CN101067006A - 低分子姬松茸多糖及制备方法和在抗肿瘤转移药中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种低分子姬松茸多糖及制备方法和该姬松茸多糖在抗肿瘤转移药中的应用，低分子姬松茸多糖是从食用真菌姬松茸子实体中提取纯化的，主体是由葡萄糖组成的β－(1→3)键联接的均一葡聚糖，分子量约为48000；制备方法是将姬松茸子粉碎实体用蒸馏水浸提，乙醇沉淀，将姬松茸粗多糖用中性蛋白酶与Sevag法联合脱蛋白，并以DEAE650M纤维素柱层析，用NaCl溶液梯度洗脱，洗脱液用Toyopearl HW－65F柱层析，用NaCl溶液洗脱，洗脱物用Toyopearl HW－50S柱层析，并用NaCl溶液洗脱，干燥制得，本发明产品是一种高纯度，并有确定的均一结构的低分子姬松茸多糖，用其制备的抗肿瘤转移药物的疗效在多次临床应用中被证实。

Description

低分子姬松茸多糖及制备方法和在抗肿瘤转移药中的应用

技术领域：

本发明涉及一种低分子姬松茸多糖，本发明还涉及一种该姬松茸多糖的制备方法，另外，本发明还涉及一种该姬松茸多糖在抗肿瘤转移药物中的应用。

背景技术

姬松茸，学名柏氏蘑菇，由于自然分布在南美巴西圣保罗地区，又称巴西蘑菇，是一种珍贵的药用兼食用菌。在真菌分类上，属于担子菌亚门，层菌纲，伞菌目，蘑菇科，蘑菇属，拉丁学名为Agaricus blazei Murill。20世纪60年代，姬松茸被日本成功引种栽培，随后相继传到越南、泰国、印尼及台湾等东亚地区，并于上世纪90年代初引入我国，现在福建和浙江等地有大量栽培。同时，有关姬松茸菌丝体的液体培养技术也研发成功并进行了规模化生产。

日本学者对姬松茸研究逐步深入，从姬松茸子实体、菌丝体和培养基中提取分离出多糖、多糖蛋白和甾体化合物等，并证明了它们的抗肿瘤活性和免疫增强等作用。随着免疫疗法兴起和人们自我保健意识增强，姬松茸备受世人关注，日本已成为姬松茸制品的消费大国。目前，日本每年生产姬松茸20～40万公斤，有30～50万癌症患者把姬松茸用作恶性肿瘤化疗药物的辅助治疗药物。日本学者采用水提醇沉、离子交换色谱、亲和色谱等方法提取了不同性质的姬松茸多糖，并对其进行了结构鉴定和分子量测定。初步确定具有免疫增强作用的4种多糖和具有抗肿瘤作用的3种多糖，都是分子量为200万左右的多糖。我国学者于90年代后期相继开展了姬松茸活性成分的研究，证实其热水提取物及水溶性多糖具有抗肿瘤、调节免疫、保肝和降血糖等多种生物活性。

恶性肿瘤是严重危害人类生命健康的常见病和多发病。2005年全球因肿瘤死亡的人数占死亡总数的12％，在许多国家中超过25％。我国癌症死亡率呈明显上升趋势，2005年统计，新发肿瘤病例210万，死亡160万，死因构成为18.24％，居第二位。恶性肿瘤是危害人类生命健康的重要杀手，大约90％恶性肿瘤患者死于肿瘤转移，控制转移是决定恶性肿瘤患者预后的关键因素。

临床治疗恶性肿瘤主要是采用手术切除、放射性治疗和化学药物治疗等方法。但这些疗法对肿瘤的转移行为控制效果不佳。大约30％新诊断的实体瘤患者已有临床可见的转移灶，而目前发现的抗肿瘤转移剂如维甲酰胺、紫杉醇、阿拉伯半乳糖和肝素等均由化学合成方法得到，毒性比较大，效果不明显。因此，迫切需要一种疗效显著而毒副作用低的抗肿瘤转移天然药物。

发明内容

本发明目的在于提供一种低分子姬松茸多糖，本发明的发明目的还在于提供一种该姬松茸多糖的制备方法，另外，本发明还有一个发明目的就是提供一种该姬松茸多糖在抗肿瘤转移药物中的应用。

