CN103784492A - 具有抗肿瘤作用的铜锤玉带草提取物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药用植物铜锤玉带草[Pratia begonafolia(Wall)Lindl.or P.nummularia(Lam.)A.Br.et Aschers]，具体涉及具有抗肿瘤作用的铜锤玉带草提取物及其应用。本发明在铜锤玉带草原有化学成分和传统功效的研究基础上，同时制备其活性提取物，和现有技术相比，提出了铜锤玉带草提取物可以对抗H22荷瘤小鼠的肿瘤增殖，且提高机体免疫力，增强抗氧化作用，表明该活性提取物对肿瘤增长具有明显的抑制作用。

Description

具有抗肿瘤作用的铜锤玉带草提取物及其应用

技术领域

本发明涉及药用植物铜锤玉带草[Pratia begonafolia(Wall)Lindl.or P.nummularia(Lam.)A.Br.et Aschers]，具体涉及具有抗肿瘤作用的铜锤玉带草提取物及其应用。

背景技术

肿瘤是是世界范围内多发的疾病之一，大多数患者确诊时已属癌症晚期，目前治疗手段以手术化疗及放疗相结合的综合立体疗法，以期减少肿瘤的多药耐药的发生。目前抗肿瘤药物对正常癌细胞杀伤同时也破坏机体免疫功能，带来严重的副作用。

研究发现，多种植物药具有明显的抗肿瘤作用，如人参，女贞子，天冬等。铜锤玉带草又名小铜锤、地扣子、铜锤草、地石榴等，基源植物为桔梗科草本植物铜锤玉带草[Pratiabegonafolia(Wall)Lindl.or P.nummularia(Lam.)A.Br.et Aschers]的干燥全草，可作为野菜食用。具有祛风除湿，活血，解毒之功效，可用于治疗风湿疼痛，跌打损伤，乳痈，无名肿毒等作用。

具报道其含有黄酮、聚乙炔、三萜酯等成分，现代药理学对其药理活性研究鲜有报道。到目前为止，未见以铜锤玉带草为原料制备活性提取物的制备技术，也未见以铜锤玉带草为主要组成组分应用抗肿瘤药品或保健品的报道。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种具有抗肿瘤作用的铜锤玉带草提取物及其应用。

具有抗肿瘤作用的铜锤玉带草提取物，其制备方法具有以下特征：将干燥的铜锤玉带草粉碎至细粉，水提取3次，滤过，合并提取液，浓缩提取液至得浸膏；用水混悬所述浸膏，上大孔树脂色谱，依次用水和乙醇冲洗；收集乙醇洗脱组分，减压回收乙醇，真空干燥，既得具有抗肿瘤作用的铜锤玉带草提取物。该提取物对H22荷瘤小鼠具有明显的抗肿瘤作用，具有提高机体免疫力等作用。

所述细粉为过200筛，所述大孔树脂为通用大孔树脂，所述乙醇为浓度50%～100%的乙醇水溶液。细粉为过200筛有利于有效成分浸出，浓度50%～100%的乙醇水溶液可以洗出有效组分中的主要成分。

所述的通用大孔树脂为D101树脂或NKA树脂。

所述乙醇洗脱组分的主要成分为黄酮类化合物。

本发明的又一个目的在于提供一种上述的方法制备得到的具有抗肿瘤作用的铜锤玉带草提取物在制备抗肿瘤药物或抗肿瘤保健品中的应用。该提取物对H22荷瘤小鼠具有明显的抗肿瘤作用，具有提高机体免疫力等作用。

所述药物或保健品为片剂、注射剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、薇丸、滴丸剂、汤剂、糖浆剂、合剂、煎膏剂或浸膏剂或其他药学上可接受的载体。

铜锤玉带草提取物制成胶囊剂时把铜锤玉带草提取物和载体乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，然后装胶囊制成胶囊剂。

铜锤玉带草制成片剂时，把铜锤玉带草提取物和载体乳糖或玉米淀粉，需要时加入润滑剂硬脂酸镁，混合均匀，然后压片制成片剂。

铜锤玉带草提取物制成颗粒剂时，把铜锤玉带草提取物和稀释剂乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，干燥，制成颗粒剂。

