CN107893035A - 一种猴头菌的培养基、黄精生物转化菌丝体、黄精生物转化菌丝体的提取物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猴头菌的培养基、黄精生物转化菌丝体、黄精生物转化菌丝体的提取物及其用途。该猴头菌的培养基是在基础培养基中加入中药黄精，包括基础培养基和黄精，每100份培养基中包括基础培养基80～60份，黄精20～40份；基础培养基包括如下重量份的各组分：麦麸560～420份，玉米粉160～120份，谷糠80～60份，水450～550份。该黄精生物转化菌丝体是将猴头菌接入上述培养基经菌丝转化培养所得的产物。该黄精生物转化菌丝体的提取物是经水提后再减压浓缩，最后真空冷冻干燥制备出来的。该黄精生物转化菌丝体的提取物具有抗癌作用，作用明显优于猴头菌丝体或黄精，可用于制备抗癌药物。

Description

一种猴头菌的培养基、黄精生物转化菌丝体、黄精生物转化菌 丝体的提取物及其用途

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，特别涉及一种猴头菌的培养基、黄精生物转化菌丝体、黄精生物转化菌丝体的提取物及其用途。

背景技术

猴头菌是一种猴头菌科蘑菇(真菌)，在中药用于治疗胃肠道疾病已经超过2000年的历史了，一系列小分子化合物如erinacines，被认为具有神经再生，并且可以透过血脑屏障修复受损神经组织。猴头菌还有抗溃疡，抗炎，抗微生物，免疫调节，提高肝功能，抗衰老，降低血糖和血脂，提高抗缺氧能力，增加心脏输出、和改善备注循环等作用，包含猴头菌的医用制剂在中国广泛使用。

猴头菌丝体中的活性物质最重要的是多糖及糖蛋白，目前国内外对猴头多糖的研究表明，猴头菌多糖具有多种生物活性和药理作用，能增强巨噬细胞的吞噬功能，促进溶血素的形成，抗白细胞下降，降血糖、抗凝血、抗血栓、抗突变和抗衰老等。因此，猴头菌多糖备受人们关注，成为近年来分子生物学、医药、食品科学等领域研究和开发应用的热点。《中国药典》记载了猴头菌丝体(参见2015年版一部的第1614-1615页)，本发明所述的猴头菌丝体就是该标准记载的猴头菌丝体。

黄精(Polygonatum sibiricum Red.)，为百合科植物滇黄精、黄精或多花黄精的干燥根茎，因其大小、形状的不同，又被分别称为“大黄精”、“鸡头黄精”、“姜形黄精”。黄精始载于《雷公炮炙论》，功能养阴润肺、补脾益气、滋肾填精。现代药理研究表明，黄精有较好的抗疲劳、抗氧化、延缓衰老等作用，黄精作为一种传统名贵中药，具有宽中益气，益肾填精，滋阴润肺，生津补脾之功效。主治肺燥干咳、体虚乏力、心悸气短、久病津亏口干、糖尿病、高血压等病症。对治疗心血管疾病、结核病、慢性肝炎以及在抗菌、解毒、抗疲劳、抗衰老、抗病毒、抗肿瘤等方面均有较好作用。其化学成分主要有：黄精多糖、甾体皂苷、蒽醌类化合物、生物碱、强心苷、木脂素、维生素和多种对人体有用的氨基酸等化合物。

黄精多糖是黄精的主要功能成分，研究表明，黄精多糖药用价值非常高，具有抗肿瘤、抗氧化、免疫调节等活性。

生物转化“菌丝体”是指利用菌丝体(包括真菌)的代谢功能，使有机物分解的生物化学反应过程。以适宜的培养基为营养，通过菌丝体的生长代谢和生命活动产生丰富的次生代谢产物。借鉴中医药组方思想，将单味中药、具有类似或协同作用的中药作为部分培养基进行菌丝体转化，不同菌株诱变“次生”代谢不同的生物活性成分，再实行“定向培养、双向转化”生物转化工艺，可获得不同生物活性物质原料，目的是增强功效或者降低药物毒副作用。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，跨学科创新，结合微生物学、中药学等多学科，提供一种新原料(黄精)作为猴头菌的培养基成分，即本发明的目的在于提供一种猴头菌的培养基、黄精生物转化菌丝体、黄精生物转化菌丝体的提取物及其用途。所述黄精生物转化菌丝体的提取物的制备方法简单，成本较低，提取物用于制备抗肿瘤药物。

