多移入代谢废物，也不经济。
作为优选，根据本发明所述的当归苦参提取工艺，其中，所述的步骤(1)中的灭菌处理为：压力0.1-0.15MPa、时间1-2小时。对于本领域来说，结合常用经验值和本发明的研究探索，灭菌处理的工艺条件控制在这些合理范围内就能够彻底灭菌。
作为优选，根据本发明所述的当归苦参提取工艺，其中，所述的步骤(2)中的煎提处理做3次以上，煎煮时间共需3个小时以上。更有选的是，煎提处理做3次，一共煎煮3个小时，这一工艺条件的探索研究可参见发明人此前的一篇文献报道，即(王英姿等，均匀设计优选当归苦参丸方药的半仿生提取工艺条件[J]，中草药，2005，36(2)：212-214.)。
作为优选，根据本发明所述的当归苦参提取工艺，其中，所述的步骤(2)中的煎提处理的温度为90-100℃。预实验表明，对于本发明来说，水煎提取药材，其温度控制在90-100℃，其提取效果并无显著性差异。
根据本发明选用药材的特点，将阿魏酸、苦参碱、苦参总碱、干浸膏得率、HPLC总面积和分子量≤1000的提取物得率作为指标成分，测定指标成分含量即可得知本发明产物的提取效果。多指标综合评判提取方法的结果，更为合理、全面和科学，也更能体现中医复方治病多成分综合作用的特点。其中，将分子量≤1000的提取物得率作为指标成分的原因(参见孙秀梅等，用均匀设计优选香附SFE-CO2萃取后药渣的半仿生法工艺条件[J]，中国中药杂志，2009，34(22)：2880-2883.)，该文献指出，天然药物和中药中，已知单体化合物绝大多数分子量≤1000。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明是利用生物技术提出的一种新型提取方法，既保留中药作为多组分，多靶点协同作用制剂的物质基础，又满足开发新型现代制剂的要求。
与液体发酵相比，固体发酵培养基单纯，前处理简单，发酵条件易于操作，适合丝状真菌生长，可以多菌种同时放在一起发酵。其发酵产品性能较好，工业化生产时环境污染比较小，且利于生物循环等。
与现有当归苦参水提取相比，本发明产品的抗炎作用更强，并且安全无毒。
通常中药提取是以粗提物为最终产物，而本研究最终产物是分离制得“分子量≤1000Da的提取物”。分子量≤1000Da的提取物既能体现中药整体、综合、客观、模糊的特点，又可缩小服用剂量，为选用软胶囊、滴丸等现代药物剂型提供了可能，同时提高了技术含量。因此，本发明是中药药效物质提取研究设计的一种新思路。
附图说明
图1是本发明菌种发酵照片，图1a是鸡腿菇菌种发酵照片，可见菌丝覆盖全部药材；图1b是灵芝菌种发酵照片，可见菌丝没有生长；图1c是鸡腿菇与灵芝混合发酵照片，可见菌丝部分生长。
图2是本发明生理盐水对照组、实施例1提取液组、比较例1提取液组和阳性对照组对兔耳实验性角化模型的影响的光镜检查图片(HE染色×40)，图2A：生理盐水组，病变无明显改善，表皮层仍增厚，毛囊有大量角化物；图2B：维胺脂胶囊阳性药组，表皮层变薄，毛囊角化物少且疏松或无角化物；图2C：实施例1发酵药材提取液组，表皮变薄，毛囊无角化物；图2D：比较例1未发酵药材水提取液组，表皮层也变薄，毛囊有中等量角化物且较疏松。
具体实施方式
下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。
主要原料和设备的说明：
当归和苦参购自北京同仁堂药店，经闫玉凝教授鉴定，当归为伞形科植物当归Angelicasinensis(Oliv.)Diels的干燥根经加工制成的饮片，苦参为豆科植物苦参Sophoraflavescena Ait.的干燥根经加工制成的饮片，均符合《中国药典》2005年版(一部)该药材项下的有关规定。鸡腿菇菌种购自山东省农科院。阿魏酸、苦参碱对照品(中国药品生物制品检定所，批号依次为110773200611，110805200507，供含量测定用)。
精密pH计(pHS-3C型，上海雷磁仪器厂)；高效液相色谱仪(HP1100系列，美国Agilent公司)，电子天平(YP601N型，上海精密科学仪器有限公司)，离心沉淀机(LXJ-II型，上海医疗器械三厂)，超声波清洗器(KQ-100B型，昆山市超声仪器有限公司)。