本发明的低分子姬松茸多糖，是从食用真菌姬松茸子实体中提取纯化的，主体是由葡萄糖组成的β-(1→3)键联接的均一葡聚糖，分子量约为48000。

上述结论可以通过以下测定结果证实。

本发明低分子姬松茸多糖总糖含量测定：以葡萄糖为标准液，利用苯酚与低分子姬松茸多糖中的糖以及糖的衍生物发生显色反应，生成橙黄色化合物，在490nm处比色测定，测得低分子姬松茸多糖的含量为98.6％。同时配制低分子姬松茸多糖溶液，在260nm、280nm处测定吸收度，结果显示在这两个波长处均未有吸收，表明此低分子姬松茸多糖不含蛋白质。

本发明低分子姬松茸多糖纯度测定：低分子姬松茸多糖通过凝胶柱层析(Sephadex G-100)显示出一个对称的峰型。在旋光度测定中，两次沉淀的比旋度相同，均为+59.1，因此，可以确定该多糖为均一成分。

本发明低分子姬松茸多糖分子量测定：采用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)，以dextran系列多糖为标准品，进行HPGPC分析，以Log MW对RT作图，测定低分子姬松茸多糖分子量约为48000。

本发明低分子姬松茸多糖结构确定：将低分子姬松茸多糖纯品用1mol·L^-1硫酸，100℃水解4h。水解产物进行¹³C-NMR结构分析，发现水解后产物中只含有葡萄糖和2个甲基，可以初步认为低分子姬松茸多糖是由单一葡萄糖组成的葡聚糖。同时根据¹³C-NMR数据显示，该葡聚糖是β型。将低分子姬松茸多糖进行高碘酸氧化，氧化产物进行硼氢化钾还原，还原产物在室温条件下用稀盐酸进行水解后，用薄层层析，以标准葡萄糖为对照品，显色后，鉴别水解产物。结果显示水解产物为葡萄糖，可以推断低分子姬松茸多糖主体是由葡萄糖组成的β-(1→3)键连接的均一葡聚糖。

以下是本发明低分子姬松茸多糖的制备方法：

将姬松茸子实体粉碎，蒸馏水浸提，加入乙醇沉淀得姬松茸粗多糖，将姬松茸粗多糖用中性蛋白酶与Sevag法联合脱蛋白，并以DEAE650M纤维素柱层析，用0.1M的NaCl溶液进行梯度洗脱，洗脱液用Toyopearl HW-65F柱层析，用0.2M的NaCl溶液洗脱，洗脱物用Toyopearl HW-50S柱层析，并用0.2M的NaCl溶液洗脱，干燥即得低分子姬松茸多糖。

再具体一点讲，本发明低分子姬松茸多糖的制备方法包括以下步骤：

步骤一：将姬松茸进行粉碎；步骤二：取过40目筛姬松茸粉，加入10～30倍量的蒸馏水，100℃浸提2～4h；步骤三：提取液经高速离心机离心后，将残渣再加入10～30倍量的蒸馏水，加热至45℃～55℃加入以下组合的复合酶：木瓜蛋白酶1.0～2.0％，纤维素酶0.5～1.0％，果胶酶1.0～2.0％，酶用量按原料干重计算，PH4.5～5.0，酶解1～2h后升温之100℃，在100℃保持2～4h，经高速离心去渣。将2次提取液合并；步骤四：将合并液真空浓缩至原体积的1/2～1/4左右，再加入2～5倍量的90％～100％乙醇，沉淀12～24h，将沉淀物与乙醇溶液分离即得姬松茸粗多糖；步骤五：将姬松茸粗多糖用1～2％中性蛋白酶与Sevag法联合脱蛋白，交替进行2次，离心；步骤六：取去沉淀的多糖溶液，经DEAE650M纤维素柱层析，柱上层析物用0.1M的NaCl溶液进行梯度洗脱；步骤七：洗脱液用Toyopearl HW-65F柱层析，柱上层析物用0.2M的NaCl溶液洗脱；步骤八：0.2M的NaCl溶液洗脱物，用Toyopearl HW-50S柱层析，并用0.2M的NaCl溶液洗脱即得低分子姬松茸多糖。