基于上述目的，本发明的内容包括一种猴头菌的培养基，包括基础培养基和黄精，每100份的培养基中包括基础培养基80～60份，黄精20～40份；所述基础培养基包括如下重量份的各组分：麦麸560～420份，玉米粉160～120份，谷糠80～60份，水450～550份。

优选的，所述基础培养基包括如下重量份的各组分：麦麸490份，玉米粉140份，谷糠70份，水500份。

优选的，每100份的培养基中包括基础培养基70份，黄精30份；所述基础培养基包括如下重量百分数的各组分：麦麸70％、玉米粉20％、谷糠10％。

本发明还提供一种黄精生物转化菌丝体，将猴头菌类菌株接种至所述的培养基中，在20～27℃下，培育40～50天，取出菌丝体，烘干，即得黄精生物转化菌丝体。

优选的，所述猴头菌类菌株为猴头菌科真菌猴头菌Hericium erinaceum(Bull.exFr.)Pers。

优选的，所述黄精生物转化菌丝体为猴头菌科真菌猴头菌Hericium erinaceum(Bull.ex Fr.)Pers.的菌丝体与其附生含有黄精成份的固体培养基的干燥混合物。

本发明还提供一种黄精生物转化菌丝体的提取物，所述提取物通过以下步骤制备得到：

(1)将所述的黄精生物转化菌丝体进行水提，50-70℃下用水浸泡2-3次，每次浸泡2-5小时，水的重量为黄精生物转化菌丝体重量的6～10倍，得到提取液；

(2)将步骤(1)中的提取液减压浓缩，将减压浓缩所得的浓缩液在50-70℃条件下抽真空干燥，即得黄精生物转化菌丝体的提取物。

优选的，步骤(1)中所述用水浸泡的次数为2次，每次浸泡3小时，水的重量为黄精生物转化菌丝体重量的8倍；步骤(2)中将减压浓缩所得的浓缩液在60℃条件下抽真空干燥。

本发明还提供了一种所述的黄精生物转化菌丝体的提取物在制备抗肿瘤药物中的用途。

优选的，所述肿瘤为H₂₂实体瘤、S₁₈₀腹水瘤、移植性Heps瘤或移植性Eac瘤的一种或多种。

本发明的有益效果有：

(1)本发明的黄精生物转化菌丝体的提取物采用简单的处理工艺制备得到，其抗肿瘤效果就达到预料不到的技术效果，经生物转化的“菌丝体”的抗肿瘤效果好于所有的天然植物来源的中药材，如果进一步分离纯化富集有效成分，其抗肿瘤效果将更好，可用于制备抗癌药物。

(2)猴头菌是一种药用真菌，能很好地吸收培养基中营养，彻底转化培养基，产生新的活性物质及代谢物，为此，本发明将中药黄精加入到猴头菌的基础培养基中，作为猴头菌的培养基成分之一，并对中药材黄精掺入猴头菌的培养基的比率进行调配，最终选择中药材黄精最佳掺入的比率为30％，黄精占30％比率时，菌丝体生长情况较好，黄精多糖含量较高。

(3)猴头菌对黄精进行中药菌丝体转化，得到新的菌丝体，本发明对所得的黄精生物转化菌丝体进行提取，得到的黄精生物转化菌丝体的提取物进行了动物在体试验，试验结果表明：黄精生物转化菌丝体的提取物对H₂₂实体瘤、S₁₈₀腹水瘤、移植性Heps瘤、移植性Eac瘤有明显的抑制作用，抗癌作用由强到弱为：黄精生物转化菌丝体>黄精药材>猴头菌丝体≈猴头菌丝体+黄精，该黄精生物转化菌丝体的提取物抗癌作用明显优于猴头菌丝体或黄精的抗癌作用，这说明猴头菌中丰富的酶系通过结构修饰或降解作用，把黄精中的活性成分转化成活性更强的成分，或增强了黄精中的活性成分(黄精多糖)的产量，或把非活性成分转化成活性成分，活性成分相互促进达到增强抗癌功效的目的；同时进行移植裸小鼠体内抑瘤试验，试验结果表明：黄精生物转化菌丝体的提取物对移植性Heps瘤、移植性Eac瘤裸鼠具有明显的抑瘤作用。因此，黄精生物转化菌丝体的提取物可用于制备抗癌药物。

(4)本发明先用醇提黄精生物转化菌丝体，除去醇溶性杂质；后水提，保证多糖的溶出效率，为了不影响有关活性物质，本发明优选采用60℃条件下抽真空干燥。

附图说明

图1为黄精生物转化菌丝体的提取物对移植性Heps瘤的抑瘤影响图，其中A为HJ组，B为HTJ组，C为HTJ+HJ组，D为HH-1组，E为HH-2组，F为HH-3组，G为环磷酰胺组。