实施例1
取200g当归(过20目筛)、200g苦参(过20目筛)，麦麸10g及氧化钙2g，搅拌均匀，加入20g(即20ml)的水润湿药材，充分搅匀后的药材装入发酵培养袋，密封。将发酵培养袋放入高压蒸汽灭菌锅内灭菌，使灭菌压力升至0.1MPa，保持压力在0.1-0.15MPa之间，时间1.5h。放凉后取出培养袋。接种鸡腿菇，接种量为0.5wt％：取鸡腿菇母种试管，接种针在试管口放凉片刻，然后将母种表面老化的菌种部分除去，取一部分放入贴标签的培养袋中，迅速密封放好。然后将培养袋放入27℃恒温箱中培养31天。将固体发酵以后的药材用“双提法”在常压下90-92℃加热回流提取3次，加水量分别为药材重量的10倍、6倍、6倍，提取时间依次为2h、0.5h、0.5h，合并煎液，滤过，滤液浓缩成相对密度为1.30～1.35(20℃)的清膏(每1mL样品液相当于原处方药材0.4g)。挥发油另器保存。
测定指标成分(阿魏酸、苦参碱、苦参总碱、干浸膏得率、HPLC总面积、分子量≤1000的提取物量)含量。将各指标成分所得数据进行标准化处理，以消除各指标的单位和量纲不同，以及各指标变量范围相差悬殊所造成的影响。同时考虑各指标在提取中的主次，给予不同的加权系数，计算出提取液的综合评判参数Y值。结果见表4。
干浸膏量的测定，按照《中国药典》2005年版一部附录X·A浸出物测定法。
实施例2
取250g当归(过20目筛)、250g苦参(过20目筛)，麦麸12g及氧化钙2g，搅拌均匀，加入30g(即30ml)水润湿药材，充分搅匀后的药料装入发酵培养袋，密封。将发酵培养袋放入高压蒸汽灭菌锅内灭菌，使灭菌压力升至0.1MPa，保持压力在0.1-0.15MPa之间，时间2h。放凉后取出培养袋。接种鸡腿菇，接种量为0.7wt％：取鸡腿菇母种试管，接种针在试管口放凉片刻，然后将母种表面老化的菌种部分除去，取一部分放入贴标签的培养袋中，迅速密封放好。然后将培养袋放入25℃恒温箱中培养28天。将固体发酵以后的药材用“双提法”在常压95-98℃下加热回流提取3次，加水量分别为药材重量的10、6、6倍，提取时间依次为2h、0.5h、0.5h，合并煎液，滤过，滤液浓缩成相对密度为1.30～1.35(20℃)的清膏(每1mL样品液相当于原处方药材0.4g)。挥发油另器保存。
测定指标成分(阿魏酸、苦参碱、苦参总碱、干浸膏得率、HPLC总面积、分子量≤1000的提取物量)含量。将各指标成分所得数据进行标准化处理，以消除各指标的单位和量纲不同，以及各指标变量范围相差悬殊所造成的影响。同时考虑各指标在提取中的主次，给予不同的加权系数，计算出提取液的综合评判参数Y值。结果见表4。
干浸膏量的测定，按照《中国药典》2005年版一部附录X·A浸出物测定法。
实施例3
取300g当归(过20目筛)、300g苦参(过20目筛)，麦麸20g及氧化钙6g，搅拌均匀，加入40g(即40ml)水润湿药材，充分搅匀后的药料装入发酵培养袋，密封。将发酵培养袋放入高压蒸汽灭菌锅内灭菌，使灭菌压力升至0.1MPa，保持压力在0.1-0.15MPa之间，时间2h。放凉后取出培养袋。接种鸡腿菇，接种量为1.0wt％：取鸡腿菇母种试管，接种针在试管口放凉片刻，然后将母种表面老化的菌种部分除去，取一部分放入贴标签的培养袋中，迅速密封放好。然后将培养袋放入29℃恒温箱中培养25天。将固体发酵以后的药材用“双提法”在常压90-93℃下加热回流提取3次，加水量分别为药材重量的10倍、6倍、6倍，提取时间依次为2h、0.5h、0.5h，合并煎液，滤过，滤液浓缩成相对密度为1.30～1.35(20℃)的清膏(每1mL样品液相当于原处方药材0.4g)。挥发油另器保存。
测定指标成分(阿魏酸、苦参碱、苦参总碱、干浸膏得率、HPLC总面积、分子量≤1000的提取物量)含量。将各指标成分所得数据进行标准化处理，以消除各指标的单位和量纲不同，以及各指标变量范围相差悬殊所造成的影响。同时考虑各指标在提取中的主次，给予不同的加权系数，计算出提取液的综合评判参数Y值。结果见表4。