上述低分子姬松茸多糖可以用于制备抗肿瘤转移药物。

本发明产品高纯度，并有确定的均一结构的低分子姬松茸多糖，因此，其性能特别稳定，这一点不仅便于对其开展更加深入的研究，也为其药物制剂的标准化提供了极大的方便。通过其在抗肿瘤转移药物中的应用疗效证实在该技术领域中具有很好的开发前景。

附图说明

以下结合附图和具体实施例对本发明加以详细说明。

图1为实施例7中时间因素与分组因素对左侧肿瘤直径影响的交互轮廓图

图2为实施例7中时间因素与分组因素对右侧肿瘤直径影响的交互轮廓图

图3为本发明的工艺流程图

具体实施例：

制备例1：制备本发明药物

取姬松茸子实体5kg粉碎；取过40目筛姬松茸子实体粉，加入50kg的蒸馏水，100℃浸提3h；提取液经高速离心机离心后，将残渣再加入50kg的蒸馏水，加热至45℃加入酶用量按原料干重计算的以下复合酶：木瓜蛋白酶1.0％，纤维素酶0.5％，果胶酶1.0％，酶解2h后升温至100℃，在100℃保持3h，经高速离心去渣。将2次提取液合并真空浓缩至原体积的1/3，再加入4倍量的95％乙醇，沉淀24h，将沉淀物与乙醇溶液分离即得姬松茸粗多糖；将姬松茸粗多糖用2％中性蛋白酶，调解PH值5.0，40℃酶解60min，升温至80℃灭活酶的活性，再加中性蛋白酶水解、Sevag法除去蛋白，重复2次，离心，去沉淀；将脱蛋白后的多糖溶液，上DEAE 650M纤维素柱层析，待样品全部进入DEAE 650M纤维素柱后，柱上层析物用0.1M的NaCl溶液进行梯度洗脱；洗脱液用ToyopearlHW-65F柱层析，柱上层析物用0.2M的NaCl溶液洗脱，洗脱物用ToyopearlHW-50S柱层析，并用0.2M的NaCl溶液洗脱即得低分子姬松茸多糖，见图1。

制备例2：制备本发明药物

将姬松茸子实体5kg粉碎；取过40目筛姬松茸子实体粉，加入75kg的蒸馏水，100℃浸提2h；提取液经高速离心机离心后，将残渣再加入75kg的蒸馏水，加热至50℃加入酶用量按原料干重计算的以下复合酶：木瓜蛋白酶1.5％，纤维素酶1.0％，果胶酶1.0％，酶解1.5h后升温至100℃，在100℃保持2h，经高速离心去渣。将2次提取液合并并浓缩至原体积的1/4左右后，加入5倍量的90％乙醇，沉淀18h，将沉淀物与乙醇溶液分离即得姬松茸粗多糖；将姬松茸粗多糖用1.5％中性蛋白酶，调解PH值5.0，40℃酶解60min，升温至80℃灭活酶的活性，再加中性蛋白酶水解、Sevag除去蛋白，重复2次，离心，去沉淀；将脱蛋白后的多糖溶液，上DEAE 650M纤维素柱层析，待样品全部进入DEAE 650M纤维素柱后，柱上层析物用0.1M的NaCl溶液进行梯度洗脱；洗脱液用ToyopearlHW-65F柱层析，柱上层析物用0.2M的NaCl溶液洗脱，洗脱物用ToyopearlHW-50S柱层析，并用0.2M的NaCl溶液洗脱即得低分子姬松茸多糖，见图1。

制备例3：制备本发明药物

将姬松茸子实体4kg粉碎；取过40目筛姬松茸粉，加入80kg的蒸馏水，100℃浸提2h；提取液经高速离心机离心后，将残渣再加入80kg的蒸馏水，加热至45℃加入酶用量按原料干重计算的以下复合酶：木瓜蛋白酶1.0％，纤维素酶1.0％，果胶酶1.0％，酶解2h后升温至100℃，在100℃保持3h，经高速离心去渣。将2次提取液合并并真空浓缩至原体积的1/4左右，再加入3倍量的95％乙醇，沉淀24h，将沉淀物与乙醇溶液分离即得姬松茸粗多糖；将姬松茸粗多糖用1.0％中性蛋白酶，调解PH值5.0，40℃酶解60min，升温至80℃灭活酶的活性，再加中性蛋白酶水解、Sevag法除去蛋白，重复2次，离心，去沉淀；将脱蛋白后的多糖溶液，上DEAE 650M纤维素柱层析，待样品全部进入DEAE 650M纤维素柱后，柱上层析物用0.1M的NaCl溶液进行梯度洗脱；洗脱液用ToyopearlHW-65F柱层析，柱上层析物用0.2M的NaCl溶液洗脱，洗脱物用ToyopearlHW-50S柱层析，并用0.2M的NaCl溶液洗脱即得低分子姬松茸多糖，见图1。