具体实施方式

实施例1

一种黄精生物转化菌丝体的提取物，其制备方法包括如下步骤：

(1)取农副产品麦麸560g、玉米粉160g、谷糠80g，以及中药材黄精粗粉200g，混匀，加入450g水拌匀，即得猴头菌的培养基；再装瓶、灭菌，接入猴头菌，在25℃条件下转化培养约40天，取出菌丝体，烘干，即得黄精生物转化菌丝体；

(2)取黄精生物转化菌丝体，60℃水浸泡2次，每次浸泡2小时，水的重量为黄精生物转化菌丝体重量的6倍，得到提取液；

(3)将提取后获得的提取液减压浓缩，将减压浓缩所得的浓缩液在60℃条件下抽真空干燥，即得黄精生物转化菌丝体的提取物(代号：HH-1)。

实施例2

一种黄精生物转化菌丝体的提取物，其制备方法包括如下步骤：

(1)取农副产品麦麸490g、玉米粉140g、谷糠70g，以及中药材黄精粗粉300g，混匀，加入500g水拌匀，即得猴头菌的培养基；再装瓶、灭菌，接入猴头菌，在25℃条件下转化培养约40天，取出菌丝体，烘干，即得黄精生物转化菌丝体；

(2)取黄精生物转化菌丝体，60℃水浸泡3次，每次浸泡3小时，水的重量为黄精生物转化菌丝体重量的8倍，得到提取液；

(3)将提取后获得的提取液减压浓缩，将减压浓缩所得的浓缩液在60℃条件下抽真空干燥，即得黄精生物转化菌丝体的提取物(代号：HH-2)。

实施例3

一种黄精生物转化菌丝体的提取物，其制备方法包括如下步骤：

(1)取农副产品麦麸420g、玉米粉120g、谷糠60g，以及中药材黄精粗粉400g，混匀，加入550g水拌匀，即得猴头菌的培养基；再装瓶、灭菌，接入猴头菌，在25℃条件下转化培养约40天，取出菌丝体，烘干，即得黄精生物转化菌丝体；

(2)取黄精生物转化菌丝体，60℃水浸泡3次，每次浸泡4小时，水的重量为黄精生物转化菌丝体重量的10倍，得到提取液；

(3)将提取后获得的提取液减压浓缩，将减压浓缩所得的浓缩液在60℃条件下抽真空干燥，即得黄精生物转化菌丝体的提取物(代号：HH-3)。

实施例4黄精掺入比例试验

基础培养基投料以干料计，比率固定为：麦麸70％、玉米粉20％、谷糠10％(不包括水)。本发明把中药材黄精作为培养基成分之一，中药材黄精掺入的比率分别占猴头菌培养基总量的20％、30％、40％，设计实验方案，总投料5000g，分别按上述实施例1、实施例2、实施例3所述的步骤配制培养基，加水混匀、灭菌、接种、培养，平行对照，培养条件完全一致，培养过程中观察菌丝体生长状况、生长周期、污染情况、生长速度，挖瓶后烘干称重计算收率，检测样品中的纤维素酶、麦角甾醇含量(考察转化是否彻底)、多糖含量、总黄酮含量和总皂苷含量，干燥后的样品分别标注为HH-1、HH-2、HH-3。试验结果统计如下表1所示：

表1

试验结果表示：黄精占40％时污染率高、生长速度慢、生长周期长，纤维素酶与麦角甾醇的含量低，生物转化不彻底；而黄精占20％时生长速度较快、生长周期短，但多糖、总黄酮与总皂苷含量低；黄精占30％比率时最为合适，菌丝体生长情况较好，兼顾各优势，为最佳比率。

实施例5黄精多糖对H₂₂实体瘤、S₁₈₀腹水瘤的抑制作用研究

1.试验材料

1.1细胞株

小鼠肝癌H₂₂细胞株、肉瘤S₁₈₀细胞株购于中科院细胞库，在湖南省药物安全评价研究中心细胞室内传代培养。

1.2供试品

样品编号：HTJ表示猴头菌丝体，HJ表示黄精中药材，HTJ+HJ表示70％的猴头菌丝体+30％黄精中药材，HH-1、HH-2、HH-3分别表示猴头菌的培养基中黄精掺入比例为20％、30％、40％的黄精生物转化菌丝体。上述样品平行操作进行如下处理：取黄精生物转化菌丝体，进行醇提，醇的重量为黄精生物转化菌丝体重量的600倍，加热提取2h，去掉醇提液，得到醇提后的药渣；药渣加600倍水加热提取2h，得到水提液，分别编号为HTJ，HJ，HTJ+HJ，HH-1，HH-2和HH-3。