铜锤玉带草提取物制成其他剂型时，可按药学常规方法制备得到，这里不一一赘述。

本发明的有益效果：本发明在铜锤玉带草原有化学成分和传统功效的研究基础上，同时制备其活性提取物，和现有技术相比，提出了铜锤玉带草提取物可以对抗H22荷瘤小鼠的肿瘤增殖，且提高机体免疫力，增强抗氧化作用，表明该活性提取物对肿瘤增长具有明显的抑制作用。因此，铜锤玉带草提取物有望开发成为新一代安全有效，用于抗肿瘤的药物或保健品。

具体实施方式

以下结合具体实施例对发明做出进一步说明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不限制本发明的范围，在阅读本发明后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本发明所附权利要求限定的范围。

实施例1

具有抗肿瘤作用的铜锤玉带草提取物，其通过以下方法制备得到：

将干燥的铜锤玉带草粉碎至过200目的细粉，10倍量水提取3次，滤过，合并提取液，浓缩提取液至得浸膏；用水混悬所述浸膏，上大孔树脂D101色谱，依次用水和50%乙醇冲洗；收集50%乙醇洗脱组分，减压回收乙醇，真空干燥，既得具有抗肿瘤作用的铜锤玉带草提取物。

实施例2

具有抗肿瘤作用的铜锤玉带草提取物，其通过以下方法制备得到：

将干燥的铜锤玉带草粉碎至过200目的细粉，5倍量水提取3次，滤过，合并提取液，浓缩提取液至得浸膏；用水混悬所述浸膏，上大孔树脂D101色谱，依次用水和100%乙醇冲洗；收集100%乙醇洗脱组分，减压回收乙醇，真空干燥，既得具有抗肿瘤作用的铜锤玉带草提取物。

实施例3

具有抗肿瘤作用的铜锤玉带草提取物，其通过以下方法制备得到：

将干燥的铜锤玉带草粉碎至过200目的细粉，10水提取3次，滤过，合并提取液，浓缩提取液至得浸膏；用水混悬所述浸膏，上大孔树脂D101色谱，依次用水和75%乙醇冲洗；收集50%乙醇洗脱组分，减压回收乙醇，真空干燥，既得具有抗肿瘤作用的铜锤玉带草提取物。

实施例4

具有抗肿瘤作用的铜锤玉带草提取物，其通过以下方法制备得到：

将干燥的铜锤玉带草粉碎至过200目的细粉，10水提取3次，滤过，合并提取液，浓缩提取液至得浸膏；用水混悬所述浸膏，上大孔树脂NKA色谱，依次用水和50%乙醇冲洗；收集50%乙醇洗脱组分，减压回收乙醇，真空干燥，既得具有抗肿瘤作用的铜锤玉带草提取物。

实施例5

具有抗肿瘤作用的铜锤玉带草提取物，其通过以下方法制备得到：

将干燥的铜锤玉带草粉碎至过200目的细粉，5倍量水提取3次，滤过，合并提取液，浓缩提取液至得浸膏；用水混悬所述浸膏，上大孔树脂NKA色谱，依次用水和100%乙醇冲洗；收集100%乙醇洗脱组分，减压回收乙醇，真空干燥，既得具有抗肿瘤作用的铜锤玉带草提取物。

实施例6

具有抗肿瘤作用的铜锤玉带草提取物，其通过以下方法制备得到：

将干燥的铜锤玉带草粉碎至过200目的细粉，10水提取3次，滤过，合并提取液，浓缩提取液至得浸膏；用水混悬所述浸膏，上大孔树脂NKA色谱，依次用水和60%乙醇冲洗；收集50%乙醇洗脱组分，减压回收乙醇，真空干燥，既得具有抗肿瘤作用的铜锤玉带草提取物。

实施例7

铜锤玉带草活性提取物抗肿瘤实验研究

一、实验材料、仪器和试剂

1、实验材料

铜锤玉带草提取物采自广西，经赵立春博士鉴定为桔梗科植物铜锤玉带草的干燥全草，采用实施例1-6方法制得铜锤玉带草提取物；2、实验仪器

电子分析天平，全波长扫描酶标仪

3、实验试剂

阳性药：环磷酰胺，购于吉林省肿瘤医院；羧甲基纤维素钠（食品级）；生理盐水等；组织固定液，北京化工厂；组织匀浆机，江苏省金坛市恒丰仪器制造有限公司；ALT和AST试剂盒，南京建成生物工程有限公司；TNF-α试剂盒，武汉华美生物工程有限公司；白介素12（IL-12）试剂盒，武汉华美生物工程有限公司；肿瘤坏死因子（TNF-α）试剂盒，武汉华美生物工程有限公司；小鼠维持饲料，吉林大学实验动物中心提供；镊子；剪刀；注射器；灌胃针等