制备实施例4：制备注射剂

精确称取低分子姬松茸多糖500mg，分别置于50ml容量瓶中，用生理盐水注射液溶解、定容，得10g·L^-1药物样品母液，0.22μm滤膜除菌后，分装、冻存。使用时解冻、摇均、用生理盐水注射液稀释至合适浓度，0.22μm滤膜除菌。

试验例1：本发明的药物对小鼠黑色素瘤细胞B16实验性肺转移的影响

取对数生长期小鼠黑色素瘤B16细胞，用PBS液调细胞悬液浓度为1×10⁶cell·ml^-1，给每只6周龄C57BL/6雄性小鼠尾静脉注射浓度为1×10⁶cell·ml^-1细胞悬液0.2ml，共48只。将尾静脉注射成功的40只C57BL/6小鼠随机分为4组，开始腹腔注射给药，本药分三个剂量组(50mg·kg^-1·d^-1、100mg·kg^-1·d^-1和200mg·kg^-1·d^-1)，共14天。第15天颈椎脱臼处死小鼠，取肺组织，Bouin’s氏液固定解剖显微镜下观察并记录C57BL/6肺表面节结数。最后用Tamhane的方法检验肺转移节结数的组间差异，结果见表1。

表1本发明的药物对B16细胞实验性肺转移结节数的影响( x±s，n＝10)

组别	剂量(mg·kg-1·d-1)	肺转移结节数
			模型对照组低分子姬松茸多糖组低分子姬松茸多糖组低分子姬松茸多糖组	050100200	118.0±35.774.8±16.0382.5±12.1240.8±12.74*

注：与模型对照组比较，^*P＜0.01。

由结果可知，C57BL/6小鼠尾静脉注入黑色素瘤细胞15d后肺转移灶平均数目为118.0±35.7，腹腔注射200mg·kg^-1·d^-1低分子姬松茸多糖可显著抑制B16小鼠黑色素瘤的实验性肺转移，与模型对照组比较，高剂量低分子姬松茸多糖可降低小鼠的肺转移数目(40.8±12.74)，有显著性差异(P＜0.01)。提示本发明药物具有抗恶性肿瘤转移作用。病理切片证实，肺转移瘤灶为B16肺肿瘤。

试验例2：本发明药物对人肝癌细胞Bel-7402侵袭能力的影响

用预冷的DMEM培养基稀释Matrigel使终浓度为1.0mg·ml^-1的混合液。分别吸取混合液以每孔20μl加入Transwell插件即上室内，并使其展开平铺于插件底部。将呈对数期生长的Bel-7402细胞，加入本发明物使终浓度低分子姬松茸多糖低剂量组为5μg·ml^-1、低分子姬松茸多糖中剂量组为10μg·ml^-1、低分子姬松茸多糖高剂量组为20μg·ml^-1、对照孔加DMEM培养基，共同孵育48h后，用DMEM完全培养基重悬细胞，并调整细胞悬液浓度为5×10⁵cell·ml^-1。将对数生长期的NIH3T3细胞以无血清DEME继续培养24h后收集上清并向Transwell下室内每孔加入培养上清0.6ml，将Bel-7402细胞悬液5×10⁵cell·ml^-1每孔0.1ml加入Transwell上室。置CO₂培养箱孵育24h后取出小室，用棉签轻轻拭去滤膜上层未迁移的Bel-7402细胞后，将整个小室放入甲醛中固定、HE染色。于光学显微镜400×下拍照，计数穿过滤膜的细胞数。每个膜计数上下左右中5个随机不同视野，每组平行设3个滤膜。