干浸膏量的测定，按照《中国药典》2005年版一部附录X·A浸出物测定法。
实施例4(根据权利要求补充麦麸为0的情况，请补充检测数据)
取200g当归(过20目筛)、200g苦参(过20目筛)及氧化钙1g，搅拌均匀，加入20g(即20ml)的水润湿药材，充分搅匀后的药材装入发酵培养袋，密封。将发酵培养袋放入高压蒸汽灭菌锅内灭菌，使灭菌压力升至0.1MPa，保持压力在0.1-0.15MPa之间，时间1.5h。放凉后取出培养袋。接种鸡腿菇，接种量为0.5wt％：取鸡腿菇母种试管，接种针在试管口放凉片刻，然后将母种表面老化的菌种部分除去，取一部分放入贴标签的培养袋中，迅速密封放好。然后将培养袋放入27℃恒温箱中培养31天。将固体发酵以后的药材用“双提法”在常压下90-92℃加热回流提取3次，加水量分别为药材重量的10倍、6倍、6倍，提取时间依次为2h、0.5h、0.5h，合并煎液，滤过，滤液浓缩成相对密度为1.30～1.35(20℃)的清膏(每1mL样品液相当于原处方药材0.4g)。挥发油另器保存。
测定指标成分(阿魏酸、苦参碱、苦参总碱、干浸膏得率、HPLC总面积、分子量≤1000的提取物量)含量。将各指标成分所得数据进行标准化处理，以消除各指标的单位和量纲不同，以及各指标变量范围相差悬殊所造成的影响。同时考虑各指标在提取中的主次，给予不同的加权系数，计算出提取液的综合评判参数Y值。结果见表4。
干浸膏量的测定，按照《中国药典》2005年版一部附录X·A浸出物测定法。
比较例1
当归200g、苦参200g粉碎成粗粉(20目)，混匀，用“双提法”在常压95-98℃下加热回流提取3次，加水量分别为药材重量的10倍、6倍、6倍，提取时间依次为2h、0.5h、0.5h，合并煎液，滤过，滤液浓缩成相对密度为1.30～1.35(20℃)的清膏(每1mL样品液相当于原处方药材0.4g)。挥发油另器保存。测定指标成分(阿魏酸、苦参碱、苦参总碱、干浸膏得率、HPLC总面积、分子量≤1000的提取物量)含量。将各指标成分所得数据进行标准化处理，以消除各指标的单位和量纲不同，以及各指标变量范围相差悬殊所造成的影响。同时考虑各指标在提取中的主次，给予不同的加权系数，计算出提取液的综合评判参数Y值。结果见表4。
表4实施例1-4及比较例1提取液中各指标成分的含量测定值及标准化处理结果
注：1.Y＝[(阿魏酸+苦参碱+苦参总碱)÷3]×5+(干浸膏+HPLC总面积)÷2]×3+1000D提取物×2。
2.括号内的数值为标准化处理的结果；*P＜0.05，**P＜0.01。
本实验加权系数的确定是按照各指标在提取工艺选择中的主次地位，给予不同的加权系数，以标准化后的值加权后求和，即得综合评价值。因为单体成分、有效部位、HPLC总峰面积、1000D提取物得率的各真值相差较大，单体成分可能仅仅为HPLC总峰面积或者1000D提取物得率的百分之一或千分之一。假若采用将各个指标的真值“以同等对待进行加合作为综合评分指标”，则HPLC总峰面积或者1000D提取物得率等真值较大的指标数值稍有变化，往往就会掩盖单体成分、有效部位等真值较小指标的数值。而且单体成分、有效部位等真值较小的指标，在质量标准制订中具有重要作用。因此，在该提取工艺选择中单体成分、有效部位等真值较小的指标占主要地位，给予的加权系数大。本实验各指标综合评判Y值的关系式为：Y＝[(阿魏酸+苦参碱+苦参总碱)÷3]×5+(干浸膏+HPLC总面积)÷2]×3+1000D提取物×2。
在多指标实验中，通常采用“综合评分法”或“综合平衡法”进行数据分析。本实验对各单个指标数据进行标准化处理，求得数据的相对值，再对标准化后的数值作加权求和处理，得到一个综合评判Y值。这样做可以消除各指标之间的单位和量纲的不同，以及指标变量范围相差悬殊所造成的“拉平效应”影响，提高了组间综合评判数据的相关性和可比性，更科学、合理。
根据表4的结果，可以看出，综合评价Y值的顺序为：Y发酵＞Y未发酵，表明当归苦参丸方药经固体发酵后有利于药物成分的提取。
实验部分
取实施例1和比较例1的提取液做如下实验：
1、实施例1和比较例1的提取液的主要药效比较
1.1煤焦油致兔耳角化模型实验