1.3实验动物

18～22g，雌雄各半，80只，ICR种小白鼠，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK(湘)2011-0003；在湖南省药物安全评价研究中心屏障环境B区实验室饲养，实验动物质量合格证号：NO43004700004931，实验动物使用许可证号：SYXK(湘)2010-0008。实验期间环境温度20℃～26℃，湿度40％～70％。

2.试验方法

2.1多糖含量测定

采用蒽酮～硫酸比色法测定黄精多糖含量。

2.2制备瘤细胞悬液

无菌操作下取瘤块，称重，用玻璃组织匀浆器研磨，磨匀后放入无菌容器内，加生理盐水稀释成1：3的细胞悬液，容器置冰块上，充分混匀。

2.3黄精多糖对H₂₂移植性实体瘤的抑制作用

取小鼠50只，每只小鼠均于右前腋下接种H₂₂瘤细胞液0.2mL/次。日称体质量，并随机分为5组，即生理盐水组、环磷酰胺组和黄精多组，每组l0只小鼠。接种24h后灌胃给药，灌胃体积为20mL/kg体质量，1次/d，连续给药l0d，环磷酰胺组腹腔注射给药，隔日1次。停药后次日处死小鼠称重，并小心剥离瘤组织、胸腺及脾脏，分别称重，并计算抑瘤率、脾脏指数和胸腺指数。

2.4黄精多糖对S₁₈₀腹水瘤小鼠存活期的影响

取小鼠80只，每只小鼠均腹腔接种S₁₈₀瘤细胞液0.2mL。随机分为8组，即生理盐水组、环磷酰胺组、猴头菌丝体组、黄精组、猴头菌丝体+黄精组、生物转化HH-1/HH-2/HH-3组，每组10只小鼠。接种24h后灌胃给药，灌胃体积为20mL/kg体质量，1次/d，连续给药10d。以接种肿瘤之日算起，记录死亡时间，计算生命延长率。

2.5统计学处理

各组数据以均数±标准差表示，采用F检验进行统计学分析。

3.试验结果

3.1黄精多糖对H₂₂移植性实体瘤的抑制作用，见表2

表2

注：与生理盐水组比较，^**P<0.01。

3.2黄精多糖对S₁₈₀腹水瘤小鼠存活期的影响，见表3。

表3

注：与生理盐水组比较，^**P<0.0l。

综上，表2的结果表明，黄精多糖对H₂₂移植性实体瘤的抑制与生理盐水组相比，实验组的各组均有显著抑制H₂₂移植性实体瘤生长的作用(P<0.01)，并且黄精多糖对小鼠体质量的增加没有明显的抑制作用。环磷酰胺虽然抑瘤效果最好，抑瘤率达到68.91％，但是其对小鼠的增长有明显的抑制作用。而对S₁₈₀腹水瘤小鼠存活期，生物转化组明显高于空白组，具体见表3。

实施例6黄精多糖对动物移植性肿瘤Heps、Eac的活性研究

1.实验材料

1.1药品

供试品：由湖南新汇制药股份有限公司提供。

生理盐水，HyClone公司，批号NXJ0709，500mL/瓶；环磷酰胺(CTX)，HyClone公司，批号NXC0582，500mL/瓶。

1.2实验动物

ICR种小白鼠，18～22g，雌雄各半，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK(湘)2014-0003；在湖南省药物安全评价研究中心屏障环境B区实验室饲养，实验动物质量合格证号：NO43004700004931，实验动物使用许可证号：SYXK(湘)2014-0008。实验期间环境温度20～26℃，湿度40～70％。

2.给药途径

尾静脉注射。

3.给药周期

按移植性肿瘤研究法分别接种Heps实体型、Eac实体型。接种24h后尾静脉注射给药，隔日1次，共给药4次，停药后第二天处死解剖小鼠。

4.给药体积

每20g体质量0.4mL。

5.给药方法

取上述规格小鼠80只按移植性肿瘤研究法分别接种Heps实体型和Eac实体型，接种24h后称小鼠质量，每种移植性肿瘤接种随机分为8组，每组10只，雌雄各半。接种24h后静脉注射给药。隔日1次，共给药4次，于停药后第二天称小鼠质量，处死荷瘤小鼠并分离瘤块，称瘤质量，所得数据进行统计学处理(t检验)。