侵袭抑制率按下列公式计算：

侵袭抑制率(IR％)＝(对照组穿膜细胞数-处理组穿膜细胞数)/对照组穿膜细胞数×100％

采用SNK的统计方法检验穿过滤膜的细胞数的组间差异，结果见表2。

表2  本发明的药物对Bel-7402侵袭能力的影响( x±s，n＝3)

组别	药物浓度(μg·ml-1)	细胞数(个)	抑制率
				空白对照组低分子姬松茸多糖组低分子姬松茸多糖组低分子姬松茸多糖组	051020	101±573±7*58±3*41±2*	-27.9±7.142.3±2.758.9±2.7

注：与空白对照组组比较，^*P＜0.01。

由结果可知，本发明药物能显著抑制人肝癌细胞Bel-7402体外侵袭基底膜成分Matrigel的能力，其抑制率分别为(27.9±7.1)％、(42.3±2.7)％和(58.9±2.7)％，并且对肿瘤细胞侵袭能力的抑制作用呈剂量依赖性，表明低分子姬松茸多糖对人肝癌细胞Bel-7402侵袭能力有抑制作用。

试验例3：本发明药物对基质胶诱导的新血管生成影响

24只C57BL/6雄性小鼠随机分成4组，即空白对照组，模型对照组、低分子姬松茸多糖高剂量组和低分子姬松茸多糖低剂量组。空白对照组小鼠背部皮下注射0.5ml基质胶；模型对照组注射0.5ml含有10ng VEGF和16units肝素基质胶混合液；低分子姬松茸多糖高剂量组注射0.5ml含有10ng VEGF、16units肝素和100μg低分子姬松茸多糖的基质胶混合液；低分子姬松茸多糖低剂量组注射0.5ml含有10ng VEGF、16units肝素和50μg低分子姬松茸多糖的基质胶混合液。第7天，处死小鼠并取出基质胶称重后，置于4％多聚甲醛PBS液中固定，石蜡包埋，切片。将石蜡切片常规脱蜡至水，用3％H₂O₂去离子水孵育，蒸馏水冲洗，PBS冲洗浸泡，柠檬酸高温修复，PBS冲洗。每张切片滴加50μl非免疫动物血清，室温孵育，弃去血清。每张切片滴加1∶100比例稀释的RabbitAnti-CD34 50μl，4℃冰箱过夜。PBS冲洗，滴加山羊抗小鼠IgG抗体-HRP多聚体，37℃孵育，PBS冲洗。DBA显色剂显色，显微镜下观察控制着色结果，在适当的时候终止反应。苏木素复染，脱水，树脂封片，显微镜下观察。抗CD34抗体标记基质胶内皮细胞，计数单位面积中的微血管数目。基质胶重量经Tamhane检验结果见表3。本发明物对新生血管数量的影响结果经Tamhane检验结果见表4。

               表3  本发明的药物对基质胶重量的影响

组别	例数(只)	基质胶重量(mg)
			空白对照组模型对照组低分子姬松茸多糖低剂量组低分子姬松茸多糖高剂量组	5566	20.26±1.24286.50±40.81△76.48±28.53*73.81±11.77*

注：与空白对照组比较^△P＜0.01；与模型对照组比较，^*P＜0.01；

    表4  本发明的药物对微血管密度的影响( x±s)

组别	例数(只)	血管数
			空白对照组模型对照组低分子姬松茸多糖低剂量组低分子姬松茸多糖高剂量组	5566	6.6±2.647.4±8.5△21.5±2.4*21.7±2.9*

注：与正常对照组比较^△P＜0.01；与模型对照组比较，^*P＜0.05。

试验例4：本发明药物对人白血病细胞K562增殖的影响

取处于对数生长期且台盼蓝拒染率大于95％的K562细胞，用RPMI-1640培养液(含10％胎牛血清)将沉淀细胞浓度调为1×10⁵cell·ml^-1细胞悬液后，将细胞接种于96孔培养板。每孔加细胞悬液100μl(1×10⁴cell)，然后分别加入浓度为低分子姬松茸多糖10μg·ml^-1、低分子姬松茸多糖20μg·ml^-1、低分子姬松茸多糖40μg·ml^-1和不含药物的培养液各100μl，每孔4个平行孔，使总体积达200μl。调零孔不加K562细胞悬液，只加含10％胎牛血清RPMI-1640 200μl。混匀后置37℃、5％CO₂，95％湿度条件下培养44h后，每孔加入5mg·ml^-1的MTT磷酸缓冲液20μl，同样条件下继续培养4h，终止培养。1000rpm离心5min，然后弃去培养板孔内的培养液，每孔加入150μl DMSO，震荡10min，使形成的甲臜颗粒充分溶解后，酶标仪检测吸光值。选择测定波长570nm，参考波长655nm。按下面公式计算细胞生长抑制率。