4、实验动物

清洁级雄性ICR小鼠，体重(20±2)

二、实验方法

1、动物分组

C57小鼠腋下接种H22肿瘤造模成功后共分为6组，灌胃方式为灌胃，如下：

对照组：生理盐水（CON），阳性药组：环磷酰胺组（CTX，腹腔注射），受试药组：铜锤玉带草提取物低剂量组50mg/Kg（PBE-L），铜锤玉带草提取物中剂量组100mg/Kg（PBE-M），铜锤玉带草提取物高剂量组200mg/Kg（PBE-H）。

2、药物的配制

阳性药：环磷酰胺20mg/kg，生理盐水溶解，待腹腔注射；空白给药组（阴性对照组）：注射用生理盐水，灌胃给药；受试药：灌胃（口服）给药

3、腹水瘤鼠的制备

取3只普通ICR小鼠，正常饲养1周，用于实验。于液氮罐中取冻存的H22细胞，37度复苏后，弃去细胞保存液，用生理盐水混悬，注射到3只ICR小鼠腹腔中，三天后每天称重，接种5-7天后，待腹部隆起，接种成功。

4、肿瘤鼠的制备

取接种5-7天的ICR鼠腹水癌细胞，用生理盐水制成细胞个数为1×106/ml的细胞悬液，以每鼠0.1ml接种于小鼠右腋皮下肿瘤细胞移植以后，次日，肿瘤小鼠被随机分成不同的给药组，每组12只，开始给药试验。

对照组只给生理盐水。给药组用羧甲基纤维素钠水溶液配置不同给药浓度，剂量如上，灌胃方式给药，给药剂量为0.2ml/10g。阳性药环磷酰胺，用生理盐水配置，腹腔注射给药。

给药14天（2周）后，小鼠摘眼球取血处死，血清静置2小时，离心，取血清测各种生化指标。待测TNF-α（肿瘤坏死因子）和IL-2（白介素-2）含量。TNF-α和IL-2测定采用ELISA酶联免疫检测法，操作步骤按试剂盒给定说明书程序进行。

小心剥取瘤块、胸腺和脾脏，分别称重，计算数值。

5、数据统计处理

C57小鼠肿瘤抑制率的计算

抑制率=（对照组平均瘤重-给药组平均瘤重）/对照组平均瘤重×100%。

胸腺指数为每克体重胸腺的毫克数，脾指数为每克体重中脾脏的毫克数，所有的数据均进行均值和方差处理，参数值用均值±标准差（Mean±SD）表示，组间比较采用了T检验，p<0.05为有显著性差异。给药组间差异显著性比较，显著性差异*p<0.05。

三、实验结果

1、对C57小鼠体重的影响

试验开始后，隔日计算小鼠体重变化，确定给药剂量，从统计结果我们可以看出给药组与空白对照组体重相比无显著性差异（P>0.05）。空白对照组、环磷酰胺给药组组、铜锤玉带草高剂量组体重呈下降趋势，而其各组增加明显，但各组之间没有显著性差异（P>0.05）。一般来说，小鼠肿瘤模型造模成功后，各组对体重无显著影响。

2、对C57小鼠H22荷瘤的抑制作用

统计结果见下表。从统计结果中我们可以看出，与阴性对照组相比，阳性组（CTX）与其具有显著性差异（p<0.01），给药14天后，显著抑制肿瘤的增殖，受试药中PBE-L组，抑制肿瘤增长不明显，高剂量PBE-H和中剂量PBE-M组抑制肿瘤增殖明显，均具有显著性差异（p<0.01）。