用煤焦油外涂于雄性白色家兔(体重1.5～2.5kg)右耳管开口处，左耳涂以橄榄油，1次·d-1，连续14d，造成兔耳实验痤疮动物模型。雄性白色家兔24只随机均分4组，即模型组(只造模不给药)，阳性药组(维胺脂胶囊)，实施例1发酵药材提取液组和比较例1未发酵药材水提取液组。灌胃给药，0.5g·mL-1，1次·d-1，连续14d。用肉眼观察耳根厚度，有无粉刺，进行评分：无粉刺(0)；毛囊漏斗部见少量致密角化物(+)；毛囊漏斗部见中等量致密角化物，并向皮脂腺延伸(++)；扩张的毛囊内有广泛的角化物质，与人类的开放性粉刺相似(+++)。组织学观察(角化过度，表皮和毛囊上皮的颗粒层增厚，棘层肥厚；相邻扩张的毛囊互相融合，毛囊口及漏斗部都充满角化物质，并向皮脂腺延伸；毛囊口角栓堵塞，毛囊漏斗部充满角化物质并扩大呈壶状；真皮上层毛细血管扩张明显，毛囊周围弥漫散在炎性细胞浸润，以小圆形细胞为主，还有少量中性粒细胞)：HE染色光镜检查，4组实验结果见附图2A、附图2B、附图2C和附图2D。生理盐水组，病变无明显改善，表皮层仍增厚，毛囊有大量角化物(图2A)；阳性药组表皮层变薄，毛囊角化物少且疏松或无角化物(图2B)；发酵药材提取液组表皮变薄，毛囊无角化物(图2C)；未发酵药材水提取液组表皮层也变薄，毛囊有中等量角化物且较疏松(图2D)。结果表明发酵药材提取液组可显著减轻兔皮肤毛囊皮脂腺导管的过度角化和表皮角质层的增厚。
1.2抗炎试验
①对角叉菜胶所致大鼠足跖肿胀的影响将40只大鼠(180-220g)随机分为4组(对照组、地塞米松组、实施例1发酵药材提取液组，比较例1未发酵药材水提取液组)，除对照组灌胃给与饮用水1ml·100g-1外，其他各给药组灌胃给与相应药物1ml·100g-1体重，1次·d-1，连续5d。末次给药后1h，在大鼠右后脚足跖部皮内注射1％角叉菜胶0.1ml，于致炎后1h，2h，3h，4h，5h，6h用软皮尺测量足跖周长，并测量左脚相应部位的周长。计算肿胀率，并与对照组进行t检验，见表5。发酵提取液组、未发酵提取液组与对照组比较，对角叉菜胶所致大鼠足肿胀均具有显著的抑制作用(P＜0.01，P＜0.05)，发酵提取液组抗炎作用明显强于未发酵提取液组(P＜0.05)。
表5 2种方法提取液对角叉菜胶所致大鼠足跖肿胀的影响
与对照组比较：*P＜0.05**P＜0.01
②对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响将40只小鼠(18-22g)随机分为4组(对照组、地塞米松组、实施例1发酵药材提取液组，比较例1未发酵药材水提取液组)，除对照组灌胃给与饮用水1ml·100g-1外，其他各给药组灌胃给与相应药物1ml·100g-1，1次·d-1，连续5d。末次给药后1h，在小鼠右耳部皮内外侧均匀涂予二甲苯溶液，于致炎后1h，取左右两耳相应部位的耳片，精确称重。计算肿胀率，并与对照组进行t检验，见表6。结果表明，发酵提取液组、未发酵提取液组与对照组比较，对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀均有显著的抑制作用，其肿胀抑制率分别为18.27％和12.97％(P＜0.01，P＜0.05)，发酵提取液组抗炎作用明显强于未发酵提取液组(P＜0.05)。提示药材发酵后抗炎作用明显增强。
表6 2种方法提取液对小鼠二甲苯性耳肿胀的影响
| 组别 | 动物数/只 | 剂量(ml·kg-1) | 肿胀度/mg | 肿胀抑制率/％ |
| 正常对照 | 10 | - | 20.74±2.58 | - |
| 实施例1 | 10 | 10 | 16.95±3.23** | 18.27 |
| 比较例1 | 10 | 10 | 18.05±2.89* | 12.97 |
| 地塞米松 | 10 | 10 | 15.13±3.82** | 27.05 |
与对照组比较：*P＜0.05**P＜0.01
③对棉球肉芽肿的影响将40只大鼠(180-220g)随机分为4组(对照组、地塞米松组、实施例1发酵药材提取液组，比较例1未发酵药材水提取液组)，除对照组灌胃给予饮用水1ml·100g-1外，其他各给药组灌胃给与相应药物1ml·100g-1，1次·d-1，连续5d。