细胞生长抑制率(％)＝(1-实验孔OD₅₇₀/对照孔OD₅₇₀)×100％

OD₅₇₀通过Tamhane检验，结果见表5。

          表5  本发明的药物对人白血病细胞K562的影响( x±s，n＝5)

组别	药物浓度(μg·ml-1)	OD570值	平均生长抑制率(％)
				阴性对照组低分子姬松茸多糖组低分子姬松茸多糖组低分子姬松茸多糖组	051020	0.482±0.0030.386±0.011△0.378±0.017△0.361±0.022△	-18.9424.3322.70

注：与阴性对照组比较，^△P＜0.01。

本实验结果表明，低分子姬松茸多糖对体外培养的人白血病细胞K562细胞增殖表现出一定抑制作用，高剂量低分子姬松茸多糖、中剂量低分子姬松茸多糖和低剂量低分子姬松茸多糖对K562细胞平均生长抑制率分别为24.33％、22.70％和18.94％，表明低分子姬松茸多糖抑制K562增殖作用呈剂量依赖性。与阴性对照组比较，低分子姬松茸多糖各剂量组OD₅₇₀差异具有统计学意义，表明低分子姬松茸多糖具有较强的体外抗肿瘤作用。

试验例5：本发明药物对小鼠NK细胞杀伤活性的影响

将细胞浓度为1×10⁷·ml^-1S180瘤株，给6周龄BALB/c雄性小鼠每只右后侧腋窝皮下接种0.2ml(2×10⁶cell)复制动物模型，从模型复制后第2天，低分子姬松茸多糖低剂量组按50mg·kg^-1·d^-1、低分子姬松茸多糖中剂量组按100mg·kg^-1·d^-1和低分子姬松茸多糖高剂量组按200mg·kg^-1·d^-1腹腔注射给药，模型对照组和空白对照组腹腔注射等体积的生理盐水。给药共7天。给药结束后24h，脱颈椎处死小鼠。75％酒精浸泡消毒后，在无菌条件下取出脾脏并制成单个脾细胞悬液，0.83％Tris-NH₄Cl破坏红细胞，洗涤脾细胞后，用RPMI-1640完全培养液调脾细胞浓度为1×10⁶·ml^-1。将1×10⁶cell·ml^-1脾细胞加入96孔细胞培养板中，将Yac-1细胞(调细胞浓度为1×10⁵·ml^-1)取50μl分别加于测试孔内，使效靶比为10∶1，加1640培养液100μl。另外3孔为效应细胞对照孔，每孔加入脾细胞为50μl，1640培养液150μl。同时另设3孔为靶细胞对照孔，浓度为1×10⁵·ml^-1Yac-1细胞悬液50μl/孔，完全RPMI-1640培养液150μl/孔。混匀，在5％CO₂、37℃条件下培养20h后，每孔加入浓度为5mg·ml^-1MTT 10μl，在5％、37℃中继续培养4h。培养结束后，离心，弃上清，每孔加入二甲亚砜100μl，微型振荡器震荡数分钟，使颗粒完全溶解。酶联免疫检测仪在570nm波长处检测各孔吸光度。

自然杀伤率％＝[1-(实验孔OD₅₇₀-效应细胞孔OD₅₇₀)/靶细胞OD₅₇₀]×100％

NK细胞活性实验数据经Tamhane检验结果见表6。

             表6  本发明的药物对NK细胞活性的影响( x±s)

组别	剂量(mg·kg-1·d-1)	例数(只)	NK细胞活性(％)
				正常对照组模型对照组低分子姬松茸多糖组低分子姬松茸多糖组低分子姬松茸多糖组	0050100200	1211111211	36.32±5.9223.10±3.12△32.27±3.06*37.35±5.64*39.12±3.84*