表1 铜锤玉带草活性提取物抑瘤率作用

注：与对照组(阴性)相比，“*”P≤0.05

3、对小鼠免疫器官指数的影响

胸腺和脾脏是重要的免疫器官,其脏器指数可在一定程度上反映机体免疫功能的强弱。胸腺的主要功能是产生Ｔ淋巴细胞和分泌胸腺素,主要参与细胞免疫；脾脏中有丰富的淋巴细胞和巨噬细胞，但Ｂ淋巴细胞比例较大，因此与体液免疫关系更为密切。

脾脏是重要的免疫器官，正常肿瘤患者脾脏功能受到影响，给药后可以部分改善脾功能。本部分实验，给药14天后，取脾脏，观察给药后，是否对其有影响。结果表明：给药14天后，阳性药环磷酰胺组肝指数升高，给药组铜锤玉带草高剂量组可以显著降低肿瘤小鼠的肝指数，与化学药相比，中药铜锤玉带草对肝脏具有保护作用。

同时，本实验亦观察小鼠胸腺指数，观察给药14天后，给药组是否影响胸腺指数。结果表明：给药14天后，阳性药组胸腺指数下降明显，但经过给药14天治疗后，铜锤玉带草高剂量组可以显著升高小鼠胸腺指数，提供肿瘤小鼠免疫力，中剂量组合低剂量组对胸腺指数无影响。

表2 铜锤玉带草活性提取物对免疫器官的影响

注：与对照组(阴性)相比，“*”P≤0.05

5、对小鼠IL-12和TNF-α的影响

白细胞介素12（IL-12）被认为是细胞免疫应答过程中的关键调节因子，具有明显的抗肿瘤活性,已成为肿瘤免疫治疗及综合治疗中的热点。大量动物实验表明，IL-12不仅能抑制肿瘤的生长，而且能抑制肿瘤的转移，延长荷瘤动物的生存时间。

TNF-α（肿瘤坏死因子-α），该物质表达升高，可以有效杀死癌细胞作用。本部分重点探讨铜锤玉带草提取物对H22荷瘤小鼠的IL-12和TNF-α表达影响。

结果表明：高剂量可以有效升高IL-12的含量，具有显著意义（P≤0.05），对TNF-α无影响；中剂量组和低剂量组对二者影响无统计学意义（数据略）。

实施例8

所述药物或保健品为片剂、注射剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、薇丸、滴丸剂、汤剂、糖浆剂、合剂、煎膏剂或浸膏剂或其他药学上可接受的载体。

实施例9

铜锤玉带草提取物制成胶囊剂时把铜锤玉带草提取物和载体乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，然后装胶囊制成胶囊剂。

实施例10

铜锤玉带草制成片剂时，把铜锤玉带草提取物和载体乳糖或玉米淀粉，需要时加入润滑剂硬脂酸镁，混合均匀，然后压片制成片剂。

实施例11

铜锤玉带草提取物制成颗粒剂时，把铜锤玉带草提取物和稀释剂乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，干燥，制成颗粒剂。

铜锤玉带草提取物制成其他剂型时，可按药学常规方法制备得到，这里不一一赘述。

Claims (6)

1.具有抗肿瘤作用的铜锤玉带草提取物，其制备方法具有以下特征：将干燥的铜锤玉带草粉碎至细粉，水提取3次，滤过，合并提取液，浓缩提取液至得浸膏；用水混悬所述浸膏，上大孔树脂色谱，依次用水和乙醇冲洗；收集乙醇洗脱组分，减压回收乙醇，真空干燥，既得具有抗肿瘤作用的铜锤玉带草提取物。

2.如权利要求1所述的具有抗肿瘤作用的铜锤玉带草提取物，其特征在于：所述细粉为过200筛，所述大孔树脂为通用大孔树脂，所述乙醇为浓度50%～100%的乙醇水溶液。

3.如权利要求2所述的具有抗肿瘤作用的铜锤玉带草提取物，其特征在于：所述的通用大孔树脂为D101树脂或NKA树脂。

4.如权利要求1所述的具有抗肿瘤作用的铜锤玉带草提取物，其特征在于：所述乙醇洗脱组分的主要成分为黄酮类化合物。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法制备得到的具有抗肿瘤作用的铜锤玉带草提取物在制备抗肿瘤药物或抗肿瘤保健品中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物或保健品为片剂、注射剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、薇丸、滴丸剂、汤剂、糖浆剂、合剂、煎膏剂或浸膏剂或其他药学上可接受的载体。