造模：动物用水合氯醛(350mg·kg-1)麻醉，于腹部正中作一开口，用止血钳剥离皮肤至腹股沟处，将预先高压灭菌并加入庆大霉素0.1ml的50mg棉球植入腹股沟处，缝合皮肤，待动物清醒后开始给药。
取材：末次给药后1h，断椎处死大鼠，打开腹部皮肤，仔细剥离棉球，置于电子天平上称重，即为棉球湿重，将棉球置于110℃烘箱中，干燥48h，取出称量即为干重。分别用棉球湿重、干重减去棉球重作为肉芽多少的指标，各组计算均值和SD，并与对照组进行t检验，见表7。结果表明，发酵提取液组、未发酵提取液组的抑制率分别为20.34％、7.91％(P＜0.01，P＜0.05)，发酵提取液组能显著抑制小鼠棉球肉芽增生肿胀，抗炎作用明显强于未发酵提取液组(P＜0.01)，提示具有明显的抗肿消炎作用。
表7 2种方法提取液对棉球肉芽肿的影响
| 组别 | 动物数/只 | 剂量ml·kg-1) | 肉芽肿胀度/mg | 肉芽肿抑制率/％ |
| 正常对照 | 10 | 10 | 19.08±1.10 | - |
| 实施例1 | 10 | 10 | 15.20±4.09** | 20.34 |
| 比较例1 | 10 | 10 | 17.57±1.78* | 7.91 |
| 地塞米松 | 10 | 10 | 13.30±4.89** | 30.29 |
与对照组比较：*P＜0.05**P＜0.01
通过观察发酵前后两种提取液对角叉菜胶所致大鼠足跖肿胀、对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀、对小鼠棉球肉芽肿等实验性炎症的影响，证实了发酵后提取液具有显著的抗炎和改善机体炎性反应的作用。实验结果提示，药材发酵后提取不仅可以抑制毛细管扩张、通透性增加、渗出性水肿为主的炎症早期反应，而且对炎症后期肉芽组织的增生也具有抑制作用。
2.实施例1和比较例1的提取液的急性毒性实验
方法：将30只体重20±2g小鼠，随机分成3组(比较例1、实施例1、空白)，每组10只，实验前12h禁食不禁水，第二日于8:00、12:00，16:00时，将实施例1、比较例1的方药提取液(质量浓度为0.75g·mL-1)分别灌胃给药，每只0.8mL·次-1，对照组灌胃等容量蒸馏水，连续观察7天，小鼠体重、行为活动无异常变化，无1例死亡。表明该方药经固体发酵后的水提取液尚未发现毒性反应。
结论：为考察该方药经固体发酵后的安全性，对方药发酵前后的水提取液作小鼠急性毒性实验，一天的最大给药量(90g·kg-1)相当于成人(60kg)每天用药量(0.3g·kg-1)的300倍，在观察期内，小鼠的体重及行为活动无异常变化，无1例死亡。表明该方药经固体发酵后与发酵前一样，均未显示有毒性反应，在规定剂量范围内使用安全。
尽管发明人已经对本发明的技术方案做了较为详细的阐述和列举，应当理解，对于本领域一个熟练的技术人员来说，对上述实施例作出修改和/或变通或者采用等同的替代方案是显然的，都不能脱离本发明精神的实质，本发明中出现的术语用于对本发明技术方案的阐述和理解，并不能构成对本发明的限制。
Claims (1)
1.一种当归苦参提取工艺，其特征在于，所述提取工艺的步骤为：
（1）固体发酵处理
按重量份称取当归和苦参400份、麦麸10份，氧化钙2份及水20份，混匀，混合物经灭菌处理后接种鸡腿菇，然后于温度27℃下发酵培养31天，其中：当归和苦参的粒度要求为可通过20目筛；鸡腿菇的接种量为0.5 wt%，以当归和苦参重量计，
当归和苦参按重量比1：1配料，
灭菌处理为：压力0.1-0.15MPa、时间1.5小时；
（2）水提取处理
步骤（1）得到的发酵产物加入其重量6-10倍的水，煎提处理得到提取液，滤过，滤液浓缩成20℃时的相对密度为1.30～1.35的清膏，其中：煎提处理做3次以上，煎煮时间共需3小时以上；煎提处理的温度为90-100℃。
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