注：与正常对照组比较^△P＜0.01；与模型对照组比较，^*P＜0.01。

结果表明，与正常对照组相比较，模型对照组NK细胞活性明显降低(P＜0.01)，差异具有统计学意义。与模型对照组比较，低分子姬松茸多糖低剂量组、低分子姬松茸多糖中剂量组和低分子姬松茸多糖高剂量组NK活性明显升高，且具有显著性差异(P＜0.01)。NK细胞活性和低分子姬松茸多糖呈剂量依赖性。结果提示低分子姬松茸多糖能增强NK细胞杀伤靶细胞的能力，进而通过免疫调节作用提高机体的抗肿瘤转移能力。

试验例6：本发明药物对脾淋巴细胞增殖的影响

颈椎脱臼处死BALB/c小鼠，75％酒精浸泡消毒后，在无菌条件下取出脾脏。并制成单个细胞悬液。用0.83％Tris-NH₄Cl破坏红细胞，用RPMI-1640完全培养液调脾细胞浓度为1×10⁷cell·ml^-1。在无菌条件下，向96孔培养板加入浓度为1×10⁷·ml^-1脾细胞悬液，每孔100μl(1×10⁶cell)。除空白对照孔外，各孔均加刀豆素A(Concanavalin-A，ConA)，使终浓度为3μg·ml^-1。之后加入含不同药物的培养基，使总体积达200μl，不足部分用完全培养剂补齐，脾细胞终浓度为5×10⁶cell·ml^-1，每种处理因素均为5个平行孔，同时设对照孔。加样后置37℃、5％CO₂和95％湿度条件下孵育44h后，轻轻吸弃上清，每孔加入5mg·ml^-1的MTT溶液10μl，于振荡器上震荡1min。放置5％CO₂、37℃培养箱反应继续孵育4h后，取出96孔培养板，2000rpm离心5min，弃去培养板内培养液和MTT，每孔加入100μl DMSO溶液，振荡10min，以溶解残留的MTT-甲臜结晶。不加任何干预药为阴性对照，以RMPI-1640完全培养液为空白对照，用酶标仪在570nm波长下测各孔OD值。以刺激指数(SI＝实验孔OD均值/对照孔OD均值)判断淋巴细胞的转化程度。

测得的OD₅₇₀数据经SNK法统计检验结果见表7。

   表7  本发明药物对脾淋巴细胞增殖的影响( x±s，n＝5)

组别

药物浓度(μg·ml-1)

ConA(μg·ml-1)

OD570值

平均SI

空白对照组阴性对照组低分子姬松茸多糖组低分子姬松茸多糖组低分子姬松茸多糖组

0051020

03333

0.331±0.0200.462±0.067△0.541±0.036**0.557±0.037**0.515±0.028*

-1.401.641.681.55

注：与空白对照组组比较，^△P＜0.01；与阴性对照组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01；

本实验结果显示，与空白对照组比较，ConA诱导后阴性对照组OD₅₇₀值显著增加，表明ConA对脾淋巴细胞增殖有促进作用。低分子姬松茸多糖各剂量组均能促进ConA诱导的小鼠T淋巴细胞增殖反应(P＜0.01)，但各剂量组之间没有显著性差异，表明低分子姬松茸多糖促进脾淋巴细胞增殖作用不呈剂量依赖性。本实验结果表明，低分子姬松茸多糖具有增强机体免疫功能的作用。

试验例7：本发明药物对双侧肿瘤小鼠模型远端肿瘤的抑制作用

将S180瘤株调整细胞浓度为5×10⁶cell·ml^-1和1×10⁶cell·ml^-1，每只小鼠右侧胁部皮下接种1×10⁶cell，左侧胁部接种2×10⁵cell，整个操作过程30min完成。造模后24h，随机将60只模型小鼠分为4组，每组10只。即低分子姬松茸多糖高剂量组、低分子姬松茸多糖中剂量组、低分子姬松茸多糖低剂量组和模型对照组。造模后第3天、第4天和第5天向右侧肿瘤内注射给药，低分子姬松茸多糖低剂量组注射12.5mg·kg^-1·d^-1、低分子姬松茸多糖中剂量组注射25mg·kg^-1·d^-1、低分子姬松茸多糖高剂量组注射50mg·kg^-1·d^-1的低分子姬松茸多糖，每天给药一次，共给药3次。造模后第3天、第5天、第7天、第10天、第12天、第14天、第17天、第19天和第21天，分别测量双侧荷瘤小鼠两侧肿瘤直径。第21天，颈椎脱臼处死小鼠。取双侧肿瘤，称肿瘤重量。对本试验两侧肿瘤直径数据采用重复测量数据的多因素方差分析比较。对肿瘤重量差异的显著性分析用Tamhane法检验。时间因素与分组因素对左侧肿瘤直径影响的交互轮廓图见附图1，时间因素与分组因素对右侧肿瘤直径影响的交互轮廓图见附图2。低分子姬松茸多糖对双侧荷瘤小鼠模型双侧肿瘤重量的影响见表8。