6.实验结果

6.1黄精多糖对移植性肿瘤Heps的抑制作用

抑瘤率＝(对照组平均质量－实验组平均质量)/对照组平均质量×100％，结果见表4。

表4

注：与空白对照组比较，^*P<0.05，^**P<0.01。

结果表明，与空白对照组相比，实验组各组的瘤质量均小于空白对照组，经统计，均可显著抑制小鼠移植瘤Heps的生长(P<0.01)，抑瘤率均较高。阳性药环磷酰胺(CTX)对移植瘤Heps的抑制作用也很明显(P<0.01)，同时对小鼠体质量影响也较大。

6.2黄精多糖对移植性肿瘤Eac的抑制作用，结果见表5。

表5

注：与空白对照组比较，^*P<0.05，^**P<0.01。

结果表明，与空白对照组相比，HH各组的瘤质量均小于空白对照组，经统计，均可显著抑制小鼠移植瘤Eac的生长(P<0.01)，抑瘤率均较高。阳性药环磷酰胺(CTX)对移植瘤的抑制作用也很明显(P<0.01)，对小鼠体质量影响也较大。

以上结果表明，HH-2即培养基中黄精掺入比例为30％的黄精生物转化菌丝体对H₂₂、S₁₈₀、Heps和Eac瘤株有显著抗肿瘤作用。HH-2提取物采用简单的处理工艺制备得到，其抗肿瘤效果就达到预料不到的技术效果，经生物转化的“菌丝体”的抗肿瘤效果好于所有的天然植物来源的中药材，如果进一步分离纯化富集有效成分，其抗肿瘤效果将更好，可用于制备抗癌药物。

所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种猴头菌的培养基，其特征在于，包括基础培养基和黄精，每100份的培养基中包括基础培养基80～60份，黄精20～40份；所述基础培养基包括如下重量份的各组分：

麦麸560～420份，玉米粉160～120份，谷糠80～60份，水450～550份。

2.根据权利要求1所述的猴头菌的培养基，其特征在于，所述基础培养基包括如下重量份的各组分：

麦麸490份，玉米粉140份，谷糠70份，水500份。

3.根据权利要求1所述的猴头菌的培养基，其特征在于，每100份的培养基中包括基础培养基70份，黄精30份；所述基础培养基包括如下重量百分数的各组分：麦麸70％、玉米粉20％、谷糠10％。

4.一种黄精生物转化菌丝体，其特征在于，将猴头菌类菌株接种至如权利要求1-3任一项所述的培养基中，在20～27℃下，培育40～50天，取出菌丝体，烘干，即得黄精生物转化菌丝体。

5.根据权利要求4所述的黄精生物转化菌丝体，其特征在于，所述猴头菌类菌株为猴头菌科真菌猴头菌Hericium erinaceum(Bull.ex Fr.)Pers。

6.根据权利要求5所述的黄精生物转化菌丝体，其特征在于，所述黄精生物转化菌丝体为猴头菌科真菌猴头菌Hericium erinaceum(Bull.ex Fr.)Pers.的菌丝体与其附生含有黄精成份的固体培养基的干燥混合物。

7.一种黄精生物转化菌丝体的提取物，其特征在于，所述提取物通过以下步骤制备得到：

(1)将如权利要求4-6任一项所述的黄精生物转化菌丝体进行水提，50-70℃下用水浸泡2-3次，每次浸泡2-5小时，水的重量为黄精生物转化菌丝体重量的6～10倍，得到提取液；

(2)将步骤(1)中的提取液减压浓缩，将减压浓缩所得的浓缩液在50-70℃条件下抽真空干燥，即得黄精生物转化菌丝体的提取物。

8.根据权利要求7所述的黄精生物转化菌丝体的提取物，其特征在于，步骤(1)中所述用水浸泡的次数为2次，每次浸泡3小时，水的重量为黄精生物转化菌丝体重量的8倍；步骤(2)中将减压浓缩所得的浓缩液在60℃条件下抽真空干燥。

9.一种如权利要求7或8所述的黄精生物转化菌丝体的提取物在制备抗肿瘤药物中的用途。

10.如权利要求9所述的黄精生物转化菌丝体的提取物在制备抗肿瘤药物中的用途，其特征在于，所述肿瘤为H₂₂实体瘤、S₁₈₀腹水瘤、移植性Heps瘤或移植性Eac瘤的一种或多种。