表8  低分子量姬松茸多糖对双侧肿瘤小鼠模型肿瘤重量的影响( x±s，n＝10)

组别	剂量(mg·kg-1·d-1)	左侧肿瘤		右侧肿瘤
						左侧瘤重(g)	抑瘤率(％)	右侧瘤重(g)	抑瘤率(％)
		模型对照组低分子姬松茸多糖组低分子姬松多糖组低分子姬松茸多糖组	012.52550	1.66±0.181.31±0.2*1.30±0.1*0.97±0.1*	-21.2521.5941.85					3.60±0.581.73±0.14*1.26±0.10*1.05±0.09*	-51.8864.9870.78

注：与模型对照组比较，^*P＜0.01。

本研究右侧接种较大的S180瘤细胞浓度被认为是原发瘤，而左侧接种较小的瘤细胞浓度被认为是转移瘤。实验结果表明，姬松茸多糖不仅抑制了右侧的肿瘤生长，而且也抑制了左侧的未给药部位的肿瘤生长，表明在一个部位的瘤内注射姬松茸低分子量多糖对另一部位的肿瘤生长有抑制作用，从而可抑制肿瘤的转移。

Claims (4)

1、一种低分子姬松茸多糖，是从食用真菌姬松茸子实体中提取纯化的，主体是由葡萄糖组成的β-(1→3)键联接的均一葡聚糖，分子量约为48000。

2、一种如权利要求1述的低分子姬松茸多糖的制备方法，将姬松茸子实体粉碎，蒸馏水浸提，加入乙醇沉淀得姬松茸粗多糖，将姬松茸粗多糖用中性蛋白酶与Sevag法联合脱蛋白，并以DEAE650M纤维素柱层析，用0.1M的NaCl溶液进行梯度洗脱，洗脱液用Toyopearl HW-65F柱层析，用0.2M的NaCl溶液洗脱，洗脱物用Toyopearl HW-50S柱层析，并用0.2M的NaCl溶液洗脱，干燥即得低分子姬松茸多糖。

3、根据权利要求2所述的低分子姬松茸多糖的制备方法，其制备具体包括以下步骤：

步骤一：将姬松茸进行粉碎；步骤二：取过40目筛姬松茸粉，加入10～30倍量的蒸馏水，100℃浸提2～4h；步骤三：提取液经高速离心机离心后，将残渣再加入10～30倍量的蒸馏水，加热至45℃～55℃加入按原料干重计算的复合酶：木瓜蛋白酶1.0～2.0％，纤维素酶0.5～1.0％，果胶酶1.0～2.0％，PH4.5～5.0，酶解1～2h后升温之100℃，在100℃保持2～4h，经高速离心去渣；将2次提取液合并；步骤四：将合并液真空浓缩至原体积的1/2～1/4左右，再加入2～5倍量的90％～100％乙醇，沉淀12～24h，将沉淀物与乙醇溶液分离即得姬松茸粗多糖；步骤五：将姬松茸粗多糖用1～2％中性蛋白酶与Sevag法联合脱蛋白，交替进行2次，离心；步骤六：取去沉淀的多糖溶液，经DEAE650M纤维素柱层析，柱上层析物用0.1M的NaCl溶液进行梯度洗脱；步骤七：洗脱液用ToyopearlHW-65F柱层析，柱上层析物用0.2M的NaCl溶液洗脱：步骤八：0.2M的NaCl溶液洗脱物，用Toyopearl HW-50S柱层析，并用0.2M的NaCl溶液洗脱即得低分子姬松茸多糖。

4.权利要求1所述的低分子姬松茸多糖在制备抗肿瘤转移的药物中的应用。

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